Name: RNA de interferência em Carrapatos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprenda a técnica de RNA de interferência em carrapatos por injeção de dsRNA para silenciar genes específicos. Este método permite estudar a biologia de carrapatos e desenvolver estratégias de controle de doenças transmitidas por esses vetores.

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Agradecemos a membros de nossos laboratórios para discussões frutíferas e assistência técnica. Esta apresentação de vídeo foi apoiado pelo Reitor de Pesquisa e do Departamento de Patobiologia Veterinária, Centro de Ciências da Saúde Veterinária, Oklahoma State University. A pesquisa foi financiada pelo Ministério de Ciencia e Innovación, Espanha (projeto BFU2008-01244/BMC), o projeto CSIC intramural PA1002451 de JF, o Walter R. Sitlington cadeira dotada de Pesquisa Animal Food para KMK, 2009 CVHS RAC concessão, EOAs animais Fundos de Saúde e USDA, National Research Grant Initiative Competitiva, n º 2007-04613.

1. Geração de dsRNA. <ol><li> Sintetizar primers contendo seqüências de promotor T7 para transcrição in vitro ea síntese de dsRNA (por exemplo, para Dermacentor variabilis subolesin usar primers D8AAT75: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 'e D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3'). </li><li> Amplificar gene-alvo por RT-PCR utilizando 10 pmol de cada primer oligonucleotídeo e ng 1-10 de RNA total de carrapatos. </li><li> Purificar o produto da PCR. </li><li> Sintetizar dsRNA com 8 mL do produto da PCR purificada. </li><li> Quantificar dsRNA por espectrometria. </li></ol> 2. Injeção de Carrapatos com dsRNA. 2.1. Preparação de carrapatos injectável. <ol><li> Primeiro, lave a carrapatos em uma série de soluções, agitando-os em cada solução em um tubo de centrífuga de 50 mL descartáveis, decantação a solução através de uma tela fina malha de arame sobre a parte superior do tubo para manter os carrapatos. A seqüência das soluções para os carrapatos de lavagem é a água da torneira, peróxido de hidrogênio 3%, duas lavagens de água destilada, o etanol 70% e duas lavagens mais com água destilada. </li><li> Blot-seque a carrapatos em toalhas de papel. </li><li> Contar os carrapatos em grupos de 20 a 50, dependendo do experimento, coloque os carrapatos de cada grupo em um copo de plástico 1,25 onças com uma tampa bem ajustada e etiqueta com o número do grupo experimental. </li></ol> 2.2. Tick ​​equipe de injeção. A equipe de RNAi consiste em três pessoas: (1) uma pessoa que posições cada instante em fita adesiva dupla afixada a uma folha de cera dental vermelho, (2) uma pessoa que injeta os carrapatos e (3) uma pessoa que monitora os carrapatos após injeção, respira de CO 2 na carrapatos para ativá-las e conta os carrapatos que vivem em copos marcados com o número do grupo experimental. Todos os membros da equipe devem usar luvas descartáveis. 2.3. Colocação de carrapatos injectável. <ol><li> Captura de um carrapato com pinças Dumont fina e colocá-lo lado ventral em fita adesiva dupla aposta num 3 "x 6" folha de cera dental vermelho. Os carrapatos estão intimamente posicionados juntos em grupos de 5 carrapatos. </li><li> Coloque uma pequena tira de fita adesiva sobre o aparelho bucal de todos os cinco carrapatos, a fim de diminuir as deles, mas deixando a maior parte do corpo exposto para que o processo de injeção pode ser observado pelo carrapato injetor (Figura 1). </li></ol> 2.4. Injeção de carrapatos. <ol><li> Os carrapatos serão injetados no quadrante inferior direito da superfície ventral do exoesqueleto. </li><li> Primeiro, faça um furo no exoesqueleto usando uma seringa de insulina Monoject equipado com um ½ ", agulha de calibre 29 (Figura 2a). </li><li> Injetar carrapatos imediatamente com 0,2-0,5 mL de solução de dsRNA (5 x 10 10 - 5 x 10 11 moléculas por mL), utilizando uma custom-made seringa Hamilton com uma polegada de 1, 33 agulha com um ponto de 45 ° chanfrado (Figura 2b) . A agulha deve ser colocada bem na cavidade carrapato para assegurar a colocação e retenção do dsRNA. Algum fluido é provável que escapar do local da injeção (Figura 2c). Cuidados devem ser tomados para não mais de injetar os carrapatos, o que causaria perda de hemolinfa e pode causar a morte do carrapato. </li><li> Limpe a seringa Hamilton depois de completar as injeções em cada grupo experimental. antes de usar para outro grupo experimental. Encha a seringa primeira de um copo contendo peróxido de hidrogênio 3% e, em seguida, expelir em um recipiente de resíduos, e repita 15 vezes. Encha a seringa de um copo contendo água estéril e, em seguida, expelir em um recipiente de resíduos, e repita 15 vezes. Tome cuidado para não dobrar o êmbolo da seringa de Hamilton, porque, se dobrado, o êmbolo não irá mover-se suavemente e responder ao toque suave necessária para injeção de carrapatos. </li></ol> 2.5. Tratamento de carrapatos após a injeção. <ol><li> Pegar o carrapato injetado imediatamente a partir da fita adesiva dupla com a pinça fina e colocá-lo em um recipiente de recuperação de plástico (cerca de 6 "x 6" e cercado com fita adesiva para evitar o escape dos carrapatos). Os carrapatos serão brevemente inativos após a injeção, mas deverá em breve começar a engatinhar ao redor do prato. </li><li> Respiração CO 2 para os carrapatos imediatamente após colocá-los no recipiente de recuperação para ajudar a ativar os carrapatos. Uma vez que os carrapatos estão rastejando e ativa, a ferida vai curar injeção rapidamente e eles provavelmente irão sobreviver. </li><li> Contar os ticks de acordo com o número em cada grupo experimental e os coloque em um copo de plástico rotulados com uma tampa bem equipado. Carrapatos substituição deve ser injetado para substituir qualquer que qualquer morreu antes de injetar o próximo grupo experimental. </li></ol> 2.6. Tick ​​exploração. <ol><li> Coloque os carrapatos em uma câmara de umidade (12h de luz: 12 hr fotoperíodo escuro, a 22-25 ° C e 95% em relação humidity) e segure por um dia. </li><li> Carrapatos lugar no carrapato-alimentação células, uma por grupo experimental, colada a uma ovelha e permitir-lhes para se alimentar com um número igual de uninjected carrapatos masculina ou feminina (o que o sexo não foi injetado). Carrapatos fêmeas que se alimentam de reposição, aqueles que são retirados da ovelha após 10 dias de alimentação, ou quando as fêmeas controle têm deixado o anfitrião são coletados e pesados. </li><li> Coloque os carrapatos em caixas de cartão, e segure a câmara de umidade até a conclusão de oviposição. Avaliar oviposição pela ponderação das massa de ovos produzidos por todos os carrapatos no grupo. </li></ol> 2.7. Análise do fenótipo tick após RNAi. <ol><li> Avaliar carrapato fenótipo após a alimentação, determinando o número de carrapatos que sobreviveram, peso carrapato, oviposição e fertilidade dos ovos. No entanto, outras análises podem ser realizadas, dependendo do gene-alvo e objetivos do estudo. </li></ol> 3. Análise para confirmar o silenciamento do gene por RT-PCR. <ol><li> Dissecar as glândulas salivares e tripas de carrapatos individuais de grupos de controle de injeção e dsRNA injetado após a alimentação. </li><li> Extrato de RNA total de amostras de tecido individual. </li><li> Analisar as transcrições gene alvo nos tecidos individuais por real-time RT-PCR e normalizar os níveis de RNA contra o 16S rRNA tick usando o método genNorm (método ddCT implementada pelo Bio-Rad iQ5 Standard Edition, versão 2.0). </li><li> Executar curvas de dissociação no final da reação para garantir que apenas um amplicon é formada e que a desnaturar amplicons consistentemente na faixa de temperatura mesmo para cada amostra. </li><li> Comparar os níveis de mRNA (valores normalizados Ct) entre o controle com injeção e dsRNA injetado carrapatos usando o Student `s t-test (P = 0,05). </li></ol> 4. Resultados representativos: O protocolo aqui descrito tem sido utilizado em nosso laboratório para RNAi em muitas diferentes espécies de carrapatos ixodídeos (Tabela 1). A quantidade de dsRNA injetado no carrapatos varia com o tamanho do carrapato; espécies maiores carrapato pode acomodar um grande volume. Carrapatos controle negativo deve ser injectado com um dsRNA não relacionados. DsRNAs diversas, tais como subolesin 14-19,22-25,27-32,34 e beta-actina 20,21 pode ser usado como controle positivo. Note que é importante lavar a seringa entre os tratamentos para evitar soluções de mistura dsRNA. Se o protocolo for feito corretamente, menos de 5% de mortalidade deve ser obtido a partir do procedimento de injeção após 24 horas. Um fenótipo típico após knockdown do gene em carrapatos é mostrado na Figura 3, com um painel de carrapatos injetados com piscinas de dsRNA, a fim de tela para assinalar antígenos protetores. <table border="1"><tbody><tr><td> Tick ​​espécies </td><td> dsRNA injetado </td><td> Referências </td></tr><tr><td> Scapularis Ixodes </td><td> biblioteca de cDNA, subolesin, actina, nucleotidase, NF-kB, akirin </td><td> 21, 22, 29, 30 </td></tr><tr><td> Dermacentor variabilis </td><td> subolesin, GST, ubiquitina, vATPase, selenoproteínas M e W2a, tronco hematopoiéticas / progenitoras proteína-like, actina subunidade 26S Proteassoma, ferritin1, varisin, akirin </td><td> 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 </td></tr><tr><td> Dermacentor marginatus </td><td> subolesin </td><td> 22 </td></tr><tr><td> Amblyomma americanum </td><td> biblioteca de cDNA, subolesin, akirin </td><td> 17, 22, 30 </td></tr><tr><td> Amblyomma hebraeum </td><td> subolesin, voraxin </td><td> 28 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus sanguineus </td><td> Rs86, subolesin </td><td> 22, 23 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus microplus </td><td> GST, ubiquitina, selenoproteína, Bm86, Bm91, subolesin, GI, GIII, EF1a, flagelliform proteína de seda, von Willebrand fator </td><td> 16, 18, 25, 27 </td></tr><tr><td> Annulatus Rhipicephalus </td><td> ubiquitina, subolesin, EF1a, GIII </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Tick espécies em que o protocolo de RNAi tem sido utilizado. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Colocação de carrapatos, o lado ventral para cima, sobre fita adesiva dupla adere a uma folha de cera dental vermelho. Os carrapatos são colocados em grupos de 5, após o qual uma pequena tira de fita adesiva é colocada sobre o aparelho bucal, a fim de proteger ainda mais os carrapatos, permitindo que o injector para observar o corpo do carrapato durante a injeção. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. O procedimento de injeção inclui (a) perfuração no quadrante inferior direito do exoesqueleto do carrapato com uma insulina de syringe com uma agulha calibre 29, a fim de criar um local da injeção, (b) a injeção imediata do dsRNA neste site, utilizando uma seringa Hamilton com uma agulha de calibre 33, que (c) muito provavelmente vai resultar em algum vazamento de hemolinfa carrapato / fluidos. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Um painel de carrapato seis grupos em que RNAi foi utilizado para triagem de antígenos carrapato Amblyomma americanum protetora em. As mudanças fenotípicas em carrapatos pode ser visto quando comparado com o positivo subolesin RNAi controle eo controle dsRNA negativas não relacionadas. Neste experimento o efeito do RNAi na mortalidade carrapato, pesos e oviposição de cada grupo foram analisados ​​estatisticamente.

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<li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+silencing+of+the+subolesin+gene+in+three-host+ixodid+tick+species+after+injection+of+replete+females+with+subolesin+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Transovarial silencing of the subolesin gene in three-host ixodid tick species after injection of replete females with subolesin dsRNA.</a> Parasitol. Res. 100, 1411-1415 (2007).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+tick-pathogen+interface+for+novel+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Targeting the tick-pathogen interface for novel control strategies.</a> Front. Biosci. 13, 6947-6956 (2008).</li>
<li>Kurscheid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+tick+RNAi+pathway+by+comparative+genomics+and+reverse+genetics+screen+of+targets+with+known+loss-of-function+phenotypes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila.</a> BMC Mol. Biol. 10, 26-26 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Embora outros métodos têm sido descritos para RNAi em carrapatos 14, 33, a injeção de dsRNA aqui descrito é o mais utilizado em ambos os jejum (Tabela 1) e carrapatos alimentados 16,25,34. RNAi tem se mostrado uma ferramenta valiosa para o estudo da função dos genes carrapato, a caracterização da interface carrapato-patógeno e ao rastreio e caracterização de antígenos de carrapatos de proteção 14,35. Em particular, RNAi se tornou a ferramenta mais valiosa para análises funcionais em carrapatos 35. Metodologicamente, RNAi provavelmente evoluir para métodos mais eficientes que podem permitir knockdown do gene em um grande número de indivíduos. O mecanismo de dsRNA induzida por RNAi em carrapatos deve ser refinado para contribuir para uma melhor compreensão e utilização desta abordagem genética nesta espécie 35,36. A extensão de fora do alvo os efeitos da RNAi em carrapatos também é uma questão importante que precisa ser totalmente dirigida 14,27. Finalmente, RNAi provavelmente irá fornecer contribuições ao estudo abrangente da regulação de genes e carrapato biologia de sistemas e do carrapato-patógeno interface e pode ter um impacto sobre o desenvolvimento de vacinas para controlar a infestação de carrapatos e de transmissão de patógenos por carrapatos.

<table><tbody><tr><td>Sistema Access RT-PCR</td><td>Promega</td><td>A1250</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificação Purelink PCR</td><td>Invitrogen</td><td>K3100-02</td><td></td></tr><tr><td>Kit Megascript RNAi</td><td>Ambion</td><td>AM1626M</td><td></td></tr><tr><td>Cera vermelha para dentista</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72674</td><td></td></tr><tr><td>Copos plásticos, 1,25 oz, com tampas</td><td>Solo Cup Company, Urbana Ill.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Vários</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina</td><td>Monoject</td><td></td><td>Equipada com agulha de 29 graus, &amp;#189;&quot;</td></tr><tr><td>Seringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>701SN,33/.375&amp;#8221;/45DGR</td><td>Feita sob encomenda</td></tr><tr><td>TriReagente</td><td>Sigma</td><td>93289</td><td></td></tr><tr><td>Kit iScript One-Step RT-PCR com SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8892</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de detecção de PCR em tempo real</td><td>Bio-Rad</td><td>Vários</td><td>Consulte &lt;a href=&quot;http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

rna de interferência em carrapatos

RNA Interference in Ticks

Carrapatos são ectoparasitas hematófagos obrigatórios de animais selvagens e domésticos e seres humanos, e são considerados em todo o mundo segundo a mosquitos como vetores de doenças humanas 1 e os vetores mais importantes que afetam pecuária em todo o mundo 2. Carrapatos são classificados na subclasse Acari, Parasitiformes ordem, subordem Ixodida e são distribuídas em todo o mundo a partir do Ártico para as regiões tropical 3. Apesar dos esforços para controlar a infestação de carrapatos, estes ectoparasitas continuar a ser um problema sério para a saúde humana e animal 4,5. Interferência de RNA (RNAi) 6 é uma abordagem inversa à base de ácido nucléico genética que envolve a interrupção da expressão do gene, a fim de determinar a função do gene ou o seu efeito em uma via metabólica. Pequenos RNAs de interferência (siRNAs) são as moléculas efetoras da via RNAi que é iniciado pelo double-stranded RNA (dsRNA) e resulta em um potente seqüência específica de degradação de mRNAs citoplasmáticos contendo a mesma seqüência como o gatilho dsRNA 7-9. Pós-transcricional mecanismos de silenciamento de genes iniciado por dsRNA foram descobertas em todos os eucariotos estudados até agora, e RNAi foi rapidamente desenvolvido em uma variedade de organismos como uma ferramenta para estudos de genômica funcional e outras aplicações 10. RNAi tem se tornado a mais utilizada técnica de silenciamento de genes em carrapatos e outros organismos em que as abordagens alternativas para a manipulação genética não estão disponíveis ou são pouco confiáveis ​​5,11. A caracterização genética de carrapatos tem sido limitado até que a recente aplicação de RNAi 12,13. No pouco tempo que RNAi tem sido disponível, ele provou ser um instrumento valioso para estudar a função do gene carrapato, a caracterização da interface carrapato-patógeno e ao rastreio e caracterização de antígenos de carrapatos de proteção 14. Aqui, um método para RNAi através da injeção de dsRNA em carrapatos em jejum é descrito. É provável que o conhecimento adquirido a partir desta abordagem experimental contribuirá significativamente para a compreensão dos sistemas biológicos básicos e ao desenvolvimento de vacinas para controlar a infestação de carrapato e prevenir a transmissão de patógenos por carrapatos 15-19.

Um método para a interferência de RNA (RNAi) pela injeção de dsRNA em carrapatos em jejum é descrito. RNAi é a mais utilizada técnica de silenciamento de genes em carrapatos onde o uso de outros métodos de manipulação genética tem sido limitado.

RNA de interferência em Carrapatos

Os carrapatos são ectoparasitas hematófagos obrigatórios de animais silvestres, domésticos e humanos, e são considerados os segundos vetores mais importantes do mundo, depois dos mosquitos...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a técnica de interferência por RNA em carrapatos por meio de injeção. Isso é realizado primeiramente sintetizando RNA de fita dupla do gene ou dos genes de interesse. O RNA é então injetado nos carrapatos, que posteriormente são mantidos em uma câmara de umidade por 24 horas.Após esse período de espera, permite-se que os carrapatos se alimentem de um animal, como uma ovelha. Parâmetros de alimentação, como peso, muda e posição dos ovos, bem como a expressão do gene ou dos genes de interesse por meio de RT-PCR em tempo real, são determinados. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram o efeito do silenciamento dos genes-alvo na biologia do carrapato mediante a avaliação dos parâmetros biológicos do carrapato e da expressão gênica por RT-PCR em tempo real.Nosso grupo trabalha com carrapatos, buscando caracterizar eventos moleculares na interface carrapato-patógeno, utilizando essas informações básicas para desenvolver métodos de controle da infestação por carrapatos e da transmissão de patógenos para humanos e animais. A interferência por RNA surgiu como uma ferramenta essencial nesta pesquisa, pois é o único método disponível para manipulação genética de carrapatos. A função de muitos genes de carrapatos é desconhecida.A interferência de RNA permite definir o papel dos genes e da expressão gênica em carrapatos em diversos aspectos da biologia desses organismos, incluindo acasalamento, reprodução, alimentação, digestão, função das glândulas salivares e competência vetorial na transmissão de patógenos. O procedimento será demonstrado pela equipe de interferência de RNA em carrapatos do nosso laboratório, o Dr. Ed Lewin, o estudante de pós-graduação Busby e eu mesmo. Para gerar RNA de fita dupla, primeiramente sintetize oligonucleotídeos iniciadores contendo sequências promotoras T7 para transcrição in vitro de RNA.Por exemplo, lesão variável no centro dérmico. Utilize os iniciadores oligonucleotídicos D oito A a T 75 e D oito DVT 73 mostrados aqui. Amplifique o gene alvo por R-T-P-C-R usando 10 picomoles de cada iniciador oligonucleotídico e de um a 10 nanogramas de RNA total de carrapato.Em seguida, purifique o produto da PCR. Depois, utilize oito microlitros ou aproximadamente 100 nanogramas para sintetizar RNA de fita dupla. Para preparar os carrapatos para injeção, primeiro lave os carrapatos na seguinte série de soluções: água da torneira, peróxido de hidrogênio a 3%, água destilada duas vezes, etanol a 70% e duas lavagens finais com água destilada.Realize cada lavagem em um tubo cônico descartável de 50 mililitros agitando. Em seguida, decante a solução por meio de uma peneira de malha fina. Seque os carrapatos em papel toalha e, depois, distribua-os em alíquotas de 20 a 50, dependendo do experimento.Coloque cada grupo em um copo plástico de 1,25 onça com tampa hermética e rotule cada copo com o grupo experimental. Em seguida, forme uma equipe de RNAi composta por três pessoas que realizarão o processo de injeção. A primeira pessoa posiciona cada carrapato em uma fita adesiva dupla fixada em uma folha de cera dental vermelha de três por seis polegadas.A segunda pessoa injeta os carrapatos e a terceira monitora os carrapatos após a injeção, soprando dióxido de carbono sobre eles para ativá-los, e conta e transfere os carrapatos vivos para copos rotulados com o número do grupo experimental. Todos os membros da equipe devem usar luvas descartáveis. Para iniciar o processo de injeção de carrapatos, capture um carrapato usando pinça fina Dumont e coloque-o com a face ventral voltada para cima sobre fita adesiva dupla fixada na folha de cera vermelha para dentista. Posicione os carrapatos em grupos de cinco. Coloque uma pequena tira de fita crepe sobre as peças bucais dos cinco carrapatos.Para restringi-los ainda mais, deixe a maior parte do corpo exposto para que o processo de injeção possa ser observado pelo injetor de carrapatos. Para injetar o carrapato, perfure um orifício no quadrante inferior direito da superfície ventral do exoesqueleto usando uma seringa de insulina mono eject com agulha de 29 graus e meia polegada. Em seguida, injete imediatamente nos carrapatos de 0,2 a 0,5 microlitros de solução de RNA de fita dupla usando uma seringa Hamilton personalizada e uma agulha de 33 graus com uma polegada de comprimento e ponta biselada de 45 graus, inserindo bem a agulha na cavidade do carrapato para garantir a colocação e retenção do RNA de fita dupla.Embora o fluido seja liberado após a injeção, a colocação profunda da agulha para injeção garantirá que uma quantidade suficiente de RNA de fita dupla seja depositada na cavidade do carrapato para induzir o silenciamento gênico; deve-se ter cuidado para não exagerar. Injete os carrapatos, o que causará perda de hemolinfa e morte do carrapato. Imediatamente após a injeção, levante os carrapatos da fita adesiva dupla com pinça fina e coloque-os em um recipiente plástico de recuperação.As carrapatos permanecerão brevemente inativos após a injeção, mas logo deverão começar a se movimentar pelo recipiente. Ative os carrapatos soprando dióxido de carbono sobre eles. Assim que os carrapatos estiverem se movendo e ativos, a ferida da injeção cicatrizará rapidamente e eles provavelmente sobreviverão.Conte os carrapatos em cada grupo experimental e coloque cada grupo em um copo plástico rotulado com tampa bem ajustada. Substitua quaisquer carrapatos que morram no grupo atual antes de injetar o próximo grupo experimental. Limpe a seringa Hamilton antes de injetar o próximo grupo experimental preenchendo e, em seguida, expulsando a seringa com peróxido de hidrogênio a 3% fresco.15 vezes, seguido por 15 lavagens com água estéril. Tenha cuidado para não dobrar o êmbolo da seringa Hamilton, caso contrário o êmbolo não se moverá suavemente e não responderá ao toque suave necessário para a injeção em carrapatos. Após a injeção, coloque os carrapatos em uma câmara com um recipiente contendo água e sulfato de potássio, o que mantém alta umidade e os conserva por um dia.Em seguida, coloque carrapatos individuais em células de alimentação coladas a um carneiro e permita que se alimentem junto com um número igual de carrapatos machos ou fêmeas não injetados, conforme o sexo que não foi injetado. Colete e retire os carrapatos fêmeas da célula de alimentação após eles completarem a alimentação, por volta de 10 dias, ou quando as fêmeas controle tiverem se desprendido do hospedeiro. Incube cada grupo de carrapatos em câmara de umidade até a conclusão da postura de ovos. Avalie a postura de ovos por grupo pesando a massa de ovos produzida por todos os carrapatos de um grupo, a fim de avaliar o fenótipo dos carrapatos após a alimentação.Determine o número de carrapatos que sobreviveram e calcule o peso dos carrapatos, bem como a posição das ovas e a fertilidade dos ovos. Dependendo do gene-alvo e dos objetivos do estudo, outras análises podem ser realizadas para confirmar o silenciamento gênico por R-T-P-C-R. Após a alimentação, dissecar as glândulas salivares e os intestinos de carrapatos individuais dos grupos injetados com controle e com RNA de fita dupla, e então extrair o RNA total das amostras individuais de tecido.Analise os transcritos do gene-alvo em tecidos individuais por meio de R-T-P-C-R em tempo real e normalize os níveis de RNA em relação ao RNA ribossomal 16 s de carrapatos. Utilizando o método gene norm, execute curvas de dissociação ao final da reação para garantir que apenas um amplicon seja formado e que os amplicons desnaturem consistentemente na mesma faixa de temperatura para cada amostra; compare os valores de CT normalizados para os níveis de mRNA entre carrapatos injetados com controle e carrapatos injetados com RNA de dupla fita utilizando o teste T de Student.O protocolo descrito aqui tem sido utilizado em nosso laboratório para RNAi em muitas espécies diferentes de carrapatos exóticos. A quantidade de RNA de fita dupla injetada nos carrapatos varia conforme o tamanho do carrapato. Espécies de carrapatos maiores podem acomodar um volume maior.As referências podem ser encontradas na parte escrita acompanhante do protocolo. Se o protocolo for realizado corretamente, deve-se obter menos de 5% de mortalidade após o procedimento de injeção em 24 horas. Um fenótipo típico após a silenciamento gênico em carrapatos é mostrado aqui, onde um painel de carrapatos foi injetado com pools de RNA de fita dupla que foram utilizados para triagem de antígenos protetores em carrapatos.Em carrapatos examinados por microscopia de luz, pode-se observar degeneração celular nos tecidos dos carrapatos. Alterações fenotípicas também podem ser acompanhadas por perda de função. Por exemplo, o RNAi de SUBIN resulta em machos estéreis que não conseguem acasalar com sucesso com as fêmeas após interferência por RNA e carrapatos.Outros métodos podem ser utilizados para determinar o impacto do silenciamento gênico na expressão gênica e proteica e na biologia do carrapato, incluindo R-T-P-C-R em tempo real, microscopia eletrônica de luz ou confocal. Genômica ou proteômica. A interferência por RNA também pode ser realizada em culturas de células de carrapatos e fornece um método in vitro para o estudo das interações entre patógenos e células de carrapatos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Estudos de pesquisa a doença de Lyme muitas vezes exigem a geração de carrapatos infectados com o patógeno Borrelia burgdorferi, um processo que normalmente leva várias semanas. Aqui nós demonstramos uma microinjeção baseado procedimento de infecção do carrapato que pode ser realizado em poucas horas. Nós também demonstramos um método de imunofluorescência para na localização in situ de B. burgdorferi dentro de carrapatos.

Métodos para a transferência rápida e localização de Patógenos Doença de Lyme no intestino Tick

A doença de Lyme é a doença mais comumente relatados transmitidas por vetores na América do Norte. O agente causador, a Borrelia burgdorferi é uma bactéria espiroqueta transmitida por carrapatos ixodídeos. A transmissão e a detecção de infecção em modelos animais é optimizada pela utilização de alimentação de carraça, que aqui descrita.

Alimentação dos Carrapatos em Animais de Transmissão e Xenodiagnóstico em Lyme Disease Research

A produção de carrapatos criadas em laboratório saudáveis ​​é essencial para estudos sobre a biologia carrapato, e carrapato-patógeno interações. Aqui demonstramos um protocolo simples para a alimentação carrapato imaturo que é rentável e menos stressante para ratinhos.

Criação<em&gt; Ixodes scapularis,</em&gt; O Ticked Black-legged: Alimentando estágios imaturos em ratos

PCR aninhado é uma técnica simples, sensível e específica que pode ser aplicada a escala que DNA extrai para sondar para Borrelia burgdorferi, o agente causador da doença de Lyme. A experiência inicial da PCR usa primeiras demão gene-específico para gerar amplicons longo, que em seguida tornar-se modelos para uma reação subsequente usando iniciadores internos.

Detectando a doença de Lyme espiroqueta, a Borrelia Burgdorferi, em carrapatos usando PCR aninhado

Aqui nós apresentamos um protocolo de sequenciamento de próxima geração para sequenciação de rRNA 16S, que permite a identificação e caracterização das comunidades microbianas na vetores. Este método envolve a extração de DNA, amplificação e código de barras das amostras através de PCR, sequenciamento em uma pilha de fluxo e bioinformática para combinar dados de sequência de informação filogenética.

Caracterização de Microbiome carrapato de próxima geração 16S rRNA Amplicon sequenciação

Neste estudo, foi desenvolvido um sistema de alimentação para estágios ninfais e larvais de carrapato duro utilizando-se uma cápsula ligada ao rato de laboratório. A cápsula de alimentação é feita de materiais flexíveis e permanece firmemente presa ao mouse por pelo menos uma semana e permite um monitoramento confortável da alimentação do carrapato.

Um modelo baseado em cápsulas para infestação de estágios de carrapato duro imaturo em ratos de laboratório

O presente protocolo descreve o isolamento de microRNAs de glândulas salivares de carrapatos e vesículas extracelulares purificadas. Este é um procedimento universal que combina reagentes e suprimentos comumente usados. O método também permite o uso de um pequeno número de carrapatos, resultando em microRNAs de qualidade que podem ser facilmente sequenciadas.

Isolamento de microRNAs de Tick Ex Vivo Culturas de Glândulas Salivares e Vesículos Extracelulares

Apresentado aqui é um método para alimentar carrapatos no sangue in vitro através de um sistema de membrana artificial para permitir o ingurgitamento parcial ou total de uma variedade de estágios de vida do carrapato.

Carrapato Alimentação por Membrana Artificial para Ixodes scapularis

Este artigo apresenta a metodologia para exposição humana a larvas de Ixodes scapularis para pesquisa clínica. A técnica é relativamente simples, tolerável pelos voluntários da pesquisa, podendo ser modificada de acordo com as necessidades experimentais. Essa pesquisa envolvendo seres humanos deve ser conduzida de acordo com protocolos de estudos clínicos aprovados pelas autoridades reguladoras apropriadas.

Um modelo para exposição experimental de humanos a larvas de carrapatos Ixodes scapularis

Aqui, apresentamos um protocolo para coletar saliva, hemolinfa, glândulas salivares e intestino médio, após a dissecção de um carrapato alimentado individualmente, para estudar a localização específica do tecido de patógenos transmitidos por carrapatos para avançar na compreensão da competência do vetor e das interações patógeno-microbioma.

Extração de saliva, hemolinfa, glândulas salivares e intestino médio de carrapatos individuais (Acari: Ixodidae)

Este método descreve o desenvolvimento de um sistema de alimentação sanguínea de carrapatos in vitro , incorporando uma câmara impressa em 3D e uma membrana de silicone fabricada em laboratório. O sistema permite a alimentação artificial de carrapatos, facilitando a amostragem em vários estágios de alimentação e utilizando baixos volumes de sangue, fornecendo uma ferramenta inestimável para estudar carrapatos ixódidas.

Sangue de carrapato se alimentando através de uma membrana artificial em uma câmara impressa em 3D em pesquisa de carrapatos Ixodid

Aprenda a técnica de RNA de interferência em carrapatos por injeção de dsRNA para silenciar genes específicos. Este método permite estudar a biologia de carrapatos e desenvolver estratégias de controle de doenças transmitidas por esses vetores.

RNA de interferência em Carrapatos

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