Sistema de Protocolo fechado Cultura de Células utilizando navios com HYPERStack Gas Technology material permeável

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o uso correto do sistema fechado dos vasos empilháveis Corning Hypers. Isso é realizado primeiramente inoculando e preenchendo os vasos com meio utilizando o método de alimentação por gravidade. Em seguida, a suspensão celular é isolada em cada uma das camadas e as células são incubadas.

Após a incubação, o meio usado é removido. O passo final do procedimento é colher as células dos vasos do sistema hypers stack. Por fim, são obtidos os resultados da difusão de gases para demonstrar a capacidade das células de acessar oxigênio durante o crescimento até a confluência, quando se utiliza o sistema fechado hypers stack.

A principal vantagem do vaso hypers stack com material permeável a gases é que ele proporciona uma área de superfície aumentada para o crescimento celular. Ao eliminar o espaço livre no vaso, meu colega p pardo demonstrará agora um protocolo de sistema fechado para o uso do vaso hypers stack. O vaso hypers stack é composto por um stat, que é o compartimento individual de cultura celular formado pela placa superior e pela película permeável a gases.

As células são cultivadas dentro deste compartimento. O coletor de líquidos conecta cada uma das camadas entre si dentro de um módulo. Os módulos são conectados com tubos para formar vasos em múltiplos de 12 camadas.

O coletor permite ao usuário realizar uma única manipulação de fluido em todo o vaso. O coletor de ar também conecta as camadas stat entre si, mas é usado para deslocar o ar do vaso quando há adições de fluido e possui uma linha de enchimento para uso durante o preenchimento entre cada uma. A camada stat é um espaço aberto ao ar chamado espaço traqueal, permitindo que a troca gasosa ocorra através da película permeável a gases de cada camada.

O tubo de manipulação de líquidos é conectado ao manifold de líquido e é um componente personalizável utilizado para realizar todas as manipulações de fluido em sistema fechado, liberando o excesso de ar enquanto mantém a esterilidade. O tubo de ventilação é utilizado. O tubo de ventilação é conectado ao manifold de ar e contém um filtro de ar.

Conectado à tubulação de manipulação de líquidos está a tubulação de lavagem e o filtro, que são usados para esvaziar o fluido da tubulação de manipulação de líquidos após o preenchimento do vaso. Também é utilizado neste protocolo o manipulador Corning Stack, ou CSM, que é um dispositivo de manipulação que auxilia na colocação dos vasos nas posições corretas durante o uso. Nesta demonstração, a cultura celular em sistema fechado é demonstrada para um vaso permeável a gases com 36 camadas.

Usando um CSM, no entanto, os detalhes para realizar este procedimento em um vaso de 12 camadas utilizando uma cunha de enchimento podem ser encontrados no protocolo escrito anexo. Inicie preparando 3,9 litros de meio embolsado antes de inocular o tubo de meio. Umedeça a bolsa de soro com a bolsa de meio e misture bem para obter a concentração desejada de soro.

Prenda cerca de 300 mililitros de meio no saco usando grampos grandes para saco. Isso garantirá que todas as células inoculadas sejam utilizadas durante o enchimento, e nenhuma permaneça no saco de meio. Coloque o meio em um suporte para saco para inocular o meio.

Encha uma seringa conectada a um tubo com a suspensão celular. Conecte a seringa contendo a suspensão celular ao saco de meio por soldagem de tubo. Três polegadas e dezesseis avos de tubo da seringa até o saco.

Injete a suspensão celular no saco de meio e misture bem. O saco de meio inoculado pode ser conectado ao tubo de manipulação de líquidos de três oitavos de polegada do vaso por soldagem de tubos ou usando conectores multipropósito. Hoje usaremos soldagem de tubos.

Feche as pinças nos tubos de manipulação de líquido e de seguimento do vaso. Coloque o vaso de 36 camadas em um CSM na posição de carga. Conecte o tubo do filtro de ventilação ao grampo de fixação no CSM.

Aperte a tampa e mova o CSM para a posição de enchimento, colocando o filtro de ar na posição mais alta para evitar umedecimento durante a operação de enchimento. O ângulo de 10 graus também permite a equilibração do líquido nas camadas durante o enchimento, eliminando o ar da linha de enchimento. Posicionando a bolsa de meio no mesmo nível do vaso, mantenha o grampo do tubo de rastreamento fechado.

Abra o grampo do tubo de manipulação de líquidos e o grampo do saco de meio para permitir que o fluido entre no vaso. Usando o suporte do saco, eleve o saco de meio para ajudar o fluxo da suspensão celular para dentro do vaso. Encha o vaso até que todo o meio inoculado entre no vaso.

A parte superior do saco de meio ainda deve conter 300 mililitros de meio. Remova o clipe do saco de meio para continuar enchendo o vaso à medida que o líquido se aproxima do coletor de ar superior. Diminua a velocidade de enchimento abaixando o saco de meio para evitar excesso de enchimento.

Eleve lentamente o nível do líquido até a marca de enchimento e agrupe a tubulação de manipulação de líquidos. Traga o vaso para a posição de isolamento no CSM, colocando ambos os conjuntos de manifolds na posição mais alta. Abaixe a bolsa de meio abaixo da altura do vaso.

Com o filtro de lavagem mantido em posição vertical, abra o prendedor do tubo de lavagem. Isso fará com que o meio presente no tubo de manipulação de líquidos retorne para o saco de meio. Após o esvaziamento do tubo, feche o prendedor no tubo do saco de meio.

Mantendo o filtro do tubo de coleta na posição vertical. Abra o clipe do tubo de manipulação de líquidos do recipiente para permitir que o líquido remanescente entre e se equilibre no recipiente. Aguarde um a dois minutos para que isso ocorra.

Em seguida, gire o vaso no CSM de modo que os coletores fiquem à esquerda. Abaixe o vaso até a posição de carga no CSM. Feche as braçadeiras em ambas as tubulações de arraste e de manipulação de líquidos.

A bolsa de meio pode agora ser removida do vaso, ou pode permanecer conectada para uso posterior no procedimento de colheita. Para armazenar a bolsa de meio conectada, enrole-a e coloque-a sob as tiras de retenção na bandeja de armazenamento do vaso. Por fim, leve o vaso ao incubador. Ao transportar o vaso, tenha cuidado para evitar que qualquer líquido entre no filtro de ventilação de ar.

Isso é realizado inclinando ligeiramente a extremidade do coletor para cima. Para iniciar o tubo do procedimento de colheita, una a solução de associação celular e os sacos de quench para formar o conjunto do saco de colheita, garantindo que todos os grampos dos tubos estejam fechados. Remova o vaso do incubador e coloque-o no CSM na posição de carga.

Solte a bolsa do meio de sob as tiras de retenção e pendure-a no suporte. Em seguida, posicione-se em pé, aperte a tampa para fixar o recipiente. Encaixe o tubo de ventilação no grampo de fixação e mova o CSM para a posição de enchimento.

Certifique-se de que o saco do meio esteja pendurado no suporte abaixo do nível do vaso. Abra o clipe do tubo do saco do meio e do tubo de manipulação de líquidos do vaso para permitir que o meio flua para o saco acoplado. Quando o vaso estiver aproximadamente três quartos vazio, altere as configurações do CSM para a posição final vazia.

Quando o recipiente e a tubulação de manuseio de líquidos estiverem vazios, levante a tubulação para empurrar o meio além do clipe na tubulação do saco de meio usado. Em seguida, feche o clipe na tubulação de manuseio de líquidos e o clipe na tubulação do saco de meio usado. Substitua o saco de meio usado pelo conjunto do saco de colheita por soldagem de tubos.

Eleve a altura do conjunto da bolsa de dissociação celular acima da altura do vaso utilizando o suporte da bolsa. Coloque o CSM na posição de enchimento. Abra o clipe do tubo da solução de dissociação celular e o clipe do conjunto da bolsa de colheita e transfira a solução para o vaso.

Quando a transferência estiver concluída, feche as pinças nos tubos de manipulação de líquidos e no tubo da solução de dissociação celular. Em seguida, mova o CSM para a posição de carga mantendo a alavanca de posicionamento horizontal aberta. Balance suavemente o recipiente de um lado para o outro usando a roda, distribuindo a solução sobre as camadas celulares.

O recipiente pode ocasionalmente ser retornado à posição de enchimento durante a oscilação para manter uma distribuição igual da solução. Uma vez que a solução tenha sido adequadamente distribuída, solte a alavanca no CSM para travar na posição de enchimento. Mantenha o recipiente nesta posição durante o tempo de dissociação necessário para as células.

Utilize a turbidez como orientação para determinar a dessanexação celular. Após a dessanexação, mova o CSM para a posição de carga. Abra o prendedor da bolsa de quench e o prendedor da tubulação de manipulação de líquidos para permitir que o meio de quench entre no vaso.

Feche o clipe no tubo de manipulação de líquidos. Após a transferência ser concluída, retorne o CSM para a posição de carga e segure a alavanca de posicionamento horizontal para mover o vaso de um lado para o outro. Usando o suporte do saco, abaixe a posição do conjunto do saco de colheita abaixo do nível do vaso.

Ajuste o CSM para a posição vazia. Abra o grampo do tubo de manipulação de líquidos do vaso e transfira a solução celular de volta para a bolsa de quench. Retorne o CSM para a posição de carga e desconecte o conjunto da bolsa de colheita do vaso utilizando um selador de tubos.

Agora, a solução celular está pronta para processamento em sistemas tradicionais de crescimento celular. Com o Headspace, o oxigênio no meio é esgotado em uma média de 50% ao longo de três dias. Em cultura, este gráfico mostra a diminuição em miligramas por litro de oxigênio ao nível das células ao longo do tempo no mesmo sistema de crescimento; o gradiente de oxigênio ao longo de uma altura de meio de três milímetros é quase 50% maior na junção entre o meio e o Headspace do que na camada celular.

O percentual de oxigênio no espaço traqueal da pilha hipers durante o crescimento celular é apresentado. A figura mostra que, ao longo de 96 horas, o percentual de oxigênio entre as camadas, que abastece cada filme com fundo permeável a gases, permanece constante. Isso demonstra a capacidade das células de acessar oxigênio durante o crescimento até a confluência.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preencher e colher o vaso Corning Hypers stack no sistema fechado.