Sistema de Protocolo fechado Cultura de Células utilizando navios com HYPERStack Gas Technology material permeável
November 29th, 2010
Uma introdução à tecnologia de protocolo, e manuseio das embarcações Corning HYPERStack e acessórios utilizados para cultura de células de alto rendimento aderente. O protocolo irá mostrar como usar os vasos sistema fechado para a colheita de células a aumentar ao longo produtos empilhados placa atual.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o uso correto do sistema fechado dos vasos de pilha Corning Hypers. Isso é feito primeiro inoculando e enchendo os vasos com meio por meio do método de alimentação por gravidade. Em seguida, a suspensão celular é isolada em cada uma das camadas e as células são incubadas.
Após a incubação, a mídia gasta é removida. A etapa final do procedimento é colher as células dos vasos de pilha de hipers. Em última análise, os resultados da difusão gasosa são obtidos para mostrar a capacidade das células de acessar oxigênio durante o crescimento para cofluência quando o sistema fechado de pilha hiper é usado.
A principal vantagem do vaso de pilha hiper com material permeável a gás é que ele fornece maior área de superfície para o crescimento celular. Ao eliminar o espaço da cabeça no recipiente, meu colega p pardo agora demonstrará um protocolo de sistema fechado para usar o vaso hypers stack. O vaso de pilha hiper é composto por um stat, que é o compartimento individual de cultura de células que é composto pela placa superior e filme permeável a gás.
As células são cultivadas dentro deste compartimento. O coletor de líquido conecta cada uma das camadas dentro de um módulo. Os módulos são conectados com tubos para formar vasos em múltiplos de 12 camadas.
O coletor permite que o usuário faça uma manipulação de fluido em todo o recipiente. O coletor de ar também conecta as camadas estáticas, mas é usado para deslocar o ar do recipiente quando ocorrem adições de fluido e contém uma linha de enchimento para uso durante o enchimento entre cada uma. A camada Stat é um espaço ao ar livre chamado espaço traqueal, permitindo que a troca gasosa ocorra através do filme permeável ao gás de cada camada.
A tubulação de manuseio de líquidos é conectada ao coletor de líquidos e é um componente personalizável usado para fazer todas as manipulações de fluidos do sistema fechado para liberar o excesso de ar, mantendo a esterilidade. A tubulação de ventilação é usada. A tubulação de ventilação é conectada ao coletor de ar e contém um filtro de ar.
Conectado à tubulação de manuseio de líquidos está a tubulação de perseguição e o filtro, que são usados para evacuar o fluido da tubulação de manuseio de líquidos após o enchimento do recipiente. Também é usado neste protocolo o manipulador Corning Stack ou CSM, que é um dispositivo de manuseio para auxiliar na colocação dos vasos nas posições corretas durante o uso. Nesta demonstração, a cultura de células de sistema fechado é demonstrada para um vaso de 36 camadas permeável a gás.
Usando um CSM, no entanto, os detalhes para realizar este procedimento em um recipiente de 12 camadas usando uma cunha de enchimento podem ser encontrados no protocolo escrito que o acompanha. Comece preparando 3,9 litros de meio ensacado antes de inocular o tubo de meio. Molhe a bolsa de soro na bolsa de mídia e misture bem para obter a concentração de soro desejada.
Prenda aproximadamente 300 mililitros de mídia no saco usando grampos de saco grandes. Isso garantirá que todas as células inoculadas sejam usadas durante o enchimento e que nenhuma permaneça no saco de mídia. Coloque a mídia em um suporte de saco para inocular a mídia.
Encha uma seringa presa ao tubo com suspensão celular. Encaixe a seringa contendo a suspensão celular ao saco de mídia por soldagem de tubo. Três tubos de mais de 16 polegadas da seringa para a bolsa.
Injete a suspensão celular no saco de mídia e misture bem. O saco de mídia inoculado pode ser conectado ao tubo de manuseio de líquidos de três a mais de oito polegadas da embarcação por soldagem de tubo ou usando conectores multiuso. Hoje vamos usar soldagem de tubos.
Feche as braçadeiras nos tubos de manuseio e perseguição de líquidos do recipiente. Coloque o vaso de 36 camadas em A CSM na posição de carga. Prenda o tubo do filtro de ventilação no grampo de fixação no CSM.
Aperte a tampa e mova o CSM para a posição de enchimento para colocar o filtro de ar na posição mais alta para evitar umedecimento durante a operação de enchimento. O ângulo de 10 graus também permite o equilíbrio do líquido com as camadas durante o enchimento de ar limpo da linha de enchimento. Posicionando o saco de mídia no mesmo nível do recipiente, mantendo o tubo de perseguição clamp fechado.
Abra o tubo de manuseio de líquidos clamp e o saco de mídia clamp para permitir que o fluido entre no recipiente. Usando o suporte do saco, levante o saco de mídia para ajudar a suspensão da célula a fluir para o recipiente. Encha o recipiente até que todos os meios inoculados entrem no recipiente.
A parte superior do saco de mídia ainda deve conter 300 mililitros de mídia. Remova o clamp do saco de mídia para continuar enchendo o recipiente à medida que o líquido se aproxima do coletor de ar superior. Diminua a taxa de preenchimento abaixando o saco de mídia para evitar o enchimento excessivo.
Lentamente, traga o nível do líquido para a linha de enchimento e amontoe o tubo de manuseio de líquidos. Colocar o recipiente no CSM para a posição de isolamento, colocando ambos os conjuntos de colectores na posição mais elevada. Abaixe o saco de mídia abaixo da altura do recipiente.
Com o filtro de perseguição mantido na posição vertical, abra o tubo de perseguição clamp. Isso esvaziará ou perseguirá a mídia no tubo de manuseio de líquidos de volta para o saco de mídia. Quando a tubulação estiver vazia, feche a braçadeira na tubulação do saco de mídia.
Mantendo o filtro do tubo de perseguição na posição vertical. Abra o clamp no tubo de manuseio de líquidos do recipiente para permitir que qualquer líquido restante entre e se equilibre no recipiente. Aguarde de um a dois minutos para que isso ocorra.
Em seguida, gire o vaso no CSM para que os coletores fiquem à esquerda. Abaixe o recipiente para a posição de carga no CSM. Feche as braçadeiras na tubulação de perseguição e manuseio de líquidos.
O saco de mídia agora pode ser removido do recipiente ou pode permanecer preso para uso posterior no procedimento de colheita. Para armazenar o saco de mídia anexado, enrole-o e coloque-o sob as faixas de retenção na bandeja de armazenamento do recipiente. Finalmente, mova o recipiente para a incubadora Ao transportar o recipiente, tome cuidado para evitar que qualquer líquido entre no filtro de ventilação.
Isso é feito inclinando a extremidade do coletor ligeiramente para cima. Para iniciar o tubo de procedimento de colheita, solde as células Solução de associação e tempere os sacos Para formar o conjunto do saco de colheita, certifique-se de que todos os grampos do tubo estejam fechados. Remova o recipiente da incubadora e coloque-o no CSM na posição de carga.
Solte o saco de mídia de baixo das faixas de retenção e pendure-o no saco. Fique em seguida, aperte a tampa para prender o recipiente. Prenda a tubulação de ventilação no grampo de retenção e mova o CSM para a posição de preenchimento.
Certifique-se de que o saco de mídia no suporte do saco esteja pendurado abaixo do recipiente. Abra a braçadeira na tubulação do saco de mídia e na tubulação de manuseio de líquidos do recipiente para permitir que a mídia flua para o saco anexado. Quando o recipiente estiver cerca de três quartos vazio, altere as configurações do CSM para a posição final vazia.
Quando o recipiente e a tubulação de manuseio de líquidos estiverem vazios, levante a tubulação para perseguir a mídia além da braçadeira na tubulação do saco de mídia usada. Em seguida, feche a braçadeira no tubo de manuseio de líquidos e a braçadeira no tubo do saco de mídia usada. Substitua o saco de mídia gasto pelo conjunto do saco de colheita por soldagem de tubo.
Aumente a altura do conjunto do saco dissociante da célula acima da altura do recipiente usando o suporte do saco. Coloque o CSM na posição de preenchimento. Abra a braçadeira do tubo da solução de dissociação celular e o conjunto do saco de colheita Braçadeira e transfira a solução para o recipiente.
Quando a transferência estiver concluída, feche as braçadeiras na tubulação de manuseio de líquidos e na tubulação da solução de dissociação celular. Em seguida, coloque o CSM na posição de carga enquanto mantém a alavanca de posicionamento horizontal aberta. Balance suavemente o recipiente de um lado para o outro usando a roda, distribuindo a solução pelas camadas celulares.
O recipiente pode ocasionalmente ser devolvido à posição de enchimento durante o balanço para manter a distribuição igual da solução. Uma vez que a solução tenha sido distribuída adequadamente, solte a alavanca no CSM para travar na posição de preenchimento. Deixe o vaso nesta posição durante o tempo de dissociação necessário para as células.
Use a turbidez como guia para determinar o descolamento celular. Uma vez desconectado, mova o CSM para a posição de carga. Abra a braçadeira do saco de têmpera e a braçadeira da tubulação de manuseio de líquidos para permitir que o meio de têmpera entre no recipiente.
Feche a braçadeira na tubulação de manuseio de líquidos. Quando a transferência estiver concluída, retorne o CSM à posição de carga e segure a alavanca de posicionamento horizontal para balançar a embarcação de um lado para o outro. Usando o suporte do saco, abaixe a posição do conjunto do saco de colheita abaixo do nível do recipiente.
Ajuste o CSM para a posição vazia. Abra o tubo de manuseio de líquidos do recipiente Clamp e transfira a solução celular de volta para o saco de têmpera. Retorne o CSM à posição de carga e desconecte o conjunto do saco de coleta do recipiente usando um selador de tubo.
Agora, a solução celular está pronta para processamento em sistemas tradicionais de crescimento celular. Com o Headspace, o oxigênio na mídia é esgotado em uma média de 50% em três dias. Em cultura, esta figura mostra a diminuição em miligramas por litro de oxigênio ao nível das células ao longo do tempo no mesmo sistema de crescimento, o gradiente de oxigênio através de uma altura média de três milímetros é quase 50% maior na junção do meio para o Headspace do que na camada celular.
A porcentagem de oxigênio no espaço traqueal da pilha de hipers durante o crescimento celular é mostrada. A figura mostra que, ao longo de 96 horas, a porcentagem de oxigênio entre as camadas que fornece cada fundo de filme permeável ao gás permanece constante. Isso demonstra a capacidade das células de acessar oxigênio durante o crescimento para cofluência.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preencher e coletar o recipiente de pilha Corning Hypers no sistema fechado.
Visão Geral
Este artigo apresenta os Corning HYPERStack Vessels e seus acessórios, projetados para cultura de células aderentes de alto rendimento. O protocolo demonstra o uso do sistema fechado desses recipientes para melhorar a eficiência da colheita de células.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Tecnologia de cultura celular
- Colheita de células aderentes
- Protocolos de sistema fechado
Fundamento
- Os Corning HYPERStack Vessels proporcionam uma maior área de superfície para o crescimento celular.
- Materiais gasosos permeáveis permitem uma troca eficiente de gases durante a cultura celular.
- O design do sistema fechado minimiza os riscos de contaminação.
- A utilização de um manifold líquido simplifica as manipulações de fluidos.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar o uso correto dos Corning HYPERStack Vessels.
- Mostrar como inocular e preencher os recipientes de forma eficaz.
- Delinear os passos para a colheita de células dos recipientes.
Métodos Utilizados
- Inoculación de mídia com suspensão celular.
- Método de alimentação por gravidade para preenchimento dos recipientes.
- Uso de um manipulador Corning Stack para manuseio dos recipientes.
- Soldagem de tubos para conexão da mídia e manuseio de tubulações.
Principais Resultados
- Preenchimento e inoculação bem-sucedidos dos HYPERStack Vessels.
- Troca eficiente de gases observada durante o crescimento celular.
- Colheita de células aprimorada demonstrada através do sistema fechado.
- O protocolo permite fácil manipulação e manutenção da esterilidade.
Conclusões
- Os Corning HYPERStack Vessels são eficazes para cultura celular de alto rendimento.
- Protocolos de sistema fechado melhoram significativamente a eficiência da colheita de células.
- Materiais gasosos permeáveis são vantajosos para o crescimento celular.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Closed system adherent cell culture using gas permeable vessels addresses scalability challenges in biologics manufacturing by increasing yield per footprint while maintaining sterility. This approach supports process intensification for cell therapy and vaccine production where closed systems are critical for regulatory compliance. The technology enables higher cell densities without expanding facility footprint, improving capital efficiency in upstream bioprocessing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables scalable adherent cell expansion for target validation assays requiring high cell numbers.
- Operational Value: Reduces media and reagent consumption per cell yield through minimized headspace and efficient gas exchange.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides reproducible adherent cell layers for consistent assay readouts in drug screening campaigns.
- Operational Value: Standardizes cell seeding density across layers via liquid manifold distribution, improving assay-to-assay variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports generation of clinical-grade adherent cells for preclinical efficacy and safety testing under closed conditions.
- Operational Value: Facilitates seamless transition from research-scale to GMP-compatible processes using identical vessel architecture.
Pipeline & Workflow Integration
The HYPERStack system integrates into adherent cell production workflows from expansion through harvest, supporting continuous processing in vaccine and therapeutic protein pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing in adherent cell models at scales relevant to target engagement studies.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible cell outputs for assay standardization in hit-to-lead progression.
- Analytics: Supports oxygen and metabolite monitoring via gas permeable film to assess culture health and metabolic activity.
- Translational Research: Maintains phenotypic fidelity during scale-up, critical for translational consistency in cell-based therapies.
- Enterprise Reuse: Modular design allows reuse across multiple cell lines and processes, reducing capital expenditure per campaign.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive culture performance through stable gas exchange and reduced gradient effects compared to traditional stacked plates.
- Operational Value: Closed fluid paths minimize operator intervention, lowering contamination risk and labor intensity.
- Strategic Value: Higher yield per run improves batch consistency and reduces cost of goods in biologics manufacturing.
- Portfolio Impact: Enables risk-advanced allocation of adherent cell resources across multiple projects from a single platform.
Implementation Considerations
- Training in aseptic tubing welding and manifold handling for closed system integrity.
- Integration with standard incubators and biosafety cabinets using Corning Stack Manipulator for vessel positioning.
- Validation of gas diffusion rates to match metabolic demands of specific adherent cell lines.
- Adaptation of harvesting protocols (enzymatic or mechanical) to vessel geometry and layer accessibility.
- Monitoring of liquid handling tubing pressure and flow rates to prevent shear stress during scale-up.
