Name: Imagem crônica de rato Visual Cortex usando uma preparação diluída crânio- (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprenda a realizar imagem crônica do córtex visual de camundongos usando preparação de crânio diluído. Este método permite observar dinâmica de espinhas dendríticas in vivo para estudar plasticidade cortical.

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Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Burroughs Prémio Carreira em Ciências Biomédicas (AKM), The Whitehall Research Foundation Grant (AKM), Sloan Foundation Fellowship (AKM), NIH EY019277 (AKM), e um NEI financiado, treinamento de visão Grant, EY013319 ( EAK).

<ol><li> Para visualizar os neurônios no cérebro intacto utilizando dois fótons de microscopia, uma preparação, onde os neurônios são marcados com marcadores fluorescentes é utilizado. Nos experimentos apresentados aqui usamos o GFP-M linha camundongo transgênico que rotula camada 5 células piramidais 1. Camada 5 células piramidais projeto processos dendríticos em camadas superficial, permitindo a visualização dos dendritos e espinhas dendríticas até uma profundidade de 300 mm abaixo do nível da pia. Uma abordagem alternativa é a células etiqueta usando marcadores virais (ver Lowery et al., Submetidos a JOVE). </li><li> Esterilizar o espaço de trabalho usando etanol 70% e as ferramentas de autoclave para a cirurgia asséptica. Cobrir operacional superfície com curativo limpo. </li><li> Anestesiar ratos com um cocktail (fentanil 0,05 mg / kg; midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg) Fentanyl seguida de uma dose trimestre de Avertin (0,0075 mg / ml) usando IACUC procedimentos aprovados. Pré-tratamento camundongos com o analgésico, a buprenorfina (0,5 mg / kg) administrado por via subcutânea (SQ). Monitorar o nível de plano anestésico por reação de teste à cauda / tep pinch. </li><li> Manter animais em 37,5 ° C utilizando manta de aquecimento com termômetro retal em anexo. </li><li> Aplicar pomada oftálmica nos olhos para evitar que os olhos sequem. Olhos capa com pequena folha de papel para proteger os olhos da fonte de luz durante a cirurgia. </li><li> Com uma tesoura, remover os pêlos da parte de trás da cabeça (atrás das orelhas) para os olhos. </li><li> Limpe a parte superior da cabeça do animal com a aplicação seqüencial de álcool 70%, seguido pelo matagal betadine e solução de betadine. </li><li> Faça uma incisão L cut-atrás das orelhas e ao longo de cada lado a direita ou esquerda da linha média (dependendo de qual hemisfério será fotografado) para os olhos. Dobre a pele durante e fora do local da cirurgia. Não retire a pele como a pele será suturada após a sessão de imagens. </li><li> Utilizando uma pinça fina puxe a pele para cima e longe de sua área de interesse. </li><li> Delicadamente raspar o periósteo da área exposta do crânio com uma pinça limpa ou lâmina de microcirurgia. Usando cotonete, aplique uma pequena quantidade de 10% de cloreto férrico ao crânio para secar completamente a membrana periósteo e garantir que ele tenha sido completamente removido. É importante que o crânio está completamente seca para garantir aderência adequada da cola (ver 11). Utilizando uma pinça ou lâmina de microcirurgia, delicadamente raspar membrana periósteo secas. </li><li> Aplicar uma fina camada de cola de cianoacrilato em torno da janela de imagem da placa de aço inoxidável cabeça (ver Figura 1) e apor a placa para o crânio. </li><li> Usando o final de uma vara de madeira de algodão do cotonete, aplique cola para costuras dentro da janela de imagem; certificando-se de preencher todas as lacunas entre a placa de imagem e curvatura do crânio. </li><li> Coloque uma gota de cola acelerador para a janela. Rapidamente enxugará acelerador excesso de cola com um cotonete ou kim wipe. A cola deve estar completamente solidificado antes da perfuração. </li><li> Começam a diluir o crânio na janela de imagem usando uma broca de dentista afixada com um 0,7 milímetros de aço inoxidável da rebarba. Perfuração alternam com aplicação ocasional de 0,9% estéril para evitar a geração de muito calor no crânio. </li><li> Fina uma janela de 4x4 mm no crânio usando pequenos acidentes vasculares cerebrais em toda a superfície do crânio com a broca de dentista. Testar a magreza do crânio, com fórceps fim brusco. A superfície do crânio vai travessão ligeiramente com uma leve pressão. A espessura do crânio ideal para geração de imagens é entre 10 e 30 mm. </li><li> Quando o crânio é fina e limpa a janela de todos os detritos, coloque soro fisiológico no crânio. Fotografia da janela de imagem com uma câmera digital acoplada a um escopo de dissecação. Fotografia e uso da vasculatura cerebral irá ajudar na localização da posição de colocar a placa de imagem para as sessões de imagem subseqüentes. </li><li> Transportar o animal para a plataforma 2-fótons. O animal deve permanecer sobre o cobertor de aquecimento (com sonda retal) durante a sessão de imagens completo. Nota: enquanto estiver sob sedação, a temperatura corporal do animal núcleo irá variar enormemente na ausência de uma unidade de aquecimento, resultando em danos cortical ou possivelmente a morte. </li><li> Um microscópio de dois fótons com um Tai Mai laser, uma bomba de estado sólido para 10W de potência máxima e um modificado Olympus FluoView unidade confocal é usado. O sistema é otimizado para imagens de tecidos profundos e detectores externos estão instalados o mais próximo do objetivo possível para permitir a detecção de fluorescência máxima a partir do cérebro. Uma Olympus LUMPlan fl / IR lente objetiva 20X/0.95NA é usado. Salina 0,9% é usado durante o exame para submersão objetivo. </li><li> Usando este microscópio, e zoom digital de baixo (x1) identificar uma área que contém neurônios brilhantemente rotulados. </li><li> Usando uma câmera digital aposta no ocular do microscópio, tirar uma fotografia da área de imagem. Alternativamente, esboçar o padrão de vascularização sanguínea. Isso é necessário para rese voltam para a localização de imagens mesmo em um ponto posteriormente. </li><li> Obter uma pilha de baixa ampliação (x20 objetivo, pixel 512x512; 5 passos mm) através de toda a extensão visível do cérebro (geralmente medindo ~ 200 mm) que mostram a extensão de ramificação dendrítica. Nota: esta imagem baixa ampliação será usado para localizar a área de imagem em momentos subseqüentes como vasos de sangue e dendritos manter sua estrutura em animais jovens e adultos. </li><li> Usando o software de imagem (FluoView, v. 5.0, FV300), aumento ampliação digital de 8 vezes. Ajustar as coordenadas X, Y (pan coordenadas) se necessário e recolher uma pilha alta ampliação que irá mostrar morfologia dendrítica detalhadas, incluindo a localização e estrutura das espinhas dendríticas. Tomar notas detalhadas sobre cada coleção pilha, ou seja, pan coordenadas, o intervalo de coleta, o tamanho z-passo e o número de passos na sua pilha. Essas notas serão utilizados quando voltar a este dendrite ou axônio em um ponto posteriormente. </li><li> Seguinte imagem, retire a placa de cabeça suavemente separando placa da superfície do crânio. Utilizando uma pinça, remova qualquer cola residual restante no crânio e limpe a superfície do crânio, com 0,9% salina estéril. Sutura da pele sobre o crânio em conjunto, utilizando fio de sutura # 6. Limpe área com álcool 70%. Para aliviar a dor durante a recuperação pós-operatória, administrar 0,1 analgésico Buprenorfina mg / kg, SQ. </li><li> Coloque animal em gaiola limpa sob uma lâmpada de calor até que acorda e é móvel. Retorno animal para gaiola original. </li><li> Para recriar animais em um ponto mais tarde (tempo os nossos pontos de imagem pode estar em qualquer lugar de 2 dias a muitos meses de intervalo), remover pontos ou reabrir a pele na cabeça, usando métodos de assepsia como descrito acima. Use a imagem digital do cérebro vascular (tomadas na data da primeira cirurgia) para localizar o local de imagem original. Reafixar aço inoxidável headplate (passos 10-12). Use uma lâmina fina de microcirurgia para suavemente afastado qualquer osso que poderia ter re-grown entre os pontos de tempo de imagem. Se necessário, magro, com broca de dentista. Janela de imagem livre de detritos e aplicar uma queda de 0,9% salina estéril. </li><li> Transportar animais para microscópio de dois fotões e localizar campo de imagem original. Use a fotografia digitais tiradas durante a sessão primeira imagem para obter assistência. </li><li> Abra o programa FluoView e abrir a imagem ampliação original baixa. Juntar uma folha de transparência para a tela do computador e esboçar o padrão navio grande de sangue usando uma caneta de transparência. </li><li> Abra a imagem ao vivo e realinhar a vasculatura de sangue para o padrão esboçado no filme transparência. </li><li> A nova imagem do zoom 8x em estruturas, abrir a pilha desejada coletados a partir da sessão de imagem anterior. Esboço da estrutura (ie axonal, dendríticas, glial) em um filme de transparência, aposta no ecrã do computador. </li><li> Zoom em 8x da imagem ao vivo e definir o pan coordenadas para os parâmetros de imagem primeiro dia. Dependendo da precisão de alinhar a localização de baixa ampliação, pode ser necessário também ajustar o ângulo da imagem ligeiramente. Uma vez que a estrutura desejada, igualar-se a estrutura para o seu padrão de ampliação esboçou alta. Recolher o z-stack com o tamanho do passo idêntico e número de z-stack imagens para análise posterior. </li><li> Repita os passos 29 e 30 até todas as imagens de alta ampliação são recolhidas. </li><li> Quando imagem é completo, repita os passos 22-24. Re-imagem pode ser repetido em até 2 pontos no tempo separados. </li><li> Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Divisão de Biotério e Laboratório de Medicina Animal da Universidade de Rochester Faculdade de Medicina e Odontologia, na acreditação plena pela Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care, internacional (AAALAC) e estão em conformidade com a lei estadual, lei federal e da política NIH. </li></ol> Resultados representante Em GFP-M camundongos expressando, um subconjunto de células piramidais da camada 5 e correspondentes processos dendríticos podem ser facilmente visualizadas usando dois-fotão microscopia de varredura a laser (2PLSM) 1. Aqui nós demonstramos uma preparação diluída crânio-em que o crânio sobre a localização de imagem desejada é diluído em ~ 1-30 mM. Realizado corretamente, o nosso protocolo permitiu visualizar claramente dendritos corticais e espinhas no córtex intacto visual para análise aguda ou crônica (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Cabeça personalizado e placa de base. (A) Vista de cima da cabeça feitos sob encomenda e placa de base utilizado para desbaste crânio-preparação da cirurgia. (B) Vista lateral do feito por cabeça e placa de base. (C, D) esquemático detalhado e imagem da placa de cabeça. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> in vivo no córtex visual de um rato GFP-M transgênicos utilizando dois fótons de microscopia. Imagem é uma projecção de imagem única obtidas a cada 5 mM da pia a uma profundidade final de 175 mM. A área de box em A representa a região ampliada em (B) e (C) com imagens no dia 0 (D0) e quatro dias depois (D4). (D, E) Maior aumento do ramo dendríticas encaixotado em B e C demonstrando espinhas estável (cabeças de seta branca), perdeu as espinhas / retracção (cabeças de seta vermelha) e espinhas novo (cabeças de seta verde). Barra de escala = 200 mM A., B, C. 20 M, D, E. 5 mm.

<ol><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Imagem crônica utilizando dois fótons de microscopia está se tornando uma técnica cada vez mais popular para estudar alterações morfológicas desencadeadas durante 2-5 plasticidade. Aqui nós demonstramos uma preparação diluída crânio-a seguir identificados espinhas dendríticas no cérebro do rato intacta nos dias de imagens diferentes. Neste protocolo, o crânio é deixada intacta, causando danos mínimos para o córtex, resultando em níveis muito baixos de neuroinflamação que podem alterar a função cerebral 6...

<table><tbody><tr><td>Citrato de Fentanil</td><td></td><td>Em Casa</td><td></td><td>Cocktail de Fentanil: Cocktail Anestésico&lt;br/&gt;Dose IP: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentração final do coquetel: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Cloridrato de medetomidina</td><td></td><td>Em Casa</td><td></td><td>Coquetel de Fentanil: Coquetel Anestésico&lt;br/&gt;Dose IP: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentração final do coquetel: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Midazolam HCl</td><td></td><td>Em Casa</td><td></td><td>Coquetel de Fentanil: Coquetel Anestésico&lt;br/&gt;Dose IP: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentração final do coquetel: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>2,2,2-tribromo&amp;#8211;etanol </td><td></td><td></td><td></td><td>Coquetel Avertin: Anestésico;&lt;br/&gt;Dose IP: 0,0075 cc/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Conc. final do coquetel: 1%</td></tr><tr><td>2-metil-2-butanol (Concentração final: 0,775%)</td><td></td><td></td><td></td><td>Coquetel Avertin: Anestésico;&lt;br/&gt;Dose IP: 0,0075 cc/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Conc. final do coquetel: 0,775%</td></tr><tr><td>Sistema de Controle de Temperatura TC-1000 para Camundongos</td><td></td><td>CWE, Inc.</td><td>TC-1000 Rato</td><td>Regulação da Temperatura Corporal</td></tr><tr><td>Toberadex</td><td></td><td>Em Casa</td><td></td><td>Pomada Oftálmica</td></tr><tr><td>Cloreto férrico a 10%</td><td></td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td>Preparação de crânio fino</td></tr><tr><td>Lâmina microcirúrgica</td><td></td><td>Sable Industries</td><td>S-6400</td><td>Preparação de crânio fino</td></tr><tr><td>Cianoacrilato 404,401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 46551</td><td>Preparação de crânio fino</td></tr><tr><td>Cianoacrilato 401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 40140</td><td>Preparação de crânio fino</td></tr><tr><td>Zip Kicker Glue Accelerator</td><td></td><td>Pacer Technology</td><td>PT-29</td><td>Preparação de crânio fino</td></tr><tr><td>Micro brocas de aço para fresas, diâmetro da ponta de 0,7 mm</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td>Preparação de crânio fino</td></tr><tr><td>Microtorque Control Box e Ponteira Tech2000</td><td></td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000LIGAR/DESLIGAR</td><td>Preparação de crânio fino</td></tr><tr><td>#6-0 (0,7 métrico) sutura de seda</td><td></td><td>Ethicon Inc.</td><td>K8894H</td><td>Taper C-1</td></tr><tr><td>Pinça para Curativo Ocular, 10 cm, largura da ponta 0,5 mm, curva</td><td>Ferramentas Cirúrgicas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Extrafina Bonn, 8,5 cm, ponta reta, borda de corte de 13 mm</td><td>Ferramentas Cirúrgicas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Padrão, reta, ponta 2,5 mm x 1,35 mm, 12 cm</td><td>Ferramentas Cirúrgicas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem crônica de rato visual cortex usando uma preparação diluída crânio-

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo de imagens utilizando dois fótons microscopia de varredura a laser (2PLSM) permite o estudo de células vivas e processos neuronais no cérebro intacto. A técnica apresentada aqui permite que a imagem da mesma área do cérebro em momentos diversos (imagem crônica) com resolução microscópica permitindo o rastreamento de espinhas dendríticas, que são as pequenas estruturas que representam a maioria dos pós-sináptica excitatória locais no sistema nervoso central. A capacidade de resolver claramente multa estruturas cortical sobre vários intervalos de tempo tem muitas vantagens, especificamente no estudo da plasticidade do cérebro em que as alterações morfológicas nas sinapses e remodelação do circuito pode ajudar a explicar os mecanismos subjacentes. Neste material de vídeo e suplementares, mostramos um protocolo para a crônica in vivo de imagens do cérebro intacto utilizando uma preparação diluída crânio. A preparação diluída crânio-se de uma abordagem minimamente invasiva, o que evita possíveis danos à dura e / ou córtex, reduzindo assim o aparecimento de uma resposta inflamatória. Quando este protocolo é realizado corretamente, é possível monitorar claramente mudanças nas características espinha dendrítica no cérebro intacto por um período prolongado de tempo.

Neste material de vídeo e suplementar, vamos mostrar um protocolo para a crônica<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem do cérebro intacto utilizando uma preparação diluída crânio.

Imagem crônica de rato Visual Cortex usando uma preparação diluída crânio-

A imagem in vivo utilizando microscopia de varredura a laser de dois fótons (2PLSM) permite o estudo de células vivas e processos neuronais no cérebro intacto. O ...

As espinhas dendríticas são protrusões da membrana do dendrito de um neurônio que recebem entrada sináptica. O alongamento, encolhimento, aparência ou desaparecimento das espinhas ocorre em resposta a mudanças na função da rede neural resultantes de padrões específicos de atividade neural. Esse fenômeno é conhecido como plasticidade cortical para observar alterações morfológicas nas espinhas dendríticas.Em animais vivos, uma placa de imagem é fixada ao crânio de um camundongo. Uma área do crânio é cirurgicamente afinada e são obtidas imagens em baixa e alta ampliação. As áreas são então reimagem em pontos temporais posteriores.Os resultados obtidos mostram que a morfologia dos espinhos dendríticos pode ser claramente visualizada usando uma preparação de crânio fino em múltiplos pontos temporais. E que a morfologia dos espinhos é altamente plástica, apresentando mudanças na estrutura, bem como o aparecimento e desaparecimento de espinhos dendríticos. Olá, sou Emily Kelly no laboratório de Anaya Maka, do Departamento de Neurobiologia e Anatomia da Universidade de Rochester.Hoje vamos mostrar o procedimento para a imagem crônica do córtex vial de camundongo após uma preparação chamada fins. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a renovação das espinhas dendríticas. Então, vamos começar.Inicie o procedimento esterilizando os instrumentos para cirurgia asséptica. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho usando etanol 70% e cubra a superfície operatória com curativo limpo. Monitore a profundidade da anestesia em um camundongo anestesiado com coquetel de fentanil testando sua resposta a um aperto no dedo do pé; o camundongo mostrado aqui é um camundongo transgênico A-G-F-P-M no qual a GFP é expressa.Nas células parametais da camada cinco que projetam processos dendríticos para as camadas superficiais. Para manter uma temperatura corporal de 37,5 graus Celsius, coloque o animal sobre uma manta aquecida e monitore-o com um termômetro retal acoplado. Em seguida, aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar que sequem, utilizando uma tesoura.Remova os pelos da parte de trás da cabeça do camundongo, da região atrás das orelhas até os olhos. Em seguida, limpe a parte superior da cabeça do animal com uma aplicação de etanol 70%, seguida de esfregaço com Betadine e solução de Betadine. Faça uma incisão em forma de LCU atrás das orelhas e ao longo do lado direito ou esquerdo da linha média, dependendo do hemisfério que será analisado até os olhos, e dobre a pele para longe do local cirúrgico.Não remova a pele, pois ela será suturada posteriormente usando pin&ccedil;as finas. Puxe suavemente a pele para cima e para longe da &aacute;rea de interesse. Usando pin&ccedil;as limpas, raspe suavemente o pericr&acirc;nio da &aacute;rea exposta do cr&acirc;nio.Aplique uma pequena quantidade de cloreto férrico a 10% sobre o crânio para secar completamente a membrana do periósteo e garantir sua remoção total. É importante que o crânio esteja completamente seco. Para assegurar uma boa aderência da cola, remova suavemente o periósteo seco com uma lâmina microcirúrgica.Em seguida, aplique uma fina camada de cola acrílica Sano ao redor da janela de imagem da placa craniana de aço inoxidável e fixe a placa ao crânio. Com a extremidade de madeira de um cotonete, aplique cola nas juntas internas da janela de imagem, certificando-se de preencher todas as lacunas entre a placa de imagem e a curvatura do crânio. Coloque uma gota do acelerador de cola dentro da janela.Em seguida, remova rapidamente o excesso. Deixe a cola secar completamente. Usando uma broca dentária acoplada a uma fresa de aço inoxidável de 0,7 milímetro, comece a afinar o crânio na janela de imagem.Realize perfurações alternadas com aplicações ocasionais de solução salina estéril a 0,9%. Para evitar gerar excesso de calor no crânio. Afinar uma janela de quatro por quatro milímetros no crânio utilizando pequenos movimentos sobre a superfície óssea.Com a broca dentária. Teste a finura do crânio com pinça de ponta romba. A superfície do crânio apresentará uma leve depressão com pressão suave.A espessura óssea ideal para imagem varia entre 10 e 30 micrômetros. Após afinar o crânio, limpe a janela de todos os detritos e coloque solução salina sobre o crânio. Fotografe a janela de imagem com uma câmera digital acoplada a um microscópio estereoscópico.A vascularização cerebral nesta fotografia ajudará a localizar a posição para colocar a placa de imagem em sessões subsequentes. Transporte o animal para o equipamento de microscopia de dois fótons. O animal deve permanecer sobre a manta aquecida e a temperatura corporal deve ser monitorada continuamente durante toda a sessão de imagem.Um microscópio de dois fótons com um laser mi tai. Utiliza-se uma bomba estado-sólido de 10 watts para potência máxima e uma unidade confocal Olympus Flow View modificada. O sistema é otimizado para imageamento de tecidos profundos e detectores externos são instalados o mais próximo possível do objetivo para permitir a detecção máxima da fluorescência proveniente do cérebro; adicione uma gota de solução salina à janela de imageamento usando zoom digital baixo.Identifique uma área contendo neurônios fortemente marcados utilizando uma câmera digital acoplada ao microscópio. Ips, tire uma fotografia da área de imagem. Isso é necessário para retornar ao mesmo local de imagem em um ponto temporal subsequente.Obtenha uma pilha de baixa ampliação em toda a extensão visível do cérebro, mostrando o grau de ramificação dendrítica. Isso será usado para localizar a área de imagem em pontos temporais subsequentes, tanto em vasos sanguíneos quanto em dendritos. Mantenha sua estrutura em animais jovens e adultos utilizando software de imagem.Aumente a ampliação digital oito vezes, ajuste as coordenadas XY se necessário e colete uma pilha de alta ampliação, que mostrará a morfologia dendrítica detalhada, incluindo as localizações e estrutura das espinhas dendríticas. Faça anotações detalhadas sobre cada coleta de pilha, incluindo as coordenadas do panorâmico, a faixa de coleta, o tamanho do passo Z e o número de passos na pilha. Essas anotações serão usadas ao retornar a este dendrito ou axônio em um momento posterior.Após a aquisição de imagens, remova a placa craniana separando-a suavemente da superfície do crânio. Usando pinça, remova qualquer resíduo de cola e limpe o crânio com solução salina estéril a 0,9%.Suture a pele sobre o crânio utilizando fio de sutura número seis. Limpe a área com etanol 70% após o procedimento de imagem. Coloque o animal em uma gaiola limpa sob uma lâmpada de aquecimento até que desperte e esteja móvel.Em seguida, devolva o animal à sua gaiola original para imagiar o animal novamente em um ponto temporal posterior, entre dois dias e vários meses depois, remova os pontos e reabra a pele na cabeça. Usando métodos assépticos, utilize a imagem digital da vasculatura cerebral obtida durante a primeira cirurgia para localizar o local original de imagiologia. Em seguida, fixe novamente a placa craniana como anteriormente.Use uma lâmina microcirúrgica para remover suavemente qualquer osso que possa ter regenerado entre os pontos temporais de imagem, se necessário. Afine com uma broca dentária, limpe a janela de imagem de detritos e aplique uma gota de solução salina estéril a 0,9%. Transporte o animal para um microscópio de dois fótons e localize a área original de imagem usando a imagem fluorescente digital obtida durante a sessão anterior.Inicie o programa de visualização de fluxo. Abra a imagem original de baixa ampliação, fixe uma folha de transparência na tela do computador e esboce o padrão principal dos vasos sanguíneos usando uma caneta para transparência. Em seguida, abra a imagem em tempo real e realinhe a vasculatura sanguínea ao padrão esboçado na película de transparência.Remova a transparência para reimaginar as estruturas ampliadas oito vezes. Abra a pilha desejada coletada na sessão de imagem anterior. Desenhe a estrutura sobre um filme de transparência fixado na tela do computador.Aumente o zoom oito vezes a partir da imagem em tempo real e alinhe a imagem com a transparência. Dependendo da precisão do alinhamento na baixa magnificação, pode ser necessário ajustar ligeiramente o ângulo da imagem, definindo as coordenadas de panorâmica para os parâmetros de imagem do primeiro dia, incluindo o tamanho do passo e o número de imagens coletadas. A reimagem Zack pode ser realizada duas vezes. O número de vezes que o couro cabeludo é aberto deve ser limitado para evitar comprometer a integridade do crânio, o que resultaria em baixa resolução de imagem em camundongos que expressam GFP.Um subconjunto de células parametais da camada cinco e os respectivos processos dendríticos foi visualizado utilizando microscopia de varredura a laser de dois fótons in vivo aqui; dendritos do córtex visual marcados com GFP são mostrados. Esta imagem é uma projeção de uma única imagem obtida a cada cinco micrômetros da PIA até uma profundidade final de 175 micrômetros. A região destacada em caixa é mostrada em maior ampliação aqui no dia zero e novamente no dia quatro; aqui, ampliações maiores de imagens de um ramo dendrítico dos dias zero e quatro são comparadas.Essas imagens demonstram espinhos estáveis indicados pelas cabeças de seta brancas, espinhos retráteis perdidos, marcados pela cabeça de seta vermelha, e novos espinhos indicados pela cabeça de seta verde. Acabamos de mostrar como realizar a imagem crônica por dois fótons no córtex visual de camundongos utilizando uma preparação de crânio fino. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter cuidado especial durante o processo de adelgaçamento para evitar danos ao crânio e à dura-máter subjacente, pois isso resultará em baixa resolução de imagem, além de tomar notas detalhadas.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

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Nós apresentar um método para formar uma janela de imagem no crânio do rato que se estende por milímetro e é estável durante meses sem inflamação do cérebro. Este método é bem adequado para estudos longitudinais de fluxo de sangue, a dinâmica celular, e as células / estrutura vascular utilizando dois fotões microscopia.

A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

Ao combinar um polido e reforçado crânio-fino (portas) craniana janela e injeção de células do glioblastoma (GBM), podemos observar glioma iniciação e crescimento de células GBM injetadas no cérebro de um rato vivo longitudinalmente.

Imagem Glioma Iniciação<em&gt; Em Vivo</em&gt; Através de um polido e reforçado Janela crânio-Thin craniana

Apresenta-se um método de criação de uma janela diluído crânio-cortical (TSCW) em um modelo de rato...

Diluído crânio-técnica de janela cortical para<em&gt; Em Vivo</em&gt; Tomografia de coerência óptica

A imagem de lapso de tempo no animal vivo fornece informações valiosas sobre a reorganização estrutural no cérebro intacto. Aqui, apresentamos uma preparação de crânio afinado que permite imagens transcranianas de estruturas sinápticas marcadas com fluorescência no córtex de camundongo vivo por microscopia de dois fótons.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

Trauma cerebral aguda é uma lesão grave que não tem tratamento adequado à data. Microscopia Multiphoton permite estudar longitudinalmente o processo de desenvolvimento agudo trauma cerebral e sondagem estratégias terapêuticas em roedores. Dois modelos de trauma cerebral aguda estudou com in vivo de dois fótons de imagem de cérebro são demonstrados neste protocolo.

Aguda Cérebro Trauma em camundongos seguiu por Longitudinal dois fótons de imagem

Este manuscrito descreve um procedimento para controlar a remodelação do cerebrovasculature durante amyloid acúmulo de placa in vivo utilizando microscopia de dois fótons longitudinal. Uma preparação crânio-diluídos permite a visualização de corantes fluorescentes para avaliar a progressão do dano vascular cerebral num modelo de rato da doença de Alzheimer.

Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagens do Cerebrovasculature: Relevância para doenças do SNC

Este protocolo descreve uma técnica crônica de implantação de janelas cranianas que pode ser usada para imagens longitudinais de estruturas neuro-glio-vasculares, interações e função em condições saudáveis e doentes. Serve como uma alternativa complementar à abordagem de imagem transcranária que, embora muitas vezes preferida, possui algumas limitações críticas.

Mapeamento cerebral preciso para realizar imagens repetitivas in vivo da dinâmica neuro-imune em camundongos

Apresentado aqui é um protocolo para a implantação de uma janela craniana crônica para a imagem longitudinal de células cerebrais em camundongos acordados e com a cabeça.

Implantação de uma janela craniana para imagem repetida em vivo em ratos acordados

Aprenda a realizar imagem crônica do córtex visual de camundongos usando preparação de crânio diluído. Este método permite observar dinâmica de espinhas dendríticas in vivo para estudar plasticidade cortical.

Imagem crônica de rato Visual Cortex usando uma preparação diluída crânio-

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