RNA de interferência em Carrapatos

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a técnica de interferência de RNA em carrapatos por injeção. Isso é feito primeiro sintetizando RNA de fita dupla do gene ou genes de interesse. O RNA é então injetado nos carrapatos, após o que eles são mantidos em uma câmara de umidade por 24 horas.

Após este período de espera, os carrapatos podem se alimentar de um animal, como uma ovelha, finalmente carrapato. Parâmetros de alimentação, como peso, muda e posição dos ovos, e a expressão do gene ou genes alvo de interesse por RTPC em tempo real são determinados. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstrem o efeito do silenciamento de genes direcionados na biologia do carrapato por meio da avaliação dos parâmetros biológicos do carrapato e da expressão gênica por RTPCR em tempo real.

Nosso grupo trabalha com carrapatos tentando caracterizar eventos moleculares na interface patógeno do carrapato para usar essas informações básicas para desenvolver métodos para o controle da infestação de carrapatos e a transmissão de patógenos para humanos e animais. A interferência de RNA surgiu como uma ferramenta essencial nesta pesquisa por ser o único método disponível para manipulação genética de carrapatos. A função de muitos genes de carrapatos é desconhecida.

A interferência de RNA nos permite definir o papel dos genes do carrapato e da expressão gênica em muitos aspectos da biologia do carrapato, incluindo acasalamento, reprodução, alimentação, digestão, função da glândula salivar e a competência do vetor do carrapato para a transmissão de patógenos. Demonstrando o procedimento estará a equipe de interferência de RNA de carrapato de nosso laboratório, Dr. Ed Lewin, estudante de pós-graduação e Busby e eu. Para gerar RNA de fita dupla, primeiro sintetize primers de oligonucleotídeos contendo sequências promotoras T seven para transcrição in vitro de RNA.

Por exemplo, derma center vari lesina. Use os oligonucleotídeos primers D oito A a T 75 e D oito DVT 73 mostrados aqui. Amplificar o gene alvo por R-T-P-C-R utilizando 10 picomoles de cada oligonucleótido primário e um a 10 nanogramas de RNA total de carrapatos.

Em seguida, purifique o produto de PCR. Em seguida, use oito microlitros ou aproximadamente 100 nanogramas para sintetizar RNA de fita dupla. Para preparar os carrapatos para injeção primeiro, lave-os na seguinte série de soluções, água da torneira com água destilada com peróxido de hidrogênio a 3% duas vezes, etanol a 70% e duas lavagens finais com água destilada.

Realize cada lavagem em um tubo de centrífuga descartável de 50 mililitros agitando. Em seguida, decantação da solução através de uma tela de arame de malha fina. Bloqueie os carrapatos em toalhas de papel e, em seguida, aliquote os carrapatos em grupos de 20 a 50, dependendo do experimento.

Coloque cada grupo em um copo de plástico de 1,25 onça com uma tampa bem ajustada e rotule cada copo com o grupo experimental. De seguida, monte uma equipa de RNAi composta por três pessoas que irá realizar o processo de injeção. A primeira pessoa posiciona cada carrapato em fita adesiva dupla afixada a uma folha de cera dental vermelha de três por seis polegadas.

A segunda pessoa injeta os carrapatos e a terceira monitora os carrapatos após a injeção, respira dióxido de carbono nos carrapatos para ativá-los e conta e transfere os carrapatos vivos para copos rotulados com o número do grupo experimental. Todos os membros da equipe devem usar luvas descartáveis Para iniciar o processo de injeção de carrapatos, capture um carrapato usando uma pinça fina dumont e coloque-o com o lado ventral para cima em fita adesiva dupla afixada na folha de cera dental vermelha Posicione os carrapatos em grupos de cinco. Coloque uma pequena tira de fita adesiva sobre as partes da boca de todos os cinco carrapatos.

Para contê-los ainda mais, deixe a maior parte do corpo exposta para que o processo de injeção possa ser observado pelo injetor de carrapatos. Para injetar o carrapato, faça um orifício no quadrante inferior direito da superfície ventral do exoesqueleto usando uma seringa de insulina mono ejetada equipada com uma agulha de calibre 29 de meia polegada. Em seguida, injete imediatamente os carrapatos com 0,2 a 0,5 microlitros de solução de RNA de fita dupla usando uma seringa Hamilton feita sob medida e uma agulha de calibre 33 de uma polegada com uma ponta chanfrada de 45 graus, coloque a agulha bem na cavidade do carrapato para garantir a colocação e retenção do RNA de fita dupla.

Mesmo que o fluido seja liberado após a injeção, a colocação profunda da agulha para injeção garantirá que RNA de fita dupla suficiente seja depositado na cavidade do carrapato para causar silenciamento de genes, deve-se tomar cuidado para não exagerar. Injete os carrapatos, o que causará perda de hemolinfa e morte do carrapato. Imediatamente após injetar os carrapatos, retire-os da fita adesiva dupla com a pinça fina e coloque-os em um recipiente plástico de recuperação.

Os carrapatos permanecerão brevemente inativos após a injeção, mas logo devem começar a rastejar ao redor do prato. Ative os carrapatos respirando dióxido de carbono neles. Uma vez que os carrapatos estejam rastejando e ativos, a ferida da injeção cicatrizará rapidamente e eles provavelmente sobreviverão.

Conte os carrapatos em cada grupo experimental e coloque cada grupo em um copo de plástico rotulado com uma tampa bem ajustada. Substitua todos os carrapatos que morrem no grupo atual antes de injetar o próximo grupo experimental. Limpe a seringa Hamilton antes de injetar o próximo grupo experimental, enchendo e expelindo a seringa com peróxido de hidrogênio a 3% fresco.

15 vezes seguidas de 15 lavagens com água estéril. Tome cuidado para não dobrar o êmbolo da seringa Hamilton, caso contrário, o êmbolo não se moverá suavemente e responderá ao toque suave necessário para a injeção do carrapato. Após a injeção, coloque os carrapatos em uma câmara com um recipiente cheio de água e sulfato de potássio, que mantém a umidade elevada e por um dia.

Em seguida, coloque carrapatos individuais em células de alimentação de carrapatos coladas a uma ovelha e permita que eles se alimentem com um número igual de carrapatos machos ou fêmeas injetados, qualquer que seja o sexo que não foi injetado. Colete e acene com os carrapatos fêmeas da célula de alimentação depois que eles completarem a alimentação por aproximadamente 10 dias ou quando as fêmeas de controle caírem, o hospedeiro incubará cada grupo de carrapatos na câmara de umidade até a conclusão da posição dos ovos. Avalie a posição dos ovos por grupo pesando a massa de ovos produzida por todos os carrapatos em um grupo para avaliar o fenótipo do carrapato após a alimentação.

Determine o número de carrapatos que sobreviveram e calcule o peso do carrapato, bem como a posição dos ovos e a fertilidade dos ovos. Dependendo do gene alvo e dos objetivos do estudo, outras análises podem ser realizadas para confirmar o silenciamento gênico por RTPCR. Após a alimentação, disseque as glândulas salivares e intestinos de carrapatos individuais dos grupos de controle injetado e RNA de fita dupla injetado e, em seguida, extraia o RNA total das amostras de tecido individuais.

Analise os transcritos do gene alvo em tecidos individuais por RTPC em tempo real e normalize os níveis de RNA contra o RNA ribossômico do carrapato 16. Usando o método da norma genética, execute curvas de dissociação no final da reação para garantir que apenas um amplicon seja formado e que os amplicons desnaturem consistentemente na mesma faixa de temperatura para cada amostra, compare os valores normalizados de CT para os níveis de mRNA entre o controle injetado e o de fita dupla. O RNA injetou carrapatos usando o teste T de Student.

O protocolo descrito aqui tem sido usado em nosso laboratório para RNAi em muitas espécies diferentes de carrapatos exot. A quantidade de RNA de fita dupla injetada nos carrapatos varia com o tamanho do carrapato. Espécies maiores de carrapatos podem acomodar um volume maior.

As referências podem ser encontradas na parte escrita do protocolo que acompanha. Se o protocolo for feito corretamente, menos de 5% de mortalidade deve ser obtida com o procedimento de injeção após 24 horas. Um fenótipo típico após o knockdown do gene em carrapatos é mostrado aqui, onde um painel de carrapatos foi injetado com pools de RNA de fita dupla que foram usados para rastrear antígenos protetores de carrapatos.

Em carrapatos examinados por microscopia de luz, pode ser observada degeneração celular nos tecidos do carrapato. Alterações fenotípicas também podem ser acompanhadas por perda de função. Por exemplo, o RNAI de SUBIN resulta em machos estéreis que não podem acasalar com sucesso com as fêmeas após interferência de RNA e carrapatos.

Outros métodos podem ser usados para determinar o impacto do silenciamento gênico na expressão gênica e proteica e na biologia do carrapato, incluindo RTPC em tempo real, elétron de luz ou microscopia confocal. Genômica ou proteômica. A interferência de RNA também pode ser feita em culturas de células de carrapatos e fornece um método in vitro para o estudo das interações de patógenos de células de carrapatos.