Name: Sistema de Protocolo fechado Cultura de Células utilizando navios com HYPERStack Gas Technology material permeável (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-29T17:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprenda a usar o sistema fechado HYPERStack para cultura de células aderentes com alta produtividade. Este protocolo demonstra inoculação, preenchimento por gravidade e colheita eficiente de células utilizando materiais permeáveis a gases.

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Os autores gostariam de agradecer a Lonza Walkersville por sua assistência com conhecimento em sistema fechado, design saco, empréstimo de selantes saco e soldadores, bem como a criação da bolsa de esquemas HYPERStack.

1. HYPERStack navio - Gas fundo Tecnologia de materiais permeáveis <ol><li> O navio é uma embarcação HYPERStack multicamadas para cultura de células sistema fechado que se baseia na troca de gás por meio de um gás permeável 76.2micron filme de polímero para o metabolismo celular. </li><li> O navio HYPERStack difere de mais navios de celular tradicional cultura em que ele não tem um "headspace" acima das células no interior do vaso. Ao invés de com este "headspace" para a troca de gás dentro do vaso, os produtos gás permeáveis ​​têm espaços aéreos (referido como "traquéia" espaços) abaixo de cada câmara de cultura que está aberto para a atmosfera. </li><li> Este espaço traqueal permite que as células crescendo em cultura de células de cada compartimento do navio para ter a troca gasosa equivalente. </li><li> O gás de película permeável permite a troca de gás para ocorrer durante a manutenção de um ambiente estéril. Todas as manipulações de fluidos para cada uma das múltiplas camadas ocorrer através de uma porta de entrada única. </li></ol> 2. HYPERStack Component Summary navio <ol><li> O Stackette é o compartimento de cultura de células individuais, que é composto de placa superior e filme gás-permeáveis. As células são cultivadas dentro desse compartimento. </li><li> O Manifold líquido conecta cada uma das 12 camadas stackette juntos dentro de um módulo HYPERStack. Módulos são conectados com tubos para formar vasos em múltiplos de 12 camadas. O colector permite ao usuário fazer uma manipulação de fluido para o navio inteiro. </li><li> O Manifold Air também conecta as camadas stackette juntos, mas usado para deslocar o ar da embarcação quando adições fluido ocorrer. Ele contém uma linha de enchimento para uso durante o enchimento. </li><li> O Espaço traqueal é o espaço ao ar livre entre cada camada stackette, permitindo a troca de gás para ocorrer através do cinema cada camadas "de gás permeável. </li><li> A tubulação manipulação de líquidos é ligado ao colector de líquido e é usado para fazer todas as manipulações de fluidos sistema fechado. Este componente pode ser personalizado. </li><li> O tubo de ventilação está ligado ao colector de ar, contém um filtro de ar, e é usado para liberar o excesso de ar, mantendo a esterilidade. </li><li> A tubulação tem um filtro de perseguição e grampo e está conectado à tubulação de manipulação de líquidos e são usados ​​para evacuar o líquido da tubulação de manipulação de líquidos após o enchimento do reservatório. </li><li> O Manipulator Stack Corning ou CSM é um dispositivo de manuseio para auxiliar na colocação dos vasos na posição correta durante o uso. </li><li> O Wedge enchimento é um aço inoxidável ajudar usado quando manualmente preenchendo os vasos HYPERStack. </li></ol> 3. Resultados de gás difusão através Film gás permeável usado nos vasos HYPERStack <ol><li> Em sistemas de células tradicionais de crescimento com headspace ventiladas, o oxigênio na mídia está esgotada uma média de 50% ao longo de 3 dias em cultura. (Figura 1) </li><li> No mesmo sistema de crescimento celular, o gradiente de oxigênio em uma altura 3mm de mídia é quase 50% maior na mídia para junção headspace do que é a camada de células. (Figura 2) </li><li> A difusão de oxigênio através da película de poliestireno 76.2micron gás permeável é igual à difusão através da mídia 2,6 milímetros. O filme gás-permeáveis ​​utilizado nos vasos HYPERStack permite a troca de gás para ocorrer na camada de células. </li><li> O% de oxigênio no espaço traqueal dos vasos HYPERStack permanece constante como as células crescem à confluência. (Figura 3) </li></ol> 4. Preparação de mídia Bag <ol><li> O HYPERStack-12 navio camada leva 1.3L de media e os HYPERStack-36 navio camada leva 3.9L de media. </li><li> Antes de inocular seus meios ensacado, se o soro deve ser usado, tubo de solda a bolsa de soro para o saco da mídia e misture bem. </li><li> Grampo off aproximadamente 300 mL de mídia na bolsa usando braçadeiras grande saco. Isso irá garantir todas as células inoculadas são usadas durante o enchimento e nenhum é remanescente no saco de mídia. Coloque a mídia de saco em stand saco. </li></ol> 5. Mídia inoculação <ol><li> Encha uma seringa com tubo ligado com suspensão de células. Tubo de solda 16/03 tubos "de uma seringa contendo suspensão de células para o saco de mídia. </li><li> Injetar a suspensão de células para a Bolsa de mídia e misture bem. </li></ol> 6. Preencha Procedimento <ol><li> Tubo de soldar o inoculados saco de mídia para o navio HYPERStack de 3 / 8 "tubulação de manipulação de líquidos. (Usando estéril Multipurpose Liga ou liga (PPM), você também pode anexar o saco de mídia para o navio). </li><li> Fechar os grampos sobre o manuseio de líquidos e tubos de perseguição na HYPERStack. </li><li> Coloque o HYPERStack navio Camada 36 para o CSM na posição de carga; gancho do tubo de respiro do filtro no clamp segurando o CSM. Apertar a tampa e mover o CSM para a posição de enchimento. Ao colocar o navio na posição correta de preenchimento; o filtro de ar está agora em posição mais alta para evitar molhar durante a operação de preenchimento. O 10 ° de ângulo permite equilibrção do líquido para as camadas durante o enchimento. O navio camada HYPERStack-12 colocado de lado na cunha de enchimento é na posição correta para o preenchimento. </li><li> Ar limpo da linha de enchimento, posicionando o saco no mesmo nível que o navio HYPERStack (não superior). Mantendo a fixação de tubo perseguição fechado; abra o grampo do tubo de líquido manuseio e do grampo saco de mídia para permitir que o líquido para entrar no navio. </li><li> Usando o suporte de saco, levante o saco da mídia para ajudar o fluxo de suspensão celular dentro do vaso. </li><li> Encha o copo até que a todos os meios inoculados entra no navio, a 300 mL de mídia ainda deve permanecer na parte superior do saco de mídia. Retire o grampo do saco de mídia para continuar enchimento do reservatório. Como o líquido se aproxima do coletor de ar superior, retardar a taxa de preenchimento, reduzindo o saco da mídia, a fim de evitar o excesso de enchimento. Levar lentamente o nível de líquido para a linha de enchimento e prender o tubo de manipulação de líquidos. </li></ol> 7. Procedimento de isolamento para bloquear líquido nas camadas <ol><li> Trazer o navio HYPERStack no CSM a posição de isolamento para os dois conjuntos de coletores estão em posição mais alta e mais baixa a bolsa de mídia abaixo da altura do vaso. O HYPERStack-12 navio camada pode ser levantado para a posição de isolamento, colocando uma mão no lado do navio e usar a outra para levantar a cunha de enchimento. </li><li> Com o filtro de perseguição realizada em uma posição ereta, abra o grampo do tubo perseguição. Isto vazio ou perseguição da mídia no tubo de manipulação de líquidos de volta para o saco de mídia. Uma vez que o tubo está vazio, fechar a braçadeira no tubo de bolsa de mídia. </li><li> Manter o filtro do tubo de perseguição em uma posição ereta, abra o grampo do tubo de manipulação de líquidos na HYPERStack para permitir que qualquer líquido restante para entrar e se equilibram no vaso. Espere 1-2 minutos para que isso ocorra. </li><li> Por sua vez o navio HYPERStack no CSM, para que os manifolds estão à esquerda. Inferior da embarcação para a posição carga no CSM. Balançando o HYPEStack-12 navio camada ligeiramente para a esquerda vai permitir a eliminação da cunha de enchimento. Fechar os grampos em ambos a perseguição e tubulação para manipulação de líquidos. </li><li> O saco de mídia pode agora ser removido do navio ou que podem permanecer presos para uso posterior no processo de colheita. Para armazenar o saco da mídia anexada, role o saco vazio e qualquer outra mídia restante no saco, e colocar sob as faixas de retenção na bandeja de armazenamento do navio HYPERStack. </li><li> Mover o navio HYPERStack para a incubadora. Quando transportar o cuidado navio devem ser tomadas para manter líquidos de entrar no filtro de ventilação de ar. Isso é realizado por depósito no final do coletor HYPERStack ligeiramente para cima. </li></ol> 8. Protocolo de colheita <ol><li> Para iniciar o procedimento de colheita, tubo de solda a célula solução dissociação e sacos de saciar-se para formar a montagem saco de colheita. Garantir que todos os grampos de tubo estão fechados. (Use cartoon para demonstrar) </li><li> Remover navio HYPERStack da incubadora, solte o saco de mídia sob a bandas de retenção, e pendurar no stand saco. Coloque o recipiente no CSM com a carga e aperte a tampa para proteger o navio. Gancho da tubulação de ventilação para o grampo holding e mova o CSM para a posição de enchimento. </li><li> Certificando-se o saco de mídia no stand saco está pendurado inferior ao HYPERStack; abra o grampo no tubo saco de mídia e tubulação do navio para manipulação de líquidos para permitir o fluxo de mídia para dentro do saco em anexo. </li><li> Uma vez que o navio é de cerca de ¾ vazia, altere as configurações CSM para a posição final vazio. Quando o navio HYPERStack e tubulação para manipulação de líquidos estão vazios, levante a tubulação para perseguir os meios de comunicação além do grampo no tubo passou saco de mídia, em seguida, feche ambos prender o tubo na manipulação de líquidos ea braçadeira no tubo passou media saco. </li><li> Substituir o saco de gastos de mídia com a montagem saco de colheita por soldagem do tubo e aumentar a altura do conjunto de saco de dissociação de células acima da altura da HYPERStack usando o suporte de saco. </li><li> Coloque o CSM na posição de equilíbrio. Abra a célula de tubo solução dissociação grampo e transferir a solução para o HYPERStack. Quando a transferência estiver concluída, feche os grampos na tubulação de manipulação de líquidos ea célula tubulação solução dissociação. </li><li> CSM trazer para a posição de carga. Mantendo o posicionamento da alavanca horizontal aberta, agite levemente o lado navio para o lado usando a roda, distribuindo a solução sobre as camadas de células. O navio pode ocasionalmente ser devolvido para a posição de equilíbrio durante o balanço para manter a distribuição igual da solução. Pode não ser visualmente evidente que as camadas são completamente revestido, mas a solução dissociação serão distribuídos igualmente por toda a superfície das células. Uma vez que a solução tem sido adequadamente distribuídos, solte a alavanca do CSM para bloquear o HYPERStack na posição de carga. Deixe o HYPERStack nesta posiçãodurante o tempo necessário para a dissociação de suas células. </li><li> Uma vez que as células têm destacado, usando turbidez como um guia, mover o CSM para a posição de equilíbrio. Cuidados devem ser tomados para não mais de digerir as células. Abra o grampo saco saciar eo líquido HYPERStack abraçadeira de tubo para permitir a manipulação da mídia saciar a entrar no navio. Feche a braçadeira no tubo de manipulação de líquidos HYPERStack uma vez que a transferência estiver completa. </li><li> Devolver o CSM para a posição de carga e segure a alavanca de posicionamento horizontal para balançar o navio lado a lado. </li><li> Usando o suporte de saco, baixar a posição da assembléia saco safra abaixo do nível do HYPERStack. Ajustar o CSM para a posição vazia, abra o recipiente para manipulação de líquidos tubo braçadeira e transferir a solução de células de volta para o saco de matar. Devolver o CSM para a posição de carga e desconecte o conjunto da bolsa colheita do navio usando um aferidor tubo. A solução celular está pronto para processamento. </li></ol> 9. Resultados representante <ul><li> Tempo da colheita precisa ser otimizado ao converter de uma superfície padrão de poliestireno para a superfície de poliestireno gás-permeáveis. Células tendem a liberar mais rapidamente sobre o produto HYPERStack. </li><li> Para visualizar as células sob um microscópio o tubo de ventilação e tratamento de líquidos precisa ser pinçada fora. Colocar o recipiente HYPERStack cabeça para baixo, com os manifolds apontando para baixo, no palco microscópio. </li><li> Medidas de prevenção podem ser tomadas para evitar molhar os filtros durante o uso que fará com que eles parem de funcionar. Por não mais do enchimento do reservatório HYPERStack e manter a ventilação e os tubos de perseguição elevado quando os grampos estão abertas, não molhar deve ocorrer. </li><li> A pressão dos grampos fechados no tubo faz com que ela permaneça fechada após os grampos são abertas. Beliscar o tubo na direção oposta irá abri-lo. </li><li> Tempo de fluxo de mídia que entram e saem do navio HYPERStack via feed gravidade é baseado na diferença de altura de mídia entre o nível mais alto de mídia no vaso HYPERStack e no nível superior de mídia no recipiente de mídia. Quanto maior a distância, mais rápido o fluxo. A vazão máxima é limitada pela classificação dos filtros para 1.5L/min. </li><li> Manutenção de volume de enchimento adequada no vaso HYPERStack irá prevenir a formação de bolhas de ar nas câmaras de crescimento celular. Bolhas de ar podem ocorrer devido à amostragem ou incubar em um ambiente unhumidified devido à evaporação da água. O valor de amostragem ea frequência, assim como condições de incubação vai determinar se o fluido deve ser adicionado pelo usuário final. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Depleção de oxigênio dos meios de comunicação em um recipiente padrão de cultura celular. A figura mostra a redução em mg / L de oxigênio ao nível das células ao longo de 3 dias. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Gradiente de oxigênio na mídia em um recipiente padrão de cultura celular. A figura mostra a mg / L de oxigênio é maior no cruzamento de mídia para headspace do que na camada de células. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Percentual de oxigênio no espaço traqueal do HYPERStack durante o crescimento celular. A figura mostra que mais de 96 horas, a porcentagem de oxigênio entre as camadas, que abastece de gás a cada fundo de película permeável, permanece constante. Isso demonstra a capacidade das células para o acesso de oxigênio durante o crescimento de confluência.

O navio HYPERStack gás permeável a tecnologia é coberto pela Patente dos EUA #: 7745209. Os autores são funcionários da Corning Life Sciences, Inc, que produz o instrumento utilizado neste artigo.

HYPERStack navio tem crescido com sucesso engenharia, pilhas e tronco. Adições fluido no vaso foram realizados através de conexões asséptico saco de alimentação por gravidade e também pelo bombeamento de um recipiente estéril media. O navio oferece um aumento de 2,5 vezes maior do que em área de crescimento versus um produto chapa empilhados da mesma pegada volumétrica. O HYPERStack-12 tem 6.000 centímetros área de crescimento 2, o HYPERStack-36 tem 18 mil centímetros área de crescimento 2, eo HYPERStack-120 tem 60.000 cm 2 de área de crescimento. Ao aumentar a área de superfície, os usuários são capazes de produzir mais células da população de células iguais ou muito e reduzir a variabilidade. Eles também são capazes de economizar espaço e / ou de trabalho, recorrendo menos navios para alcançar a saída mesma célula, ou aumentar a produção de células sem adicionar pessoas, suites sala limpa, ou incubadoras. O sistema é produzido com métodos de montagem de partículas de baixa e sem o uso de adesivos. É um sistema fechado, que é pré-montado com conjuntos de tubos e filtros, triple ensacado e fornecidos estéreis.

<table><tbody><tr><td>Meio embalado de 1,5 L</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>1350 ml de meio + 150 ml de soro (se necessário)</td></tr><tr><td>Meio embalado de 4,0 L</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>3600 ml de meio + 400 ml de soro (se necessário)</td></tr><tr><td>Recipiente HYPERStack-12</td><td>Corning</td><td>10012</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente HYPERStack-36</td><td>Corning</td><td>10036</td><td></td></tr><tr><td>Calço de enchimento</td><td>Corning</td><td>10040</td><td></td></tr><tr><td>Manipulador de pilhas</td><td>Corning</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de amostragem do subconjunto HyQtainer</td><td>Hyclone</td><td>SH3B0324.01</td><td></td></tr><tr><td>Quenching de meio embalado de 600 ml (IMDM com FBS a 10%)</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>Solução de dissociação celular de 600 ml</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr></tbody></table>

sistema de protocolo fechado cultura de células utilizando navios com hyperstack gas technology material permeável

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Grande volume de cultura de células aderentes está padronizado na placa empilhados produtos crescimento celular quando microcarregador contas não são uma escolha ideal. Vasos HYPERStack permitir escala sistema fechado a partir do atual placa de produtos empilhados e entrega&gt; 2,5 vezes mais células na pegada volumétrica mesmo. Os vasos HYPERStack função através de material permeável ao gás que permite a troca de gás para ocorrer, portanto, eliminando a necessidade de headspace interna dentro de um vaso. A eliminação de headspace permite que o compartimento onde o crescimento celular ocorre a ser minimizada para reduzir o espaço, permitindo mais camadas de células área de superfície de crescimento dentro da pegada volumétrica mesmo. Para muitas aplicações, tais como a terapia celular ou a produção de vacinas, um sistema fechado é necessária para o crescimento celular e colheita. O navio HYPERStack permite que celulares e reagente adição e remoção através de tubos de sacos de mídia ou de outros métodos. Este protocolo irá explicar a tecnologia por trás do material permeável ao gás usado nos vasos HYPERStack, os resultados de difusão de gás para atender as necessidades metabólicas das células, sistema fechado de protocolos de crescimento celular, e vários métodos de colheita.

Uma introdução à tecnologia de protocolo, e manuseio das embarcações Corning HYPERStack e acessórios utilizados para cultura de células de alto rendimento aderente. O protocolo irá mostrar como usar os vasos sistema fechado para a colheita de células a aumentar ao longo produtos empilhados placa atual.

Sistema de Protocolo fechado Cultura de Células utilizando navios com HYPERStack Gas Technology material permeável

A cultura de células aderentes em grande volume é atualmente padronizada em produtos de crescimento celular de placas empilhadas quando as esferas de microcarreadores não são a escolha ideal.

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o uso correto do sistema fechado dos vasos empilháveis Corning Hypers. Isso é realizado primeiramente inoculando e preenchendo os vasos com meio utilizando o método de alimentação por gravidade. Em seguida, a suspensão celular é isolada em cada uma das camadas e as células são incubadas.Após a incubação, o meio usado é removido. O passo final do procedimento é colher as células dos vasos do sistema hypers stack. Por fim, são obtidos os resultados da difusão de gases para demonstrar a capacidade das células de acessar oxigênio durante o crescimento até a confluência, quando se utiliza o sistema fechado hypers stack.A principal vantagem do vaso hypers stack com material permeável a gases é que ele proporciona uma área de superfície aumentada para o crescimento celular. Ao eliminar o espaço livre no vaso, meu colega p pardo demonstrará agora um protocolo de sistema fechado para o uso do vaso hypers stack. O vaso hypers stack é composto por um stat, que é o compartimento individual de cultura celular formado pela placa superior e pela película permeável a gases.As células são cultivadas dentro deste compartimento. O coletor de líquidos conecta cada uma das camadas entre si dentro de um módulo. Os módulos são conectados com tubos para formar vasos em múltiplos de 12 camadas.O coletor permite ao usuário realizar uma única manipulação de fluido em todo o vaso. O coletor de ar também conecta as camadas stat entre si, mas é usado para deslocar o ar do vaso quando há adições de fluido e possui uma linha de enchimento para uso durante o preenchimento entre cada uma. A camada stat é um espaço aberto ao ar chamado espaço traqueal, permitindo que a troca gasosa ocorra através da película permeável a gases de cada camada.O tubo de manipulação de líquidos é conectado ao manifold de líquido e é um componente personalizável utilizado para realizar todas as manipulações de fluido em sistema fechado, liberando o excesso de ar enquanto mantém a esterilidade. O tubo de ventilação é utilizado. O tubo de ventilação é conectado ao manifold de ar e contém um filtro de ar.Conectado à tubulação de manipulação de líquidos está a tubulação de lavagem e o filtro, que são usados para esvaziar o fluido da tubulação de manipulação de líquidos após o preenchimento do vaso. Também é utilizado neste protocolo o manipulador Corning Stack, ou CSM, que é um dispositivo de manipulação que auxilia na colocação dos vasos nas posições corretas durante o uso. Nesta demonstração, a cultura celular em sistema fechado é demonstrada para um vaso permeável a gases com 36 camadas.Usando um CSM, no entanto, os detalhes para realizar este procedimento em um vaso de 12 camadas utilizando uma cunha de enchimento podem ser encontrados no protocolo escrito anexo. Inicie preparando 3,9 litros de meio embolsado antes de inocular o tubo de meio. Umedeça a bolsa de soro com a bolsa de meio e misture bem para obter a concentração desejada de soro.Prenda cerca de 300 mililitros de meio no saco usando grampos grandes para saco. Isso garantirá que todas as células inoculadas sejam utilizadas durante o enchimento, e nenhuma permaneça no saco de meio. Coloque o meio em um suporte para saco para inocular o meio.Encha uma seringa conectada a um tubo com a suspensão celular. Conecte a seringa contendo a suspensão celular ao saco de meio por soldagem de tubo. Três polegadas e dezesseis avos de tubo da seringa até o saco.Injete a suspensão celular no saco de meio e misture bem. O saco de meio inoculado pode ser conectado ao tubo de manipulação de líquidos de três oitavos de polegada do vaso por soldagem de tubos ou usando conectores multipropósito. Hoje usaremos soldagem de tubos.Feche as pinças nos tubos de manipulação de líquido e de seguimento do vaso. Coloque o vaso de 36 camadas em um CSM na posição de carga. Conecte o tubo do filtro de ventilação ao grampo de fixação no CSM.Aperte a tampa e mova o CSM para a posição de enchimento, colocando o filtro de ar na posição mais alta para evitar umedecimento durante a operação de enchimento. O ângulo de 10 graus também permite a equilibração do líquido nas camadas durante o enchimento, eliminando o ar da linha de enchimento. Posicionando a bolsa de meio no mesmo nível do vaso, mantenha o grampo do tubo de rastreamento fechado.Abra o grampo do tubo de manipulação de líquidos e o grampo do saco de meio para permitir que o fluido entre no vaso. Usando o suporte do saco, eleve o saco de meio para ajudar o fluxo da suspensão celular para dentro do vaso. Encha o vaso até que todo o meio inoculado entre no vaso.A parte superior do saco de meio ainda deve conter 300 mililitros de meio. Remova o clipe do saco de meio para continuar enchendo o vaso à medida que o líquido se aproxima do coletor de ar superior. Diminua a velocidade de enchimento abaixando o saco de meio para evitar excesso de enchimento.Eleve lentamente o nível do líquido até a marca de enchimento e agrupe a tubulação de manipulação de líquidos. Traga o vaso para a posição de isolamento no CSM, colocando ambos os conjuntos de manifolds na posição mais alta. Abaixe a bolsa de meio abaixo da altura do vaso.Com o filtro de lavagem mantido em posição vertical, abra o prendedor do tubo de lavagem. Isso fará com que o meio presente no tubo de manipulação de líquidos retorne para o saco de meio. Após o esvaziamento do tubo, feche o prendedor no tubo do saco de meio.Mantendo o filtro do tubo de coleta na posição vertical. Abra o clipe do tubo de manipulação de líquidos do recipiente para permitir que o líquido remanescente entre e se equilibre no recipiente. Aguarde um a dois minutos para que isso ocorra.Em seguida, gire o vaso no CSM de modo que os coletores fiquem à esquerda. Abaixe o vaso até a posição de carga no CSM. Feche as braçadeiras em ambas as tubulações de arraste e de manipulação de líquidos.A bolsa de meio pode agora ser removida do vaso, ou pode permanecer conectada para uso posterior no procedimento de colheita. Para armazenar a bolsa de meio conectada, enrole-a e coloque-a sob as tiras de retenção na bandeja de armazenamento do vaso. Por fim, leve o vaso ao incubador. Ao transportar o vaso, tenha cuidado para evitar que qualquer líquido entre no filtro de ventilação de ar.Isso é realizado inclinando ligeiramente a extremidade do coletor para cima. Para iniciar o tubo do procedimento de colheita, una a solução de associação celular e os sacos de quench para formar o conjunto do saco de colheita, garantindo que todos os grampos dos tubos estejam fechados. Remova o vaso do incubador e coloque-o no CSM na posição de carga.Solte a bolsa do meio de sob as tiras de retenção e pendure-a no suporte. Em seguida, posicione-se em pé, aperte a tampa para fixar o recipiente. Encaixe o tubo de ventilação no grampo de fixação e mova o CSM para a posição de enchimento.Certifique-se de que o saco do meio esteja pendurado no suporte abaixo do nível do vaso. Abra o clipe do tubo do saco do meio e do tubo de manipulação de líquidos do vaso para permitir que o meio flua para o saco acoplado. Quando o vaso estiver aproximadamente três quartos vazio, altere as configurações do CSM para a posição final vazia.Quando o recipiente e a tubulação de manuseio de líquidos estiverem vazios, levante a tubulação para empurrar o meio além do clipe na tubulação do saco de meio usado. Em seguida, feche o clipe na tubulação de manuseio de líquidos e o clipe na tubulação do saco de meio usado. Substitua o saco de meio usado pelo conjunto do saco de colheita por soldagem de tubos.Eleve a altura do conjunto da bolsa de dissociação celular acima da altura do vaso utilizando o suporte da bolsa. Coloque o CSM na posição de enchimento. Abra o clipe do tubo da solução de dissociação celular e o clipe do conjunto da bolsa de colheita e transfira a solução para o vaso.Quando a transferência estiver concluída, feche as pinças nos tubos de manipulação de líquidos e no tubo da solução de dissociação celular. Em seguida, mova o CSM para a posição de carga mantendo a alavanca de posicionamento horizontal aberta. Balance suavemente o recipiente de um lado para o outro usando a roda, distribuindo a solução sobre as camadas celulares.O recipiente pode ocasionalmente ser retornado à posição de enchimento durante a oscilação para manter uma distribuição igual da solução. Uma vez que a solução tenha sido adequadamente distribuída, solte a alavanca no CSM para travar na posição de enchimento. Mantenha o recipiente nesta posição durante o tempo de dissociação necessário para as células.Utilize a turbidez como orientação para determinar a dessanexação celular. Após a dessanexação, mova o CSM para a posição de carga. Abra o prendedor da bolsa de quench e o prendedor da tubulação de manipulação de líquidos para permitir que o meio de quench entre no vaso.Feche o clipe no tubo de manipulação de líquidos. Após a transferência ser concluída, retorne o CSM para a posição de carga e segure a alavanca de posicionamento horizontal para mover o vaso de um lado para o outro. Usando o suporte do saco, abaixe a posição do conjunto do saco de colheita abaixo do nível do vaso.Ajuste o CSM para a posição vazia. Abra o grampo do tubo de manipulação de líquidos do vaso e transfira a solução celular de volta para a bolsa de quench. Retorne o CSM para a posição de carga e desconecte o conjunto da bolsa de colheita do vaso utilizando um selador de tubos.Agora, a solução celular está pronta para processamento em sistemas tradicionais de crescimento celular. Com o Headspace, o oxigênio no meio é esgotado em uma média de 50% ao longo de três dias. Em cultura, este gráfico mostra a diminuição em miligramas por litro de oxigênio ao nível das células ao longo do tempo no mesmo sistema de crescimento; o gradiente de oxigênio ao longo de uma altura de meio de três milímetros é quase 50% maior na junção entre o meio e o Headspace do que na camada celular.O percentual de oxigênio no espaço traqueal da pilha hipers durante o crescimento celular é apresentado. A figura mostra que, ao longo de 96 horas, o percentual de oxigênio entre as camadas, que abastece cada filme com fundo permeável a gases, permanece constante. Isso demonstra a capacidade das células de acessar oxigênio durante o crescimento até a confluência.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preencher e colher o vaso Corning Hypers stack no sistema fechado.

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Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar células únicas com uma plataforma microfluídica, que utiliza um novo conceito de design de micropoços para permitir o isolamento de célula única de alta eficiência e cultura clonal de longo prazo.

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Nós apresentamos um modelo microfluídicos do cancer-em-microplaqueta, a tecnologia do "acelerador evolução", que fornece uma plataforma controlável para estudos quantitativos em tempo real a longo prazo da dinâmica do cancro dentro das condições ambientais bem definidas no único-Cell Nível. Espera-se que esta tecnologia funcione como um modelo in vitro para pesquisa fundamental ou desenvolvimento de fármacos pré-clínicos.

Geração de gradientes heterogêneos de drogas em populações de câncer em um acelerador de evolução Microfluídico para observação em tempo real

Apresentamos aqui um protocolo para colheita de células aderentes de frascos multicamadas de forma semi-automatizada fechada usando um sistema de centrifugação em contrafluxo. Este protocolo pode ser aplicado para a colheita de células aderentes e em suspensão de outras plataformas de expansão celular com poucas modificações nas etapas existentes.

Processamento de células-tronco mesenquimais humanas para aplicações clínicas usando um fluxo de trabalho semi-automatizado fechado

Aqui, apresentamos um protocolo para alcançar a fabricação em larga escala de células aderentes através de um sistema totalmente fechado baseado em microcarreadores dissolvidos grau GMP. O cultivo de células-tronco mesenquimais humanas, células HEK293T e células Vero foi validado e atendeu tanto às exigências de quantidade quanto aos critérios de qualidade para a indústria de terapia celular e gênica.

Produção de células em larga escala com base em microtransportadores porosos solúveis de grau GMP

Aprenda a usar o sistema fechado HYPERStack para cultura de células aderentes com alta produtividade. Este protocolo demonstra inoculação, preenchimento por gravidade e colheita eficiente de células utilizando materiais permeáveis a gases.

Sistema de Protocolo fechado Cultura de Células utilizando navios com HYPERStack Gas Technology material permeável

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