Imagem crônica de rato Visual Cortex usando uma preparação diluída crânio-

Neste material de vídeo e suplementar, vamos mostrar um protocolo para a crônica

As espinhas dendríticas são saliências da membrana do dendrito de um neurônio que recebem informações sinápticas. O alongamento, encolhimento ou desaparecimento das espinhas ocorre em resposta a mudanças na função da rede neural que resultam de padrões específicos de atividade neural. Esse fenômeno é conhecido como plasticidade cortical para observar mudanças morfológicas nas espinhas dendríticas.

Em animais vivos, uma placa de imagem é afixada no crânio de um camundongo. Uma área do crânio é afinada cirurgicamente e as imagens são necessárias em baixa e alta ampliação. As áreas são então recriadas em momentos posteriores.

Os resultados obtidos mostram que a morfologia da coluna dendrítica pode ser claramente visualizada usando uma preparação fina do crânio em vários pontos de tempo. E essa morfologia da coluna vertebral é altamente plástica, mostrando mudanças na estrutura e também o aparecimento e desaparecimento das espinhas dendríticas. Olá, sou Emily Kelly no laboratório de Anaya Maka no Departamento de Neurobiologia e Anatomia da Universidade de Rochester.

Hoje mostraremos o procedimento para imagens crônicas do córtex do frasco de camundongo após uma barbatana chamada preparação. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a renovação da coluna dendrítica. Então vamos começar.

Comece o procedimento esterilizando as ferramentas para cirurgia asséptica. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho usando etanol 70% e cubra a superfície operacional com curativo limpo. Monitore a profundidade da anestesia em um camundongo anestesiado com coquetel de fentanil testando sua resposta a uma pitada do dedo do pé, o camundongo mostrado aqui é um camundongo transgênico AGE FPM no qual a GFP é expressa.

Na camada cinco, células parametálicas que projetam processos dendríticos em camadas superficiais. Para manter uma temperatura corporal de 37,5 graus Celsius, coloque o animal em um cobertor de aquecimento e monitore-o com um termômetro retal acoplado. Em seguida, aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar que sequem usando uma tesoura.

Remova o cabelo da parte de trás da cabeça do rato, de trás das orelhas até os olhos. Em seguida, limpe o topo da cabeça do animal com uma aplicação de etanol a 70%, seguido de esfoliante Betadine e solução de Betadine. Faça uma incisão na LCU atrás das orelhas e ao longo do lado direito ou esquerdo da linha média, dependendo de qual hemisfério será visualizado para os olhos, dobre a pele sobre e para longe do local da cirurgia.

Não remova a pele, pois ela será suturada posteriormente com pinças finas. Puxe suavemente a pele para cima e para longe da área de interesse. Usando uma pinça limpa, raspe suavemente o periósteo da área exposta do crânio.

Aplique uma pequena quantidade de cloreto a 10% no crânio para secar completamente a membrana do periósteo e certifique-se de que ela foi removida completamente. É importante que o crânio esteja completamente seco. Para garantir a aderência adequada da cola, raspe suavemente a membrana de periósteo seca com uma lâmina microcirúrgica.

Em seguida, aplique uma fina camada de cola acrílica Sano ao redor da janela de imagem da placa da cabeça de aço inoxidável e fixe a placa no crânio. Com a ponta de madeira de um cotonete, aplique cola nas costuras internas da janela de imagem, certificando-se de preencher todas as lacunas entre a placa de imagem e a curvatura do crânio. Coloque uma gota do acelerador de cola na janela.

Em seguida, limpe rapidamente o excesso. Deixe a cola secar assim que a cola secar completamente. Usando uma broca odontológica afixada com uma broca de aço inoxidável de 0,7 milímetro, comece a afinar o crânio na janela de imagem.

Perfuração alternada com aplicação ocasional de solução salina estéril a 0,9%. Para evitar gerar muito calor no crânio. Dilua uma janela de quatro por quatro milímetros no crânio usando pequenos traços na superfície do crânio.

Com a broca odontológica. Teste a magreza do crânio com pinças de extremidade romba. A superfície do crânio recuará ligeiramente com uma leve pressão.

A espessura ideal do crânio para imagens é entre 10 e 30 mícrons. Depois que o crânio estiver afinado, limpe a janela de todos os detritos e coloque solução salina no crânio. Fotografe a janela de imagem com uma câmera digital montada em um escopo de dissecação.

A vasculatura cerebral nesta fotografia ajudará a localizar a posição para colocar a placa de imagem para sessões de imagem subsequentes. Transporte o animal para a plataforma de dois fótons. O animal deve permanecer no cobertor de aquecimento e a temperatura corporal deve ser monitorada continuamente durante toda a sessão de imagem.

Um microscópio de dois fótons com um laser mi tai. Uma bomba de estado sólido de 10 watts para potência máxima e uma unidade confocal de visualização de fluxo Olympus modificada são usadas. O sistema é otimizado para imagens de tecidos profundos e detectores externos são instalados o mais próximo possível da objetiva para permitir a detecção máxima de fluorescência do cérebro, adicionar uma gota de solução salina à janela de imagem usando zoom digital baixo.

Identifique uma área contendo neurônios brilhantemente marcados usando uma câmera digital fixada ao microscópio. Ips, tire uma fotografia da área de imagem. Isso é necessário para retornar ao mesmo local de imagem em um ponto de tempo subsequente.

Obtenha uma pilha de baixa ampliação em toda a extensão visível do cérebro, mostrando a extensão da ramificação dendrítica. Isso será usado para localizar a área de imagem em pontos de tempo subsequentes como vasos sanguíneos e dendritos. Manter sua estrutura em animais jovens e adultos usando software de imagem.

Aumente a ampliação digital em oito vezes, ajuste as coordenadas XY, se necessário, e colete uma pilha de alta ampliação, que mostrará a morfologia dendrítica detalhada, incluindo as localizações e a estrutura das espinhas dendríticas. Faça anotações detalhadas sobre cada coleção de pilha, incluindo coordenadas panorâmicas, o intervalo de coleta, o tamanho da etapa Z e o número de etapas na pilha. Essas notas serão usadas ao retornar a este dendro ou axônio em um ponto de tempo subsequente.

Após a imagem, remova a placa da cabeça separando-a suavemente da superfície do crânio. Usando fórceps. Remova qualquer resíduo de cola e limpe o crânio com solução salina estéril a 0,9%.

Suture a pele sobre o crânio usando o fio de sutura número seis. Limpe a área com etanol a 70% após o procedimento de imagem. Coloque o animal em uma gaiola limpa sob uma lâmpada de calor até que ele acorde e seja móvel.

Em seguida, retorne o animal à sua gaiola original para obter a imagem do animal novamente em um momento posterior, de dois dias a muitos meses depois, remova os pontos e reabra a pele da cabeça. Usando métodos assépticos, use a imagem digital da vasculatura cerebral tirada durante a primeira cirurgia para localizar o local original da imagem. Em seguida, fixe novamente a placa da cabeça como antes.

Use uma lâmina microcirúrgica para afinar suavemente qualquer osso que possa ter crescido novamente entre os pontos de tempo de imagem, se necessário. Dilua com uma broca odontológica, limpe a janela de imagem de detritos e aplique uma gota de solução salina estéril a 0,9%. Leve o animal a um microscópio de dois fótons e localize a área de imagem original usando a imagem fluorescente digital tirada durante a sessão anterior.

Inicie o programa de exibição de fluxo. Abra a imagem original de baixa ampliação, cole uma folha de transparência na tela do computador e esboce o padrão dos vasos sanguíneos principais usando uma caneta de transparência. Em seguida, abra a imagem ao vivo e realinhe a vasculatura sanguínea ao padrão esboçado no filme de transparência.

Remova a transparência para recriar a imagem das estruturas ampliadas de oito x. Abra a pilha coletada desejada da sessão de imagem anterior. Esboce a estrutura em um filme de transparência afixado na tela do computador.

Aumente o zoom oito vezes a partir da imagem ao vivo e alinhe a imagem com a transparência. Dependendo da precisão do alinhamento do local de baixa ampliação, pode ser necessário também ajustar ligeiramente o ângulo da imagem, definir as coordenadas panorâmicas para os parâmetros de imagem do primeiro dia, incluindo o tamanho da etapa e o número de imagens coletadas, a recriação de imagens Zack pode ser realizada duas vezes. O número de vezes que o couro cabeludo é aberto deve ser limitado para evitar a interrupção da integridade do crânio, o que resultará em baixa resolução de imagem em camundongos que expressam GFPM.

Um subconjunto de células parametálicas da camada cinco e processos dendríticos correspondentes foram visualizados usando microscopia de varredura a laser de dois fótons in vivo aqui, os dendritos do córtex visual marcados com GFP são mostrados. Esta imagem é uma projeção de uma única imagem obtida a cada cinco mícrons do PIA até uma profundidade final de 175 mícrons. A região em caixa é mostrada com maior ampliação aqui no dia zero, e novamente no quarto dia aqui, maior ampliação de uma imagem de ramo dendrítico do dia zero e do quarto dia comparada.

Essas imagens demonstram espinhos estáveis indicados pelas pontas de seta brancas, espinhos retráteis perdidos, que são marcados por ponta de seta vermelha e novos espinhos indicados pela ponta de seta verde. Acabamos de mostrar como realizar imagens crônicas de dois fótons no córtex visual de camundongos usando uma preparação de crânio fino. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de tomar cuidado especial durante o processo de afinamento para evitar danos ao crânio e à dura-máter subjacente, pois isso resultará em baixa resolução de imagem e faça anotações detalhadas.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.