Multieletrodos Recordings Array of Avalanches Neuronal em culturas organotípicas

O objetivo deste experimento é estudar a auto-organização da atividade cerebral saudável em avalanches neuronais, a marca registrada da dinâmica do estado crítico no córtex. Isso é conseguido combinando uma fatia do córtex em camadas coronal com uma fatia do mesencéfalo, que fornece insumos dopaminérgicos importantes para o desenvolvimento do córtex. Como segunda etapa, a co-cultura do mesencéfalo Cortex é cultivada em uma matriz de vários eletrodos, o que permite a estimulação e o registro de atividades neuronais em vários locais na cultura.

Em seguida, deixamos a co-cultura achatar, expandir e se fixar à superfície MEA durante as primeiras uma a duas semanas em uma incubadora personalizada, que faz o ciclo da cultura por meio da exposição ao ar e à cultura normais. São obtidos resultados fluidos que mostram a auto-organização espontânea de explosões de potencial de campo local espaço-temporal em avalanches neuronais. Com base em gravações MEA e análise de avalanche offline que identifica a lei de potência em tamanhos de avalanche.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como culturas desassociadas, são seus sistemas, aspecto neurocientífico. Podemos co-cultivar muitas regiões do cérebro juntas e essas culturas multirregionais estabelecem uma organização cerebral correta em grandes escalas, como camadas corticais e sistemas de projeção. As aplicações dessa técnica vão além do estudo de avalanches neuronológicas.

Por exemplo, podemos estudar estímulos em resposta no nível da rede sob condições in vitro precisamente controladas. A demonstração visual deste método é crítica, pois a aplicação adequada da mistura de trombina plasmática e o posicionamento do tecido no MEA são difíceis de aprender. Essas etapas exigem o tempo adequado, o gradiente de temperatura correto e evitar tocar diretamente na delicada superfície MEA.

Para preparar uma câmara de vidro selável estéril para gravações, primeiro corte os cilindros de vidro rosqueados com uma tampa de plástico Teflon, a aproximadamente dois milímetros da parte inferior da rosca. Estes são necessários para o fechamento seguro e apertado da câmara de cultura. Em seguida, limpe os anéis de vidro enxaguando-os com água três vezes e fervendo por cinco minutos em álcool etílico 200 proof.

Deixe-os de lado para secar, uma solução de silicone é necessária para prender os anéis de vidro à superfície MEA. Use um kit de elastômero de silicone cell guard 180 4 e misture bem 15 mililitros das peças A e B. Em seguida, vamos sentar por 15 minutos para remover as bolhas de ar.

Separe a solução em um mililitro de Elocha e armazene a menos 20 graus Celsius para uso futuro. Agora cole um anel de vidro no MEA pegando um mililitro de silício a 23 graus Celsius em uma seringa com uma agulha de calibre pequeno e aplicando-o na superfície cortada não polida do anel de vidro. Em seguida, centralize o anel de vidro no MEA e aplique uma camada adicional de silício ao redor da parte externa do anel para obter uma vedação mais forte.

Deixe curar por uma a duas horas a cerca de 60 graus Celsius em uma placa quente. Em seguida, esterilize a câmara MEA e as tampas da câmara sob a capa de fluxo da lâmina, enxaguando três vezes em água deionizada do que três vezes com álcool a 70% para o último enxágue. Deixe a câmara descansar por 10 minutos no álcool.

Em seguida, expondo o interior da câmara e da tampa à luz ultravioleta por 10 minutos. Autoclave a 120 graus Celsius por 45 minutos. Depois de esterilizados, deixe-os secar.

Agora cubra a superfície MEA dentro da câmara de cultura com poli D lisina. As novas medidas usadas neste experimento são bastante lipofílicas, portanto, revestidas por gotículas repetidas. Aspiração da solução da grade de eletrodos.

Coloque a tampa para vedar a câmara MEA para armazenamento e uso futuro. Este procedimento produz seções de córtex e VTA para cerca de 12 co-culturas e deve ser realizado dentro de uma capela de fluxo de lâmina em condições estéreis usando animais saudáveis de um a dois dias pós-natal, o tempo total para coleta de tecido deve ser inferior a uma hora. Após a decapitação, comece a remoção do cérebro fazendo primeiro dois cortes laterais em tesoura para remover a pele do couro cabeludo.

Remova e corte o crânio com uma tesoura fina para os olhos, fazendo um corte sagital na linha média em um corte coronal na junção córtex cerebelo. Vire para trás todas as quatro abas do crânio para expor o cérebro. Em seguida, com uma espátula afiada, corte frontalmente através do bulbo olfatório.

Em seguida, avance a espátula trimestralmente sob o cérebro. Levante suavemente o cérebro para fora do crânio e deixe-o deslizar para o olhar gelado. Solução para resfriamento rápido e armazenamento temporário.

Repita o procedimento acima para mais dois cérebros. Para obter tecido VTA, transfira os cérebros para uma placa de Petri seca e estéril. Usando uma pequena espátula, remova qualquer excesso de líquido deslizando suavemente cada cérebro para o lado cerca de um centímetro.

Em seguida, use uma lâmina de barbear para remover o tronco encefálico, fazendo um corte vertical coronal no nível do cerebelo. Agora cole um bloco de ágar em um disco de montagem para estabilização mecânica do cérebro durante o procedimento de fatiamento. Em seguida, coloque uma linha fina de super cola, alguns milímetros na frente do bloco de ágar no disco, mas evite que a cola toque o ágar usando uma pequena espátula.

Transfira e monte cada pólo frontal do cérebro para baixo. Certifique-se de que os pólos frontais estejam colados ao disco de montagem e que os lados ventrais toquem o ágar sem nenhum resíduo de cola. Isso garante a estabilização mecânica adequada durante o corte e fácil levantamento das fatias cortadas.

Em seguida, mergulhe e prenda cuidadosamente o disco de montagem com os cérebros montados em uma bandeja vibram cheia de solução de olhar gelada. Em seguida, com um corte de lâmina de barbear cuidadosamente limpo, seções coronais de 400 micrômetros de espessura do mesencéfalo na frequência de vibração mais alta e velocidade de avanço relativamente baixa usando uma pipeta de macarrão invertida com bulbo de sucção, colete e transfira as fatias contendo o VTA em placas de Petri de 35 por 10 milímetros preenchidas com solução de olhar resfriado estéril para seções corticais. Repita as etapas anteriores de corte, mas aplique um corte vertical entre o córtex e o cerebelo e monte os quatro cérebros com o pólo frontal para cima.

Colete cerca de três cortes coronais de 350 micrômetros de espessura, começando no nível do estriado. Agora, usando uma microfaca feita de lâminas de barbear quebradas, disseque seções coronais de cerca de dois milímetros de largura do córtex frontal e das áreas do mesencéfalo contendo o VTA sob um microscópio estéreo. Colete a seção de tecido separadamente em pequenos pratos cheios de solução de olhar gelada.

Para começar a montar o tecido na primeira posição da câmara MEA, o MEA à temperatura ambiente sob um microscópio estéreo com o conjunto de eletrodos em foco. Em seguida, centralize uma gota de plasma de 25 microlitros na matriz de eletrodos limpa, livre de poeira e estéril. Usando uma pequena espátula, deslize cuidadosamente um córtex e uma seção VTA na gotícula de plasma.

Agora coloque o MEA em uma placa de resfriamento e reoriente a visualização. Deixe esfriar por cerca de 15 segundos antes de adicionar 25 microlitros de trombina na gota de plasma. Em seguida, usando a ponta da pipeta de trombina, espalhe cuidadosamente a mistura de trombina plasmática com pequenos movimentos circulares através do MEA.

Tenha cuidado para não tocar diretamente no conjunto de eletrodos quebradiços. Em seguida, posicione suavemente o córtex na matriz com a borda dorsal ao longo da segunda fileira de eletrodos da matriz. Dessa forma, as camadas superficiais em desenvolvimento acabarão cobrindo o restante da matriz.

Em seguida, coloque o VTA adjacente à borda ventral da seção do córtex. Agora tampe e feche frouxamente a câmara MEA para reter a alta umidade. Deixe o conjunto de cultura MEA descansar por cerca de seis minutos dentro do capô em temperatura ambiente para permitir trombina plasmática, coagulação e euforia.

Enquanto isso, repita o procedimento para preparar mais três culturas. Em seguida, em pequenas gotículas, adicione cuidadosamente 600 microlitros de meio de cultura às câmaras de cultura, usando uma seringa de um cc com uma agulha de calibre 25 por cinco oitavos. Em seguida, feche bem a câmara MEA e coloque o conjunto de cultura MEA na bandeja de armazenamento oscilante dentro da incubadora.

Após dois dias, in vitro, adicione 10 microlitros de inibidor de mitose. Em seguida, refresque os meios de cultura em 60% em quatro dias in vitro e a cada quatro dias a partir de então. Durante o crescimento normal, a cultura se achatará substancialmente e se expandirá ligeiramente dorsalmente.

Devido ao desenvolvimento de camadas corticais superficiais, uma cultura saudável é identificada por seu tecido acinzentado opaco em campo claro. Por outro lado, vesículas reflexivas brilhantes, uma característica das células degenerativas mortas cerca de 10 a 12 dias após a preparação das culturas, estão prontas para registro e estimulação. Para iniciar uma sessão de gravação, o MEA é transferido da bandeja de armazenamento para o estágio do cabeçote de gravação.

Para registrar o potencial de campo local ou LFP, use um filtro passa-banda de um a 200 hertz. A atividade de várias unidades também pode ser estudada usando um filtro passa-banda de 300 a 3000 hertz. A atividade espontânea saudável tende a ocorrer em rajadas de tamanho e duração diversos.

Para estudar a relação entre LFP e atividade unitária, podemos calcular médias de pico desencadeadas de LFP. Para essas culturas de córtex, as deflexões negativas de LFP estão correlacionadas com o pico neuronal para registrar a atividade evocada pelo estímulo. Primeiro, a forma de onda temporal e a amplitude dos estímulos são especificadas com um software que controla um gerador de estímulos.

Um paradigma de estimulação útil é o choque único neutro de carga controlada atual com forma de onda quadrada bipolar. Em seguida, é selecionado um eletrodo, que será usado para fornecer os estímulos. As respostas típicas de LFP evocadas por estímulo parecem semelhantes a explosões de atividade espontânea.

O circuito de supressão desconecta os amplificadores durante a estimulação para reduzir os artefatos de estímulo e evitar a saturação do amplificador. O eletrodo de estimulação requer vários segundos para se recuperar da estimulação e, portanto, não pode ser usado para registrar a atividade de resposta. No MEA tende a emergir em aglomerados espaço-temporais com atividade em um eletrodo, muitas vezes acompanhada por atividade em outros locais.

Ao mesmo tempo, as formas de onda típicas do LFP durante esses períodos de atividade são mostradas aqui plotando três aglomerados ocorrendo com vários segundos de intervalo para cada aglomerado. As deflexões negativas de LFP podem ser vistas em vários eletrodos dentro de uma janela de um segundo ao extrair picos de NLFP que cruzam um limiar de múltiplos sd negativos, a atividade na forma de horários de pico de NLFP é convenientemente visualizada em um Rasta em que colunas de pontos representam NPS quase coincidentes em vários eletrodos. A organização espaço-temporal dessa atividade é bastante complexa.

As colunas que parecem mais ou menos homogêneas em baixa resolução temporal são compostas de clusters separados em resolução temporal mais alta e assim por diante. O surgimento de clusters espaciais, GEOTEMPORAIS e LFP é altamente organizado em redes corticais. Mais especificamente, a organização é uma variante em escala para avalanches neuronais.

Isso é demonstrado calculando a probabilidade de tamanhos de cluster em uma determinada resolução temporal. Delta T.Aqui os clusters são compostos de NL FPS que ocorrem no mesmo ou em sucessivos intervalos de tempo quando o tamanho de tal cluster é expresso em número total de NFPS por cluster ou amplitudes NLFP integradas por cluster, as distribuições de tamanho do cluster revelam uma lei de potência com um expoente próximo a menos 1,5. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar cuidadosamente o tecido cerebral e cultivar culturas em matrizes de vários eletrodos para estudar a auto-organização da atividade neuronal.

Esses métodos também têm sido usados para estudar a relação entre atividade espontânea e atividade evocada por estímulo em redes corticais.