Name: Western Blotting: Preparação de amostras para detecção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-14T17:27:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprenda a técnica de Western blotting para análise de proteínas usando amostras de tecido. Este método demonstra a importância de reagentes de alta qualidade e protocolos adequados para obter resultados confiáveis em bioquímica.

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1. Preparação da Amostra O primeiro passo para Western blotting é a preparação da amostra. Para preparar as amostras para a execução de um gel de células e tecidos precisam ser lisadas para liberar as proteínas de interesse. <ul><li> Um conveniente, reagente pronto para uso que é versátil e fácil de usar para extração de proteínas solúveis é CytoBuster ou PhosphoSafe. Estes buffers extração contêm detergentes otimizado para extração eficiente de proteínas solúveis a partir de células de mamíferos e insetos. A suave, a composição não-iônico de CytoBuster Reagente de Extracção de proteínas permite o isolamento de ativos endógenos ou funcionalmente proteínas expressas sem necessidade de tratamento secundário, como sonicação ou congelamento / descongelamento. PhoshoSafe tem a vantagem de conter quatro inibidores da fosfatase. <ol><li> Agregar as células por centrifugação a baixa velocidade (por exemplo, 5 min a 2500 xg), escorra o pellet celular também. </li><li> Ressuspender as células em CytoBuster Reagente de Extracção de proteínas usando 150 mL por 10 6 células (quantidade ideal de CytoBuster Reagente de Extracção de proteínas pode variar de acordo com o tamanho da célula). </li><li> Incubar a temperatura ambiente por 5 min. </li><li> Transferência para um tubo adequado e girar por 5 min a 16.000 xg, a 4 ° C. </li><li> Transferência apuradas sobrenadante (extrato celular) para um novo tubo e prosseguir com a análise. </li></ol></li><li> Para a extração de proteínas especializadas, recomendamos o uso de nossos alta qualidade Kits ProteoExtract. EMD tem mais de uma dúzia de kits para o isolamento mitocondrial, a extração de proteoma subcelular, a extração de proteínas transmembrana, e muitos outros. Visite nossa página de destino Western blot para mais detalhes. </li><li> EMD também vende uma ampla variedade de protease e define fosfatase cocktail inibidor. Assim como ocorre lise, desfosforilação proteólise, e desnaturação começar. Estes eventos podem ser abrandado tremendamente se as amostras são mantidas em gelo ou a 4 ° C em todos os momentos e os inibidores apropriadas são adicionadas novas para o tampão de lise. Visite nossa página de destino Western blot para mais detalhes. </li></ul> 2. SDS-PAGE O segundo passo é a separação Western blotting proteína. As proteínas são separadas com base no peso molecular. <ul><li> Você pode fazer seu próprio gel PAGE, no entanto vamos estar usando um gel comercialmente pré-moldados. <ol><li> Depois de preparar a sua amostra, você está pronto para determinar a concentração de proteína. EMD tem dois kits para este para medir a concentração, sendo um deles a não-interferência Kit Ensaio de proteína e sendo o outro a BCA Protein Assay Kit. </li><li> Uma vez que a concentração de proteína é avaliado estamos prontos para preparar a nossa amostra para o carregamento do gel. Anticorpos normalmente reconhecer uma pequena porção da proteína de interesse (referido como o epítopo) e neste domínio podem residir dentro da conformação 3D da proteína. Para permitir o acesso do anticorpo para esta parcela é necessário desdobrar a proteína. </li><li> Para desnaturar, use um tampão de carregamento com a desnaturação sulfato de detergente aniônico dodecil sódio (SDS), e ferva a mistura em 95-100 ° C por 5 minutos. Um tampão de carregamento fácil e conveniente de usar é tampão de amostra 4X. </li></ol></li><li> Carregar a primeira pista do poço com marcador Trail Mix Protein. Este marcador tem três bandas de referência que permitem monitorar eletroforese. Quando o gel estiver manchado, bandas são visíveis desde 10 10-225 kDa. </li><li> Preencha a unidade de eletroforese com tampão de corrida. Para géis PAGE, esta é geralmente 1X Tris-glicina. Para receitas de buffer mais detalhadas, visite a página de Western blotting. A Merck oferece reagentes de alta qualidade buffers com nossa linha química OmniPur. Executar o gel a 220V por 1 hora. </li><li> Uma vez que as proteínas se separaram, mancha o gel com Coomassie blue para garantir as proteínas migraram de forma uniforme e uniformemente. RAPIDstain é uma mancha ultra-sensível, que está pronto para uso. Descoloração não é necessária. </li></ul> 3. Transferência de proteína Assim como proteínas com uma carga elétrica pode ser induzida a viajar por um gel em um campo elétrico, pode assim as proteínas ser transferidos em um campo elétrico a partir do gel para uma membrana, sendo ou PVDF ou de nitrocelulose. <ul><li> Hoje vamos fazer uma transferência molhado. Na transferência de molhado, o gel ea membrana são prensadas entre esponja e papel (esponja / papel / gel / membrana / papel / esponja) e todos são apertadas em conjunto, após garantir a ausência de bolhas de ar formada entre o gel ea membrana. O sanduíche está submerso em tampão de transferência para que um campo elétrico é aplicado. As proteínas de carga negativa viajar para o eletrodo com carga positiva, mas a membrana deixa-los, os une e as impede de prosseguir. </li><li> Dois tipos de membranas são disponíveis: nitrocelulose e PVDF. Ambos funcionam bem. Hoje vamos estar usando PVDF. Membranas PVDF requerem imersão em methanol por alguns minutos, seguido de gelo do buffer de transferência fria por 5 minutos. O gel também precisa equilibrar por alguns minutos no gelo frio do buffer de transferência. Não fazer isso pode diminuir o gel durante a transferência. </li><li> O buffer de transferência molhado é 1X Tris-glicina com metanol 20%. Preparações tampão detalhadas estão disponíveis em nosso website. </li><li> Uma vez que a transferência estiver completa, é uma boa idéia para visualizar proteínas para assegurar uma transferência sem bolsas de ar. Isto pode ser feito facilmente com Blot RedAlert ocidental Stain. Esta mancha é ready-to-use e descoloração pode ser feito facilmente com água. </li></ul> 4. Anticorpos e reagentes de Acessórios <ul><li> O primeiro passo para fazer a sondagem e do anticorpo ao antígeno é bloquear a membrana. Bloqueio da membrana impede ligação não específica de fundo. </li><li> Tanto de leite sem gordura ou BSA pode ser usado como uma solução de bloqueio. Entretanto, ao usar fosfo-anticorpos específicos, não é recomendado o uso de leite, uma vez que fará com elevado ruído de fundo. </li><li> EMD oferece diversos reagentes de alta qualidade de bloqueio, incluindo SeaBlock, que é um agente não-mamíferos bloqueio e QuickBlocker BLOT, que é preparado, ready-to-use agente bloqueador. Temos também de alta qualidade BSA (Fração V) disponíveis. <ol><li> Incubar a membrana uma hora à temperatura ambiente sob agitação suave. </li><li> Lavar três vezes em PBST TBST ou após a incubação. Uma maneira fácil e conveniente de fazer TBST ou PBST é usar o nosso comprimidos (comprimidos PBS TWEEN / Comprimidos TWEEN TBS) </li></ol></li><li> Uma vez que a membrana foi bloqueado, você está pronto para incubar com o anticorpo primário. EMD tem vindo a oferecer um portfólio completo de anticorpos excepcional, com a melhor garantia de anticorpos na indústria há mais de 30 anos. Lembre-se que, com todos os anticorpos EMD, oferecemos uma completa garantia 100% sem risco. Compra um anticorpo e usá-lo para qualquer especificidade de espécie ou aplicação que você deseja. Se o anticorpo não trabalhar para sua satisfação, nós forneceremos um crédito total para ser usado em qualquer outro produto. Para mais detalhes, visite a nossa página web Western blotting. <ol><li> Hoje vamos estar a incubar o nosso anticorpo primário usando uma solução de 1 de SignalBoost. SignalBoost é um grande produto permitindo que o seu sinal a ser melhorado significativamente. Simplesmente incubar o seu anticorpo primário em uma solução e incubar por 1 hora ou como faria normalmente. Não há necessidade de adicionar mais agentes bloqueadores. Alternativamente, você pode usar BSA ou leite em pó desnatado como um agente de bloqueio. </li><li> Lavar com TBST. Fazemos TBST usando o pronto-a dissolver comprimido TBST. </li><li> Incubar o seu anticorpo secundário usando uma solução de 2 de SignalBoost. Incubar o anticorpo secundário em tampão de bloqueio por 1 hora. Lavar a membrana de novo várias vezes com TBST. </li></ol></li></ul> 5. Detecção Para HRP conjugando anticorpos secundários, ECL é tradicionalmente utilizada. Um reagente ECL excelente que oferecemos é RapidStep. As vantagens de RapidStep são de que haja mistura de luminal ou enhancer é necessária. Basta pulverizar a membrana algumas vezes e desenvolver usando x-ray filme. RapidStep oferece uma sensibilidade pictograma baixo, bem como emitir luz por até 2 horas após a adição de substrato.

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. 'W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Ambroz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quantification+accuracy+for+Western+blots+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis.</a> , (2006).</li>
<li>Quan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+and+mitochondrial+dysfunction+contribute+to+cirsimartitin-induced+apoptosis+in+human+gallbladder+carcinoma+GBC-SD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett+Article%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells.</a> Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).</li>
<li>O'Malley, D. ervia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+colonic+corticotrophin-releasing+factor+receptors+in+the+maternally+separated+rat+model+of+irritable+bowel+syndrome%3A+Differential+effects+of+acute+psychological+and+physical+stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors.</a> Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).</li>
</ol>

Os autores Anna Eslami e Jesse Lujan são empregados por EMD Chemicals Inc, que produz reagentes e instrumentos utilizados no presente artigo.

Nesta apresentação de vídeo, destacamos os principais passos na Western blotting, que são a preparação da amostra, SDS-PAGE, membrana bloqueio / sondagem com anticorpos e detecção. Para cada etapa do processo, os protocolos apropriados e reagentes apropriados devem ser utilizados para atingir resultados de alta qualidade.

<table><tbody><tr><td>CytoBuster&amp;#8482; Reagente para Extração de Proteínas</td><td>EMD Millipore</td><td>71009</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PhosphoSafe&amp;#8482; Reagente de Extração</td><td>EMD Millipore</td><td>71296</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ensaios de Proteínas Não Interferentes&amp;#8482; Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>488250</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Proteína BCA </td><td>EMD Millipore</td><td>71285</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/BCA&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/BCA&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/BCA&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/BCA&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tampão de amostra SDS 4X </td><td>EMD Millipore</td><td>70607</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Mistura de Trilhas&amp;#8482; Marcadores Proteicos</td><td>EMD Millipore</td><td>70980</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Proteína&amp;#8211;xtract&amp;#8482; Kits de Extração de Proteínas</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>OmniPur&amp;#174; Produtos</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/omnipur&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/omnipur&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RAPIDstain&amp;#8482; Reagente</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RedAlert&amp;#8482; Mancha para Western Blot 10X</td><td>EMD Millipore</td><td>71078</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/redalert&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/redalert&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/redalert&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/redalert&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SeaBlock&amp;#8482; Reagente, Plasma de Salmão</td><td>EMD Millipore</td><td>558300</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/seablock&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/seablock&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/seablock&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/seablock&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Reagente BLOT-QuickBlocker</td><td>EMD Millipore</td><td>WB57</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Albumina Sérica Bovina, Fração V</td><td>EMD Millipore</td><td>12660</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PBS-TWEEN&amp;#174; Comprimidos</td><td>EMD Millipore</td><td>524653</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/PBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/PBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/PBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/PBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>TBS-TWEEN&amp;#174; Comprimidos</td><td>EMD Millipore</td><td>524753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/TBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/TBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/TBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/TBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SignalBoost&amp;#8482; Kit de Realce da Imunorreação</td><td>EMD Millipore</td><td>407207</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RapidStep&amp;#8482; Reagente ECL</td><td>EMD Millipore</td><td>345818</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

western blotting: preparação de amostras para detecção

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting é uma técnica analítica usada para detectar proteínas específicas em uma dada amostra de homogeneizado de tecido ou extrato. Ele usa eletroforese em gel para separar as proteínas nativas ou desnaturadas pelo comprimento do polipeptídeo (condições desnaturantes) ou pela estrutura 3-D da proteína (nativo / não-desnaturação condições). As proteínas são então transferidos para uma membrana (tipicamente de nitrocelulose ou PVDF), onde são detectados (detectado), utilizando anticorpos específicos para a proteína alvo.

Western blotting é uma técnica analítica usada para detectar proteínas específicas em uma dada amostra de homogeneizado de tecido ou extrato.

Western Blotting: Preparação de amostras para detecção

O Western blotting é uma técnica analítica utilizada para detectar proteínas específicas em uma determinada amostra de homogeneizado ou extrato de tecido. Esta técnica utiliza gel...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a facilidade de realizar um Western blot ao utilizar produtos apropriados. Após a preparação da amostra, as proteínas são separadas com base no tamanho e, em seguida, transferidas para uma fase sólida. As proteínas são então detectadas com anticorpos, e o uso de protocolos adequados e reagentes de alta qualidade e custo-efetivos produz resultados aprimorados em Western blot.Olá, sou Jesse Luhan, cientista de P&D da EMD Chemicals em San Diego, Califórnia. A EMD é uma afiliada da Merck KGaA em Darmstadt, Alemanha. Hoje vamos mostrar a você um procedimento de western blotting.Então vamos começar. O primeiro passo no western blot é a preparação da amostra. Inicie a preparação da amostra pelizando as células usando centrifugação de baixa velocidade, como cinco minutos a 2.500 ×g.Após a centrifugação, remova os pellets celulares. Resuspenda bem as células no reagente de extração de proteínas cyto buster utilizando 150 microlitros por 10 elevado a seis células. Incube a amostra à temperatura ambiente por cinco minutos.Em seguida, centrifugue a amostra por cinco minutos a 16.000 ×g a quatro graus Celsius após a centrifugação. Transfira o sobrenadante claro para um tubo novo e prossiga com a análise. Após a avaliação da concentração proteica da amostra, prepare a amostra para aplicação no gel, desnaturando a proteína.Utilize um tampão de amostra contendo um detergente desnaturante iônico, como dodecilsulfato de sódio ou SDS. Ferva a mistura a 95-100 °C por cinco minutos. Usando um gel pré-moldado comercialmente disponível, as proteínas podem ser rapidamente separadas com base no peso molecular.Encha a unidade de eletroforese com tampão de corrida, que pode ser preparado a partir de reagentes oferecidos pela linha química Omni PU. Carregue a primeira fileira do poço com o marcador proteico trail mix. Este marcador possui três bandas de referência que permitem o monitoramento durante a eletroforese.Após a coloração do gel, 10 bandas são visíveis, variando de 10 a 225 kilo Daltons. Carregue a amostra desnaturada nos poços restantes. Execute o gel a 220 volts por uma hora.Uma vez que as proteínas tenham se separado, corar o gel com azul de kumasi para garantir que as proteínas tenham migrado de maneira uniforme e homogênea, utilizando corante rápido e corante ultrassensível, que é pronto para uso, sem necessidade de DS. Assim como proteínas com carga elétrica podem ser induzidas a migrar através de um gel em um campo elétrico, as proteínas podem ser transferidas em um campo elétrico do gel para uma membrana, como NITROCELULOSE ou PVDF. Ao usar membranas de PVDF, mergulhar a membrana em metanol por alguns minutos, seguido por uma equilibração em tampão de transferência gelado por cinco minutos. Também mergulhar o gel por alguns minutos em tampão de transferência gelado; a equilibração evita a contração do gel durante a transferência.Para uma transferência úmida, monte um sanduíche contendo o gel e a membrana entre esponja e papel. Em seguida, prenda firmemente o conjunto após garantir que nenhuma bolha de ar tenha se formado entre o gel e a membrana. Mergulhe o sanduíche no tampão de transferência e aplique um campo elétrico.As proteínas com carga negativa migrarão em direção ao eletrodo com carga positiva. A membrana, então, as retém, ligando-se a elas e impedindo que continuem. Após a conclusão da transferência, visualize as proteínas para garantir uma transferência uniforme e ausência de bolsas de ar.Isso pode ser facilmente feito com o corante para Western blot de alerta vermelho. Este corante está pronto para uso e a desscoloração pode ser realizada facilmente com água. Este é o gel após ter sido dessaturado por lavagem em água; antes que a membrana possa ser provada com anticorpo, a membrana é bloqueada.Para evitar ligação inespecífica, bloqueie a membrana com reagentes de bloqueio de alta qualidade. Para evitar um aumento no fundo, incube-a em solução de bloqueio por uma hora à temperatura ambiente sob agitação suave, depois lave a membrana três vezes em TBST ou PBST após a incubação. Esses tampões podem ser facilmente e convenientemente preparados usando comprimidos de tween TBS e comprimidos de tween PBS, respectivamente.Após a membrana ter sido bloqueada e lavada, ela pode ser incubada com o anticorpo primário. Aplique o anticorpo primário utilizando a solução um do Signal Boost, que permite uma amplificação significativa do sinal. Prepare o anticorpo primário na solução um e incube a membrana por uma hora.Não é necessário adicionar agentes bloqueadores adicionais após a incubação. Lave a membrana com TBST. Em seguida, incube a membrana com o anticorpo secundário diluído na solução dois do amplificador de sinal por uma hora.Por fim, lave novamente a membrana várias vezes com TBST para detecção de anticorpos secundários conjugados à HRP. A detecção por quimioluminescência melhorada ou ECL é tradicionalmente utilizada neste passo. O reagente ECL de passo rápido é empregado, pois não requer a mistura de luminol ou potencializador.Basta pulverizar a membrana algumas vezes, incubá-la por dois minutos e revelá-la utilizando filme de raios X. O Rapid Step oferece sensibilidade na faixa de picogramas baixos, bem como emissão mais leve por até duas horas após a adição do substrato. Os marcadores proteicos Trail mix permitem o rastreamento de proteínas durante a eletroforese quando comparados aos protocolos padrão de Western blot.O Signal Boost permite uma faixa dinâmica e sensibilidade maiores. Por fim, pode-se obter uma sensibilidade superior utilizando o passo Rápido em vez de reagentes ECL tradicionais. Acabamos de mostrar como realizar o Western blot de forma eficiente e econômica com uma gama abrangente de produtos.Lembre-se de que a qualidade dos seus resultados depende da qualidade dos seus reagentes. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Western Blotting: Preparação de amostras para detecção

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