Name: Two-Photon In vivo Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprenda a realizar imagem intracraniana de espinhas dendríticas no córtex de ratos vivos usando microscopia de dois fótons com preparação de crânio desbastado. Este método permite rastrear a dinâmica sináptica ao longo do tempo.

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Agradecemos James Perna para a ilustração gráfica. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Saúde Mental para YZ

Aprovação deve ser obtida a partir de instituições de origem antes do início da cirurgia e estudo de imagem. Experimentos descritos neste manuscrito foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos da Universidade da Califórnia, em Santa Cruz Institutional Animal Care e do Comitê Use. 1. Cirurgia <ol><li> Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e esterilizar o espaço de trabalho com 70% de álcool completamente antes da cirurgia. </li><li> Anestesiar o rato por intraperitoneal (IP) a injeção de solução anestésica KX (200 mg / kg de ketamina e 20 mg / kg de xilazina) de acordo com o peso corporal do rato Nota:. KX dose pode ser ajustada de acordo com a cepa, a idade eo estado de saúde dos ratos. Veterinária consulta para determinar a dose óptima é também recomendado. </li><li> Realizar um teste toe-pitada periodicamente, pressionando os dedos do rato e verificação de uma resposta reflexa para monitorar o estado de anestesia.Certifique-se de que o mouse está totalmente anestesiado antes de iniciar a cirurgia Nota:. Durante as sessões de imagem prolongados, verificar o estado de anestesia do rato periodicamente, administrar KX adicional se necessário. </li><li> Colocar o rato sobre uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo durante a cirurgia. </li><li> Raspar a cabeça do rato usando uma lâmina de barbear para expor o couro cabeludo. </li><li> Esterilizar a área raspada, limpando a pele com a alternância de compressas embebidas em álcool e betadine. Remova todos os recortes de cabelo residuais. </li><li> Gentilmente aplicar pomada para lubrificar os olhos, prevenindo danos permanentes causados ​​pela desidratação durante o experimento. </li><li> Fazer uma incisão em frente ao longo da linha média do couro cabeludo, e mover-se lateralmente para a pele das bordas do crânio. </li><li> Remover o tecido conectivo anexado ao crânio. </li></ol> 2. Diluído crânio-Preparação <ol><li> Identificar a região de imagem baseado em ster. coordenadas eotaxic Nota: Tente evitar grandes vasos sanguíneos, que a penetração da luz do bloco e esbater as estruturas fotografadas. Vasculatura é melhor observado quando o crânio é úmido com solução salina estéril. </li><li> Utilize o micro broca de alta velocidade para diluir uma região circular de crânio (0,5-1,0 mm de diâmetro). Mover a broca paralela à superfície do crânio, em vez de segurar o contra o crânio e pressionando para baixo. Broca até tanto a camada de osso compacto exterior ea camada de osso esponjoso meio são removidos Nota:. Para evitar danos causados ​​por superaquecimento, evitar o contato prolongado entre a broca eo crânio. </li><li> Continuar desbaste da camada interna do osso compacto com uma lâmina microcirúrgica no centro da região de desbaste-broca. Segurar a lâmina microcirúrgica a um ângulo de aproximadamente 45 ° para raspar o crânio sem pressionar contra o crânio até uma uniformemente diluído pequena região (200-300 mM de diâmetro) com uma espessura de aproximadamentely 20-30 mM é obtido. Devido à auto-fluorescência do crânio, a espessura pode ser medida por digitalizar a distância entre a superfície superior e inferior do crânio sob o microscópio de dois fotões Nota:. Embora uma espessura do crânio de menos de 20 mM proporciona uma boa qualidade de imagem, não é recomendado, porque torna o processo de afinamento em sessões de re-imagem subseqüentes difícil. Para evitar o excesso de desbaste, a espessura do crânio precisa ser verificado periodicamente durante a cirurgia (ver Discussão). </li></ol> 3. Imobilização <ol><li> Remova cuidadosamente os restos de osso. </li><li> Colocar uma pequena gota de cola de cianoacrilato sobre cada extremidade da abertura central da placa de cabeça estéril, que foi autoclavado (ver Figura 1). Manter a placa de cabeça firmemente contra o crânio com a região adelgaçada localizada no centro da abertura Nota:. Se a cola contamina o r diluídoegion por acidente, remova-a com cuidado com a lâmina de microcirurgia. </li><li> Suavemente puxar a pele a partir dos lados do crânio para os bordos da abertura central da placa de cabeça. </li><li> Espera aproximadamente 10 min, até que a placa de cabeça é também ligado ao crânio. </li><li> Coloque a placa de cabeça em dois blocos laterais da placa de retenção e, em seguida, aperte os parafusos ao longo das bordas da placa de cabeça para imobilizar o mouse sobre a placa de retenção (ver Figura 1) Nota:. Certifique-se de que não existe pele ou bigodes entre a placa de cabeça e os blocos antes de apertar os parafusos. Uma boa preparação imobilizada não deve apresentar movimento observável do crânio sob o microscópio de dissecação, quando a parte de trás do animal é afagou suavemente. </li><li> . Lavar o crânio exposto com solução salina para remover cola não polimerizada Nota: É importante remover qualquer cola restante, como cola não polimerizada borra imagens e danos microscópio objetivos &lt;./ Li&gt; </ol> 4. Imagem <ol><li> Tire uma foto da vasculatura do crânio exposta com a região diluído como Mapa 1, que é usado para mudar a região fotografada em sessões de imagem subseqüentes (ver Figura 2). </li><li> Posicione o mouse sob o microscópio de imagem. Localize a área diluído sob um objetivo ar 10X utilizando epifluorescência e mover a área mais fino do centro da vista. </li><li> Adicionar uma gota de solução salina no topo do crânio e mudar para o objectivo 60X, que tenha sido lavado com água esterilizada. Selecione uma região onde espinhas dendríticas individuais são claramente visualizado juntamente dendritos. Identificar e rotular a região correspondente no mapa 1, comparando vasculatura entre a visão de epifluorescência ea foto vasculatura. </li><li> Ajustar o comprimento de onda do laser de dois fotões de acordo com os fluoróforos. Por exemplo, 920 nm para YFP; 890 nm para GFP; 1.000 nm para DsRed e tdTomato 24. </li><li> Adquira pilhas de imagens com 2passos iM ao longo do eixo z com o objectivo de 60X. Esta pilha imagem cobre uma área de 200 x mM mM de aproximadamente 200 (512 x 512 pixels) e é usado como mapa 2 para o internamento durante as sessões de imagem subseqüentes (ver Figura 2). </li><li> Adquirir nove pilhas de imagens dentro de mapa 2 usando o zoom digital de 3X. Cada pilha de cobre uma área aproximada de 70 um x 70 um (512 x 512 pixels), com 0,7 mM etapas ao longo do eixo-z Nota:. A intensidade do laser deve ser inferior a 40 mW, quando medido em amostras de minimizar fototoxicidade. </li></ol> 5. Recuperação <ol><li> Na sequência de imagens, retire cuidadosamente a placa da cabeça do crânio. </li><li> Limpe bem o crânio ea pele para remover toda a cola restante Nota:. Qualquer cola remanescente na pele causará irritação e retardar a cicatrização da pele, enquanto que qualquer cola restante no crânio causará erosão do crânio e umangiogenesis na camada óssea recém-crescido, fazendo realocação subseqüente e re-imaging difícil. </li><li> Lavar o crânio ea pele várias vezes com solução salina. </li><li> Suture o couro cabeludo com sutura cirúrgica estéril. </li><li> Mantenha o animal em uma almofada de aquecimento em uma gaiola separada. Administrar analgésico buprenorfina (0,1 mg / kg) por via subcutânea para mitigar a dor pós-operatória. Devolver o animal para a gaiola para casa após recuperação completa. Monitorar o animal de perto (verifique pelo menos uma vez por dia) até que a incisão é curado e suturas são removidas. Administrar injeções subseqüentes de buprenorfina analgésico, se necessário. </li></ol> 6. Re-imagem <ol><li> Repita os passos de 1,1-1,8. </li><li> Repita os passos de 3,1-3,6 </li><li> Localize região anteriormente imaginado, comparando o padrão de vascularização ao Mapa 1 eo padrão dendrítico ramo ao Mapa 2. </li><li> Se recriação é realizada dentro de 1 semana, repetir o passo 2.3 para remover uma fina camada de tecido ósseo recém-cultivadas no topo da re afinadagião usando a lâmina microcirúrgica. Se recriação é realizada depois de mais de uma semana, repetir os passos tanto 2.2 e 2.3 Nota:. A camada de osso recentemente crescido consiste de uma estrutura menos condensada em comparação com a camada de osso original compacto, levando a uma redução da qualidade da imagem. Portanto, para obter a mesma qualidade, é necessário diluir o crânio ligeiramente mais do que a sessão de imagem anterior. </li><li> Ajuste a posição e orientação para obter pilhas de imagens que correspondem anteriormente tomadas pilhas de imagens sob o microscópio de dois fotões. </li><li> Adquirir imagens como no Passo 4.6. </li><li> Repita os passos de 5,1-5,5 após imagem. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Para se obter uma preparação bem sucedida diluído-crânio, várias etapas deste protocolo são cruciais. 1) A espessura do crânio. O osso do crânio tem uma estrutura de sanduíche, com duas camadas de osso compacto de alta densidade e uma camada intermédia de osso esponjoso de baixa densidade. Embora o micro-broca de alta velocidade é adequado para a remoção das camadas exteriores do osso compacto e osso esponjoso, a lâmina microcirúrgica é ideal para o desbaste da camada interna do osso compacto. À medida que a espessura e...

O córtex dos mamíferos participa em muitas funções do cérebro, desde o controle da percepção e movimento sensorial abstrair processamento de informação e cognição. Várias funções corticais construir sobre diferentes circuitos neurais, que são feitas de diferentes tipos de neurônios se comunicando e trocando informações nas sinapses individuais. A estrutura e função das sinapses são constantemente a ser modificados em resposta a experiências e patologias. No cérebro maduro, plasticidade sináptica toma a forma de ambas as mudanças de força e adição / remoção de sinapses, jogando um papel importante na formação e manutenção de um circuito neural funcional. As espinhas dendríticas são as componentes pós-sinápticos da maioria das sinapses excitatórias no cérebro de mamíferos. O volume de negócios constante e alterações morfológicas de espinhos são acreditados para servir como um bom indicador de modificações nas conexões sinápticas 1-7. Dois fótons micro varredura a laserscopy oferece penetração profunda através, preparações espessas e opacas baixo fototoxicidade, o que o torna adequado para imagens ao vivo no cérebro intacto 8. Em combinação com marcação fluorescente, dois fótons de imagem fornece uma ferramenta poderosa para espreitar para o cérebro vivo e siga reorganização estrutural nas sinapses individuais com alta resolução espacial e resolução temporal. Vários métodos têm sido usados ​​para preparar os ratos para imagens ao vivo 9-13. Aqui, descrevemos uma preparação diluída crânio-in vivo de dois fótons de imagem para investigar a plasticidade estrutural das espinhas dendríticas pós-sinápticos no córtex mouse. Usando essa abordagem, os nossos estudos recentes têm representado uma imagem dinâmica de alterações da coluna dendríticas em resposta a habilidade motora aprendendo Com o aumento da disponibilidade de animais transgênicos com subconjuntos de neurônios marcados com fluorescência e rápido desenvolvimento de técnicas in vivo de rotulagem, procedimentos semelhantes descritos aqui também pode ser aplicado para investigaçõesoutros tipos de células e de te regiões corticais, combinadas com outras manipulações, bem como os utilizados em modelos de doenças 16-23.

<table><tbody><tr><td>Cetamina</td><td>Bioniche Pharma</td><td>67457-034-10</td><td>Misturado com xilazina para anestesia</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd laboratories</td><td>139-236</td><td>Misturado com cetamina para anestesia</td></tr><tr><td></td><td>Saline Hospira</td><td>0409-7983-09</td><td>0,9% NaCl para injeção e imagem</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>Ciências de microscopia eletrônica</td><td>72000</td><td>Lâminas de barbear de aço inoxidável de dois gumes</td></tr><tr><td>Almofadas de álcool</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td>Almofadas de preparação de álcool estéreis</td></tr><tr><td>Pomada para os olhos</td><td>Henry Schein</td><td>102-9470</td><td>Pomada oftálmica de petrolato lubrificante ocular estéril</td></tr> Micro <tr><td>broca de alta velocidade</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>18000-17</td><td>A micro broca de alta velocidade é adequada para afinar a camada externa de osso compacto e direcionar uma pequena área</td></tr><tr><td>Micro brocas</td> <td>de açoFine Science Tools</td><td>19007-14</td> Lâmina microcirúrgica de <td>1,4 mm de diâmetro</td></tr><tr><td></td><td>Surgistar</td><td>6961</td><td>A lâmina microcirúrgica é adequada para afinar a camada interna de osso compacto e a camada intermediária de osso esponjoso</td></tr><tr><td>Cola de cianoacrilato</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9062131</td><td>Fixe a placa da cabeça no crânio</td></tr><tr><td>Sutura</td><td>Aparelho Havard</td><td>510461</td><td>Sutura de seda estéril não absorvente, 6-0 microscópio</td></tr><tr><td>de dissecação</td> de monofilamento <td>Olympus</td><td></td><td>SZ61</td></tr><tr><td>câmera CCD</td><td>Infinity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dois fótons</td><td>Prairie Technologies</td><td></td><td>Ultima IV</td></tr><tr><td>10X objetiva</td><td>Olympus</td><td></td><td>NA 0.30, ar</td></tr><tr><td>60X objetiva</td><td>Olympus</td><td></td><td>NA 1.1, permeável ao IR, imersão em água</td></tr><tr><td>Laser de safira Ti</td><td>Spectra-Física</td><td></td><td>Mai Tai HP</td></tr></tbody></table>

two-photon<em&gt; in vivo</em&gt; imagem de espinhas dendríticas no rato cortex usando um desbaste-crânio preparação

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

No córtex dos mamíferos, os neurônios formam redes extremamente complicadas e troca de informações nas sinapses. As alterações na concentração sináptica, bem como a adição / remoção de sinapses, ocorrem de uma forma dependente da experiência, fornecendo a base estrutural de plasticidade neuronal. Como componentes pós-sinápticas das sinapses excitatórias mais no córtex, espinhas dendríticas são consideradas como um bom indicador de sinapses. Tirar vantagens da genética e técnicas de rotulagem fluorescentes, neurônios individuais e suas estruturas sinápticas podem ser rotuladas no cérebro intacto. Aqui apresentamos um protocolo de imagem transcraniana por microscopia de varredura a laser de dois fótons de seguir fluorescente etiquetado espinhas dendríticas pós-sinápticos ao longo do tempo in vivo. Esse protocolo utiliza uma preparação diluída de caveira, que mantém o crânio intactos e evita efeitos inflamatórios provocados pela exposição das meninges e o córtex. Assim, as imagens podem ser adquiridas imediatamente após surgery é realizada. O procedimento experimental pode ser realizado repetidamente durante vários intervalos de tempo variando de horas a anos. A aplicação desta preparação também pode ser expandido para investigar diferentes regiões e camadas corticais, bem como outros tipos de células, em condições fisiológicas e patológicas.

Em YFP-H linha de camundongos 25, proteína fluorescente amarela expressa em um subconjunto de neurônios piramidais da camada V, que projetam seus dendritos apicais para as camadas superficiais do córtex. Através da preparação diluída de caveira, os segmentos dendríticas fluorescentemente marcadas podem ser repetitivamente trabalhada sob microscópio de dois fotões durante vários intervalos de imagem, variando de horas a meses. Aqui, mostramos um exemplo de uma imagem de quatro vezes as mesmas dendritos mais de...

A imagem de lapso de tempo no animal vivo fornece informações valiosas sobre a reorganização estrutural no cérebro intacto. Aqui, apresentamos uma preparação de crânio afinado que permite imagens transcranianas de estruturas sinápticas marcadas com fluorescência no córtex de camundongo vivo por microscopia de dois fótons.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

O objetivo geral deste procedimento é permitir a imagem transcraniana, de estruturas sinápticas marcadas com fluorescência, na córtex de camundongos vivos por meio de microscopia de dois fótons. O primeiro passo após anestesiar o camundongo é realizar uma preparação de crânio afinado. Em seguida, a cabeça do camundongo é imobilizada usando uma placa de fixação personalizada.Em seguida, pilhas de imagens são adquiridas através do crânio afinado utilizando microscopia de dois fótons. Por fim, relocando e realizando imagens. A região previamente imageada permitiu acompanhar a dinâmica dos espinhos dendríticos ao longo de diferentes períodos de tempo sob várias condições.Para se preparar para a cirurgia, anestesie um camundongo com cetamina e xilazina e realize um aperto no dedo do pé para garantir anestesia completa. Em seguida, coloque o camundongo sobre uma placa aquecida e use uma lâmina de barbear para retirar os pelos da cabeça. Limpe a pele com discos de álcool alternadamente para esterilizar a área depilada e remover quaisquer resíduos de pelos.Além disso, aplique suavemente pomada oftálmica em ambos os olhos. Em seguida, faça uma incisão reta ao longo da linha média do couro c

two-photon-vivo-imaging-dendritic-spines-mouse-cortex-using-thinned

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Neuroscience

Neurociência

Neste material de vídeo e suplementar, vamos mostrar um protocolo para a...

Imagem crônica de rato Visual Cortex usando uma preparação diluída crânio-

Nós apresentar um método para formar uma janela de imagem no crânio do rato que se estende por milímetro e é estável durante meses sem inflamação do cérebro. Este método é bem adequado para estudos longitudinais de fluxo de sangue, a dinâmica celular, e as células / estrutura vascular utilizando dois fotões microscopia.

A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

Ao combinar um polido e reforçado crânio-fino (portas) craniana janela e injeção de células do glioblastoma (GBM), podemos observar glioma iniciação e crescimento de células GBM injetadas no cérebro de um rato vivo longitudinalmente.

Imagem Glioma Iniciação<em&gt; Em Vivo</em&gt; Através de um polido e reforçado Janela crânio-Thin craniana

Fonte: Pekarek, B. T., et. al., Imagem e quantificação de dendritos neuronais intactos via limpeza de tecido CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)Neste vídeo, demonstramos a preparação, imagem e análise de um cérebro de camundongo limpo para examinar árvores dendríticas, morfologia da coluna vertebral e distribuição neuronal usando microscopia confocal e técnicas de reconstrução 3D.

Imagem de microscopia confocal de árvores dendríticas intactas e morfologia da coluna vertebral em um cérebro de camundongo limpo

Este artigo descreve um protocolo de trabalho de imagem espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo in vitro utilizando Structured Illumination Microscopy (SIM). Microscopia Super-resolução usando SIM oferece resolução de imagem significativamente além do limite de difração da luz em todas as três dimensões espaciais, permitindo que a imagem de espinhas dendríticas individuais com maior pormenor.

Imagiologia espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo de rato primária usando Structured Illumination Microscopy

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons na linha transgênica Thy1-GFP. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry no hipocampo dorsal. Essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência em RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

Este método descreve uma preparação crônica que permite o acesso óptico ao hipocampo de camundongos vivos. Esta preparação pode ser utilizada para realizar imagens ópticas longitudinais de plasticidade estrutural neuronal e plasticidade celular evocada por atividade ao longo de um período de várias semanas.

Imagem latente longitudinal do dois-fotão do hipocampal dorsal CA1 em ratos vivos

A Microscopia eletrônica de varredura de blocos de blocos serial (SBEM) é aplicada à imagem e análise de colunas dendríticas no hipocampo murino.

Microscopia eletrônica de varredura de blocos de bloco serial (SBEM) para o estudo de espinhas dendríticas

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Este protocolo contém uma descrição detalhada de uma abordagem passo a passo para um modelo de camundongo crônico de janela craniana e embolia microvascular, otimizado para imagens in vivo por microscopia de dois fótons usando microsferas fluorescentes de poliestireno.

Modelo de camundongo com embolia microvascular para microscopia in vivo de dois fótons usando microesferas fluorescentes de poliestireno

Aprenda a realizar imagem intracraniana de espinhas dendríticas no córtex de ratos vivos usando microscopia de dois fótons com preparação de crânio desbastado. Este método permite rastrear a dinâmica sináptica ao longo do tempo.

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