Análise immunoblot

O immuno blotting, muitas vezes referido como Western blotting, é usado para identificar dentro de uma amostra de proteína, antígenos específicos reconhecidos por anticorpos policlonais ou monoclonais. Este procedimento normalmente segue uma eletroforese em gel ou 2D e envolve a transferência de proteínas separadas para membranas de nitrocelulose. Incubação dessas membranas com anticorpos primários e secundários, direta ou indiretamente conjugados a enzimas e visualização de antígenos proteicos nessas membranas usando reações de substrato colorido ou fluorescente.

Neste vídeo, fornecemos uma demonstração passo a passo de um procedimento de immuno blotting. Olá, sou Sean Gallagher, da UVPI, colaboro com um centro proteômico aqui no KE Graduate Institute. Hoje vou mostrar a análise de immunoblotting.

Envolve uma série de etapas, incluindo separação de proteínas, blotting das proteínas nas membranas, sondagem imunológica e visualização com substratos de luminescência cromogênicos e kim. Então vamos começar. Antes de iniciar o procedimento de immunoblotting, as amostras de proteínas devem primeiro ser separadas por eletroforese usando géis unidimensionais de tamanho pequeno ou padrão.

Prepare as amostras antigênicas e carregue-as nas pistas do gel, inclua proteína pré-fabricada ou biotinilada, padrões de peso molecular em uma ou mais das faixas de gel. Esses marcadores de proteína serão transferidos para a membrana e indicarão convenientemente a orientação da membrana e os tamanhos das proteínas após a imunocoloração. Assim que a eletroforese estiver concluída, estamos prontos para montar o immunoblot.

Para montar o immuno blot Primeiro, desmonte o sanduíche de gel e remova o gel de empilhamento equilibre o gel por 30 minutos À temperatura ambiente no tampão de transferência, esse equilíbrio é necessário para evitar uma mudança no tamanho do gel durante a transferência enquanto o gel está se equilibrando. Comece a montar o sanduíche de transferência em uma bandeja grande o suficiente para segurar o de transferência de plástico com buffer de transferência para que o fique coberto. Agora coloque uma almofada ou esponja scotch bright na metade inferior do de transferência de plástico.

Em seguida, pegue uma folha de papel de filtro que foi cortada no mesmo tamanho do gel. Umedeça-o previamente com tampão de transferência e coloque-o em cima da almofada brilhante escocesa. Uma vez feito o equilíbrio do gel de 30 minutos, coloque o gel em cima do papel de filtro.

Remova quaisquer bolhas de ar entre o gel e o papel de filtro rolando suavemente um tubo de ensaio ou haste de vidro sobre a superfície do gel. Ou você pode usar o rolo BioRad, que vem com o kit BioRad. Lembre-se de usar luvas ao manipular papéis de filtro, géis e membranas.

O óleo de suas mãos bloqueará a transferência. Em seguida, prepare a membrana de transferência. Corte a membrana no mesmo tamanho do gel mais um a dois milímetros em cada borda.

Em seguida, coloque a membrana em água destilada lentamente com uma borda em um ângulo de 45 graus, a água irá absorver a membrana e, eventualmente, molhar toda a superfície. Se for inserido duas vezes rapidamente na água, o ar fica preso e aparecerá como manchas brancas na membrana. A proteína não será transferida para essas áreas.

Quando a membrana estiver completamente molhada, equilibre-a por 10 a 15 minutos e transfira o tampão. Este procedimento de umedecimento funciona para membranas de nitrocelulose e nylon. Apenas as membranas de PVDF são hidrofóbicas e não se molham simplesmente por serem colocadas em água destilada ou transferidas. Buffer.

As membranas de PVDF devem primeiro ser imersas em metanol a 100% por um a dois segundos e, em seguida, equilibrar por 10 a 15 minutos. No buffer de transferência. Não deixe a membrana secar em nenhum momento.

Se isso ocorrer, molhe novamente com metanol e, em seguida, com o tampão de transferência. Quando a membrana estiver pronta, coloque a membrana pré-umedecida diretamente na parte superior do gel. Lembre-se de remover todas as bolhas de ar entre o gel e a membrana rolando suavemente uma haste de vidro de tubo de ensaio ou rolo BioRad sobre a superfície da membrana.

Em seguida, molhado, outro pedaço de papel de filtro watman de três mm. Em seguida, coloque-o em cima da membrana e, novamente, remova todas as bolhas de ar. Em seguida, coloque outra almofada ou esponja scotch bright em cima deste papel de filtro.

Conclua a montagem do sanduíche de immunoblot travando a metade superior do de transferência no lugar. Agora que o sanduíche de immuno blot está montado, estamos prontos para transferir as proteínas do gel para a membrana. Para iniciar o procedimento de transferência, encha o tanque de eletrotransferência com tampão de transferência e coloque o de transferência contendo o sanduíche no aparelho de eletrotransferência.

É importante para o sanduíche para que a membrana fique voltada para o ânodo ou lado carregado positivamente do tanque. Conecte os fios da fonte de alimentação aos lados correspondentes do ânodo e do cátodo do aparelho de eletroborrão. Este mata-borrão de critério específico vem com um bloco de gelo de resfriamento.

Agora, proteínas eletroforéticas de transferência do gel para a membrana por 30 a 60 minutos a 50 volts com resfriamento ou durante a noite a 14 volts em uma câmara fria. Quando a transferência estiver concluída, desligue a fonte de alimentação e desmonte o aparelho. Em seguida, remova a membrana do aparelho de mata-borrão e observe a orientação cortando um canto.

Neste ponto, as membranas podem ser secas e armazenadas em um saco plástico que pode ser fechado novamente a quatro graus Celsius por um ano. Antes do processamento posterior, as membranas de PVDF secas devem ser colocadas em uma pequena quantidade de 100% de metanol para molhar a membrana. Em seguida, em água destilada para remover o metanol.

Uma vez marcada a orientação, manche o gel para verificar a eficiência da transferência. Para visualizar as proteínas transferidas, você pode corar a membrana reversivelmente com rubi cipro ou irreversivelmente com tinta azul kamasi, azul naftol ou ouro coloidal. Esses procedimentos de coloração irreversíveis são incompatíveis com as membranas de nylon.

Agora que as proteínas são transferidas para a membrana, prossiga com a imunosondagem e a detecção visual das proteínas. Nesta etapa, as proteínas imobilizadas na membrana são sondadas com anticorpos específicos para identificar e quantificar quaisquer antígenos presentes. Para começar, coloque a membrana em uma bandeja de incubação de plástico com 20 mililitros de tampão de bloqueio.

Algumas pessoas usam sacolas, mas as bandejas são frequentemente usadas, pois são especialmente úteis ao processar um grande número de tiras em diferentes soluções de anticorpos primários. Em seguida, incube a membrana selada por 30 a 60 minutos à temperatura ambiente com agitação em um agitador orbital ou plataforma de balanço. Enquanto a membrana está incubando, dilua o anticorpo primário e o tampão de bloqueio.

A diluição é determinada empiricamente, mas normalmente é de um a 100 a um a 1000. Para um anticorpo policlonal, um a 10 a um em 100 para sobrenadantes híbridos e maior que um a 1000 para fluidos de ácidos murinos contendo anticorpos monoclonais. Quando a incubação estiver concluída, despeje o tampão de bloqueio.

Substitua o tampão por anticorpo primário diluído e, novamente, incube por 30 a 60 minutos em temperatura ambiente com agitação constante. Em seguida, lave a membrana quatro vezes agitando com 100 mililitros. TTBS para filtros de NITROCELULOSE ou PVDF ou TBS para filtros de nylon.

Lave por 10 a 15 minutos de cada vez enquanto a membrana está sendo lavada, dilua o anticorpo secundário no tampão de bloqueio. Exemplos de anticorpos secundários incluem peroxidase de rabanete ou fosfatase alcalina, conjugado anti-IG, conjugado enzimático comercialmente disponível. Os anticorpos secundários são geralmente diluídos de um a 200 a um a 25.000 antes do uso.

Após a conclusão das etapas de lavagem e o descarte dos materiais de lavagem, adicione peroxidase de rabanete diluída ou fosfatase alcalina, conjugado anti-IG e incube por 30 a 60 minutos em temperatura ambiente com agitação constante. Após 30 a 60 minutos, remova a membrana da lixeira e lave-a quatro vezes, 10 a 15 minutos de cada vez. No TTBS, conforme descrito anteriormente.

Assim que as lavagens estiverem concluídas, estamos prontos para prosseguir com a etapa de visualização. Mas primeiro, demonstraremos um procedimento alternativo de imunosondagem. Este procedimento alternativo de imunosondagem é baseado no kit de coloração vetorial A BC da Vector Labs.

Ele usa um complexo de biotina avidana para anexar peroxidase de rabanete ou HRPO ou fosfatase alcalina AAP ao anticorpo secundário biotinilado. Hoje estaremos demonstrando o kit HRPO. O TTBS é adequado como um tampão de bloqueio para sistemas de biotina avadon.

Mas para filtros de nylon, os reagentes de ligação a proteínas são recomendados porque o leite em pó desnatado contém biotina residual, o que interferirá no imunoensaio. Deve ser usado na etapa de bloqueio apenas para começar a equilibrar a membrana no tampão de bloqueio em uma bandeja aberta com agitação constante usando um agitador orbital ou plataforma de balanço. Incube a membrana por 30 a 60 minutos em temperatura ambiente enquanto a membrana está se equilibrando.

Prepare a solução primária de anticorpos. Use TTBS para membranas de NITROCELULOSE ou PVDF com Aden de alta sensibilidade. Sistemas de biotina.

A diluição de cera contendo anticorpos primários geralmente varia de um em 1000 a um em 100.000. O uso da química quimioluminescente requer a maior faixa de diluições. No nosso caso, demonstrando cromogênico.

Estamos usando uma diluição de um em 5.000 do primário. Assim que o equilíbrio for feito, remova o buffer de bloqueio. Em seguida, adicione solução de anticorpo primário suficiente para cobrir a membrana.

Incube a membrana por 30 minutos em temperatura ambiente com um balanço suave após 30 minutos. Lave a membrana três vezes em TTBS para nitrocelulose em intervalos de cinco minutos Durante a etapa de lavagem, prepare a solução de anticorpo secundário biotinilado diluindo uma gota de anticorpo biotinilado com 10 mililitros de TTBS. Uma vez concluídas as etapas de lavagem, adicione a solução de anticorpos secundários.

Incube a membrana por 30 minutos à temperatura ambiente com balanço lento enquanto a membrana está sendo incubada com anticorpo secundário. Prepare o avadon biotina HRPO para fazer isso. Misture duas gotas de reagente de coloração A e duas gotas de reagente B em 10 mililitros.

TTBS para nitrocelulose. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente quando a incubação do anticorpo secundário estiver completa. Lave a membrana três vezes em um período de 15 minutos com TTBS ou TBS.

Em seguida, adicione a solução enzimática de biotina avidan à membrana e incube por 30 minutos em temperatura ambiente com balanço lento. Em seguida, lave a membrana três vezes em intervalos de 10 minutos com TTBS. Agora que o procedimento de imunosondagem está completo, as proteínas ligadas à membrana estão prontas para serem visualizadas com substratos cromogênicos.

Para esta etapa final de visualização, os substratos quatro CN dab slash ICL dois e TMB são comumente usados com procedimentos de imunodetecção baseados em rabanete e peroxidase. Se a lavagem final da membrana durante o procedimento de imunossonda foi realizada em TTBS, lave-se a membrana por 15 minutos em temperatura ambiente e 50 mililitros. TBS agora coloca a membrana em solução de visualização cromogênica.

As bandas de proteína devem aparecer em 10 a 30 minutos. Após a incubação de 30 minutos, descarte a mistura de reação do substrato e termine a reação adicionando água destilada. O immunoblotting é um procedimento de várias etapas usado por milhares de laboratórios para detectar a presença de proteínas específicas após uma eletroforese ou eletroforese 2D.

Acabei de mostrar como realizar uma análise imunológica de sangue. Então é isso. Boa sorte com seus experimentos e obrigado por assistir.