Transfecção única célula em embriões de galinha

O objetivo geral deste procedimento é injetar células únicas de somitos chiques ou tubos neurais com um plasmídeo que codifica a proteína fluorescente verde. Isso é feito puxando primeiro pipetas de microinjeção com um diâmetro de abertura de ponta apropriado. A segunda etapa do procedimento é preparar um estoque de plasmídeo para injeções.

A terceira etapa do procedimento é preparar os embriões para injeção. A quarta etapa do procedimento é carregar as micropipetas com DNA de plasmídeo. A etapa final do procedimento é injetar os tecidos desejados.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a gama de derivados no número de células produzidas por progenitores marcados com uma única marca em subdomínios escolhidos de som e tubo neural por meio de microscopia imunofluorescente. Olá, sou Rael, do Laboratório do Professor Heim no Departamento de Neurobiologia Médica da Universidade Hebraica de Jerusalém. Hoje mostraremos um procedimento para injetar células únicas de somitos de frango e tubos neurais.

Usamos esse procedimento em laboratório para estudar a segregação de linhas de células do ácaro e do tubo neural. Então vamos começar: Para gerar células transfectadas únicas em embriões de pintinho, comece puxando micropipetas. Puxamos nossas pipetas em um extrator de pipetas Naga PP 83 padrão com uma configuração de calor de 13,5.

A configuração precisa deve ser calibrada para atingir um diâmetro de ponteira de pipeta entre oito e 10 mícrons. Usamos filamentos contendo tubos de vidro de silicato Boris com um diâmetro externo de um milímetro e um diâmetro interno de 0,75 a 0,78 milímetros. Você também pode usar micropipetas disponíveis comercialmente, sem um filamento de um milímetro de diâmetro externo e 0,75 milímetros de diâmetro interno.

As pipetas preparadas são armazenadas em um prato de plástico com as pontas protegidas do contato com a borda do prato. Para preparar o DNA para microinjeção, o plasmídeo de interesse é transfectado em DH cinco alfa e coli. Usando procedimentos padrão no dia seguinte, o plasmídeo é purificado usando um kit de preparação Maxi para injeções não clonais, usamos uma concentração de DNA de um micrograma por microlitro.

Para experimentos em que clones individuais são desejados, a concentração de plasmídeo será muito menor e precisará ser ajustada. Para P-C-A-G-G-F-P-A concentração de 0,05 a 0,1 micrograma por microlitro funciona bem. Uma vez determinada a concentração ótima, recomendamos a diluição de todo o plasmídeo purificado em vez de preparações individuais para uma concentração predeterminada.

Este último pode introduzir alguma variação nas taxas de sucesso, provavelmente devido a variações na pureza e outros parâmetros, como a proporção de plasmídeo supercoil para preparar ovos para microinjeção de ovos de galinha que foram incubados enquanto estavam deitados em seus longos eixos até que o estágio de desenvolvimento desejado sejam esfregados com etanol 70% e deixados secar. Em seguida, fure a ponta pontiaguda do ovo com uma tesoura cirúrgica. Usando uma seringa de 10 mililitros e uma agulha de calibre 19, retire dois mililitros de albumina do ovo, sele os orifícios com parafina quente antes da injeção.

Use uma tesoura cirúrgica para abrir uma janela na parte superior da casca do ovo para evitar que detritos entrem no buraco. Coloque um pedaço de fita adesiva sobre a janela e faça um furo. Para ajudar a visualizar o embrião, use um capilar puxado por fogo montado em um aspirador para injetar uma tinta não tóxica, como o pelicano 17, embaixo da derme jateada.

Em seguida, acesse o embrião cortando e desviando as membranas vitais e/ou amnióticas usando pinos de insetos de 0,14 milímetros montados em um porta-agulha para carregar o DNA na pipeta puxada Eloqua e adicionar uma pequena quantidade de pó verde rápido usando o capilar. Desenhe uma quantidade mínima de capilar montado em plasmídeo de diâmetro adequado em um aspirador. Em seguida, insira-o na extremidade da pipeta oposta à ponta afiada e carregue o DNA o mais próximo possível da extremidade afiada

Em seguida, conecte a pipeta em um injetor manual de pressão de ar montado em um micromanipulador. Aplique uma quantidade mínima de pressão, se necessário, para permitir que a solução plasmidial atinja a ponta da pipeta. Manipule a pipeta no meio líquido do ovo enquanto aplica um pouco de pressão de ar para evitar o entupimento da ponta da pipeta.

Uma vez que o domínio do tecido relevante é perfurado, a mudança na pressão geralmente é suficiente para liberar o plasmídeo com verde rápido visível. Se isso não ocorrer, aplique uma leve pressão na seringa até que a mistura verde rápida do plasmídeo seja ejetada. Repita este procedimento ao longo do eixo do embrião após a injeção, pode-se adicionar PBS.

Por fim, feche a janela com fita adesiva e devolva os ovos à incubadora. Evite ventilação e inclua pequenos recipientes de água na incubadora para ajudar a manter a umidade e aumentar a produtividade. Se o local alvo da injeção foi superficial o suficiente para ser facilmente aparente, como dentro do tubo neural de somitos dorsais ou ectoderma, pode-se medir a taxa de sucesso do experimento realizando uma observação de montagem inteira usando um binóculo fluorescente.

Esta etapa é particularmente útil para avaliar se muitas ou poucas células foram marcadas. Se desejar uma incubação adicional, adicione antibióticos contendo solução de PBS ao ovo após a visualização e substitua a fita do teto. Além disso, pode-se avaliar a taxa de sucesso da injeção seccionando serialmente os embriões e realizando imuno-histoquímica.

Após quatro horas ou mais, os embriões pós-injeção são fixados e processados para seccionamento em parafina. As seções montadas em vidro são então finalizadas e a imunocoloração para métodos de amplificação de visualização do repórter, como a estreptavidina de biotina, pode ser desejável. Finalmente, as seções seriais são escaneadas para detectar células marcadas em segmentos injetados.

Se, após os ensaios iniciais, forem obtidas células múltiplas em vez de células individuais, o estoque de plasmídeo deve ser diluído no processo repetido até que resultados adequados sejam alcançados. Normalmente, realizamos uma única injeção de P-C-A-G-G-F-P por ácaro, visando de seis a 12 segmentos por embrião. Sob esta configuração, um sinal claro pode ser detectado pela observação de toda a montagem, oito horas após a injeção em pelo menos um segmento em um embrião em cada 10.

Neste exemplo, um ácaro foi injetado com um plasmídeo codificador de GFP e, cinco horas depois, uma única célula fluorescente é observada em uma visão de montagem inteira do embrião mostrado aqui. Quando observado 24 horas após a injeção no ácaro central, um clone de células fluorescentes é observado em um embrião inteiro montado dois dias após a injeção clonal. A secção deste segmento revela a presença de progênie clonal tanto na derme quanto no músculo, demonstrando que progenitores únicos geram ambos os derivados.

Quanto aos somitos, progenitores epiteliais neuro únicos no tubo neural dorsal também podem ser empalados, conforme ilustrado nesta seção transversal, fotografada cinco horas após a injeção aqui. A análise de corte seriado revelou que o transfecto clonal foi alcançado quando a taxa de sucesso foi de cerca de 10% Isso significa que, para atingir a clonalidade, a técnica é, por definição, altamente ineficiente. Por outro lado, nessas condições, mais de 93% dos eventos de marcação positiva foram clonais.

Acabamos de mostrar como injetar células únicas de embriões de galinha ao fazer este procedimento. É importante lembrar de diluir uma grande quantidade de plasmídeo de estoque para uma concentração ideal para infecções de células únicas e, em seguida, usá-lo em seus experimentos. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.