Western Blotting: Preparação de amostras para detecção

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a facilidade de realizar um Western blot ao usar produtos apropriados. Após a preparação da amostra, as proteínas são separadas com base no tamanho e depois transferidas para uma fase sólida. As proteínas são então sondadas com anticorpos e detectadas o uso de protocolos adequados e reagentes econômicos de alta qualidade produzem resultados aprimorados de western blotting.

Olá, sou Jesse Luhan, cientista da EMD Chemicals em San Diego, Califórnia. A EMD é uma afiliada da Merck, KGAA em Dharm stat Germany. Hoje vamos mostrar um procedimento de western blotting.

Então vamos começar. O primeiro passo no western blotting é a preparação da amostra. Comece a preparação da amostra peletizando as células usando centrifugação de baixa velocidade, como cinco minutos a 2.500 vezes a gravidade.

Após a centrifugação, drene os pellets de células. Ressuspenda bem as células no reagente de extração de proteína cyto buster usando 150 microlitros por 10 para as seis células. Incubar a amostra à temperatura ambiente durante cinco minutos.

Em seguida, gire a amostra por cinco minutos a 16.000 vezes a gravidade a quatro graus Celsius após a centrifugação. Transferir o SNA limpo para um novo tubo e prosseguir com a análise. Depois que a concentração de proteína da amostra for avaliada, prepare a amostra para carregar o gel para desnaturar a proteína.

Use um sample tampão contendo um detergente desnaturante ônico, como sulfato de sódio ou SDS. Ferva a mistura a 95 a 100 graus Celsius por cinco minutos. Usando um gel pré-moldado disponível comercialmente, as proteínas podem ser rapidamente separadas com base no peso molecular.

Encha a unidade de eletroforese com tampão de corrida, que pode ser feito a partir de reagentes oferecidos pela linha química Omni PU. Carregue a primeira pista do poço com marcador de proteína de mistura de trilha. Este marcador possui três bandas de referência que permitem o monitoramento durante a eletroforese.

Uma vez que o gel é corado, 10 bandas são visíveis, variando de 10 a 225 quilos Daltons. Carregue a amostra desnaturada nos poços restantes. Execute o gel a 220 volts por uma hora.

Depois que as proteínas se separarem, core o gel com azul de kumasi para garantir que as proteínas migraram de maneira uniforme e uniforme usando coloração rápida e ultrassensível, que está pronta para uso sem DS. A coloração é necessária assim como as proteínas com carga elétrica podem ser induzidas a viajar através de um gel em um campo elétrico, as proteínas podem ser transferidas em um campo elétrico do gel para uma membrana como NITROCELULOSE ou PVDF. Ao usar membranas de PVDF, mergulhe a membrana em metanol por alguns minutos, seguido de um equilíbrio em tampão de transferência gelado por cinco minutos. Mergulhe também o gel por alguns minutos em tampão de transferência gelado E o equilíbrio evita o encolhimento do gel durante a transferência.

Para uma transferência úmida, monte um sanduíche de gel e membrana entre a esponja e o papel. Em seguida, prenda o conjunto firmemente depois de garantir que nenhuma bolha de ar se formou entre o gel e a membrana. Mergulhe o sanduíche no tampão de transferência e aplique um campo elétrico.

As proteínas carregadas negativamente viajarão em direção ao eletrodo carregado positivamente. A membrana então os impede, os liga e impede que continuem. Quando a transferência estiver concluída, visualize as proteínas para garantir uma transferência uniforme sem bolsas de ar.

Isso pode ser feito facilmente com a mancha de alerta vermelho Western blot. Esta mancha está pronta para uso e a coloração pode ser feita facilmente com água. Este é o gel, uma vez que tenha sido corado por lavagem em água antes que a membrana possa ser provada com anticorpo, a membrana é bloqueada.

Para evitar ligações inespecíficas, bloqueie a membrana com reagentes bloqueadores de alta qualidade. Para evitar um aumento do fundo, incubando-o em solução de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente sob agitação suave, lave a membrana três vezes em TBST ou PBST após a incubação. Esses buffers podem ser feitos de forma fácil e conveniente usando tablets de interpolação TBS e tablets de interpolação PBS, respectivamente.

Uma vez que a membrana tenha sido bloqueada e lavada, ela pode ser incubada com o anticorpo primário. Aplique o anticorpo primário usando uma solução, uma de aumento de sinal, que permite que o sinal seja aprimorado significativamente. Preparar o anticorpo primário na solução um e incubar a membrana durante uma hora.

Não há necessidade de adicionar mais agentes de bloqueio após a incubação. Lave a membrana com TBST. Em seguida, incubar a membrana com o anticorpo secundário diluído na solução dois de sinal durante uma hora.

Por fim, lave a membrana novamente várias vezes com TBST para HRP conjugado. A detecção de anticorpos secundários por quimioluminescência aprimorada ou ECL é tradicionalmente usada aqui. A etapa rápida do reagente ECL é usada, pois não requer mistura de luminol ou intensificador.

Basta borrifar a membrana algumas vezes, incubar por dois minutos e revelá-la usando filme de raios-x. O Rapid Step oferece baixa sensibilidade de picograma, bem como missão mais leve por até duas horas após a adição do substrato. Os marcadores de proteína de mistura de trilha permitem o rastreamento de proteínas durante a eletroforese quando comparados com os protocolos padrão de Western blot.

O Signal Boost permite maior faixa dinâmica e sensibilidade. Finalmente, a sensibilidade superior pode ser obtida usando o passo rápido em vez dos reagentes ECL tradicionais. Acabamos de mostrar como realizar a cegueira ocidental de forma eficiente e econômica com uma ampla gama de produtos.

Lembre-se de que a qualidade de seus resultados depende da qualidade de seus reagentes. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.