Two-Photon In vivo Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

O objetivo geral deste procedimento é permitir imagens transcranianas, estruturas sinápticas marcadas com fluorescência no córtex de camundongos vivos por microscopia de dois fótons. O primeiro passo após anestesiar o mouse é realizar uma preparação de crânio afinado. Em seguida, a cabeça do mouse é imobilizada usando uma placa de retenção personalizada.

Em seguida, as pilhas de imagens são adquiridas através do crânio afinado usando microscopia de dois fótons. Em última análise, realocação e imagem. A região fotografada anteriormente permitiu que a dinâmica das espinhas dendríticas fosse rastreada em diferentes períodos de tempo sob várias condições.

Para se preparar para a cirurgia, anestesie um camundongo com cetamina e xilazina e faça uma pinça no dedo do pé para garantir a anestesia completa. Em seguida, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento e use uma lâmina de barbear para raspar a cabeça. Limpe a pele com compressas de álcool alternadas para esterilizar a área depilada e remover quaisquer aparas de cabelo residuais.

Além disso, aplique suavemente pomada para os olhos em ambos os olhos. Em seguida, faça uma incisão reta ao longo da linha média do couro cabeludo e mova a pele lateralmente em direção às bordas do crânio. Em seguida, remova o tecido conjuntivo preso ao crânio para iniciar a preparação do crânio afinado.

Primeiro, identifique a região de imagem desejada com base em sua localização relativa à linha média e bgma. Em seguida, umedeça o crânio com solução salina para observar a vasculatura, de modo a evitar afinar o crânio em uma área com grandes vasos sanguíneos, pois eles bloqueiam a penetração da luz e borram as estruturas da imagem. Uma vez selecionada uma área de 0,5 a um milímetro de diâmetro, use uma microbroca de alta velocidade para afinar uma região circular do crânio.

Mova a broca paralelamente à superfície do crânio, em vez de segurá-la contra o crânio e pressioná-la para baixo para evitar danos causados por superaquecimento. Evite o contato prolongado entre a broca e a broca de crânio até que a camada óssea compacta externa e a camada óssea esponjosa intermediária sejam removidas. Em seguida, use uma lâmina microcirúrgica mantida a aproximadamente 45 graus para afinar a camada óssea compacta interna no centro da região afinada da broca.

Raspe o crânio sem pressionar contra o crânio até obter uma região uniformemente diluída de 200 a 300 micrômetros de diâmetro com uma espessura de aproximadamente 20 a 30 micrômetros. Assim que o crânio estiver suficientemente afinado, remova cuidadosamente os detritos ósseos. O próximo passo é prender a placa da cabeça, que é feita de lâminas de barbear com bordas afiadas cobertas por fitas.

Comece colocando uma pequena gota de cola de cianoacrilato em cada borda da abertura central da placa principal. Em seguida, centralize a placa da cabeça na região diluída. Segure-o firmemente contra o crânio.

Agora, puxe suavemente a pele dos lados do crânio até as bordas da abertura central da placa da cabeça. Segure a placa de cabeça no lugar por um a dois minutos. Em seguida, espere mais oito a nove minutos até que a placa da cabeça esteja bem presa ao crânio.

Após 10 minutos, coloque a placa de cabeça nos dois blocos laterais da placa de retenção. Em seguida, aperte os parafusos sobre as bordas da placa principal para imobilizar o mouse na placa de retenção. Olhe para a cabeça do rato através de um microscópio de dissecação enquanto acolchoa suavemente as costas do rato para ter certeza de que a cabeça está devidamente imobilizada.

Em seguida, enxágue o crânio exposto com solução salina para remover qualquer cola não polimerizada a fim de realocar a região fotografada anteriormente. Nas sessões de imagem subsequentes, tire uma foto da vasculatura da região afina do crânio exposto, que é designada mapa um. Em seguida, coloque o mouse sob o microscópio de imagem e localize a área diluída sob a objetiva de ar 10 x.

Usando epifluorescência, mova a área mais fina para o centro da exibição. Agora adicione uma gota de solução salina no topo do crânio e mude para a objetiva de 60 x. Selecione uma região onde os espinhos dendríticos individuais sejam claramente visualizados ao longo dos dendritos.

Identifique e rotule a região correspondente no mapa um, comparando a vasculatura entre a visão epifluorescente e a foto da vasculatura. Em seguida, ajuste o comprimento de onda do laser de dois fótons de acordo com os quatro fluorados. Em seguida, usando a objetiva de 60 x, adquira pilhas de imagens com etapas de dois micrômetros ao longo do eixo Z, cobrindo uma área de aproximadamente 200 micrômetros por 200 micrômetros.

Isso é designado como mapa dois e é usado para realocar o segmento dendrítico da imagem durante as sessões de imagem subsequentes. Agora adquira nove pilhas de imagens no mapa dois usando zoom digital de três x. Cada pilha de imagens cobre uma área aproximada de 70 micrômetros por 70 micrômetros com passos de 0,7 micrômetro ao longo do eixo Z.

Após a imagem, retire suavemente a placa da cabeça do crânio. Em seguida, use uma lâmina microcirúrgica para remover a cola restante do crânio. Em seguida, enxágue o crânio e a pele com soro fisiológico várias vezes e suture o couro cabeludo com suturas cirúrgicas estéreis.

Durante a recuperação, mantenha o animal em uma almofada de aquecimento em uma gaiola separada e administre o analgésico buprenorfina por via subcutânea para dor pós-operatória. Após a recuperação total, devolva o animal ao medidor doméstico Para refazer a imagem dos dendritos em outro dia, anestesiar o animal e expor o crânio. Como antes, repita a imobilização da cabeça montando a placa da cabeça e prendendo-a à placa de retenção.

Em seguida, localize a região visualizada anteriormente comparando o padrão de vasculatura para o mapa um e o padrão de ramificação dendrítica para o mapa dois. Se a recriação de imagens for realizada dentro de uma semana, a fina camada de osso recém-crescido pode ser removida com lâmina microcirúrgica. Se a recriação de imagens for realizada após mais de uma semana, use primeiro a microbroca e, em seguida, a lâmina microcirúrgica para afinar o crânio.

Agora ajuste a posição e a orientação sob o microscópio de dois fótons para obter pilhas de imagens que correspondam às pilhas de imagens tiradas anteriormente. Depois de adquirir as imagens, permita que o camundongo se recupere e devolva-o à sua gaiola como antes, e uma imagem do padrão vascular ao redor da área fina do crânio designada como mapa um é usada para referenciar todas as sessões de imagem subsequentes. A caixa preta indica a região onde duas imagens in vivo de fótons foram adquiridas.

Esta imagem de ramos dendríticos no córtex motor de um camundongo de um mês de idade é designada como mapa dois. A caixa branca mostra o segmento dendrítico selecionado para imagem. Com o tempo, duas imagens de fótons foram feitas do mesmo segmento dendrítico no dia zero, dia dois, dia quatro e dia oito.

Espinhos recém-formados. Ou seja, os espinhos que não estavam presentes na sessão de imagem anterior são mostrados pelas pontas de seta, os espinhos que foram eliminados entre as sessões de imagem são mostrados pelas setas. Philip Podia são indicados por estrelas uma vez dominadas.

Essa técnica pode ser feita em uma a duas horas se for executada corretamente.