Ensaio de Quantificação de Infecção Bacteriana: Um Método para Quantificar a Carga Bacteriana Intraocular em Modelo de Endoftalmite Bacteriana em Camundongo

A endoftalmite bacteriana é uma doença inflamatória ocular que ocorre quando o Bacillus cereus - uma bactéria patogênica - infecta a região intraocular.

Para quantificar a infecção bacteriana, coloque um modelo de camundongo eutanasiado de endoftalmite bacteriana lateralmente em uma mesa de operação. Aplique uma leve pressão sob o olho para ajudar a separar o globo ocular da órbita. Transfira o globo ocular para um tubo contendo um tampão apropriado suplementado com coquetel de inibidores de protease.

Homogeneizar o tecido ocular para desintegrá-lo, liberando bactérias na suspensão. Os inibidores de protease presentes no tampão inativam as proteases celulares liberadas para manter a viabilidade bacteriana. Em seguida, dilua em série a suspensão bacteriana para obter várias concentrações de Bacillus cereus.

Tomar uma placa de cultura angular contendo o meio de ágar-ágar enriquecido e demarcar as linhas correspondentes a cada concentração de diluição. Dispense algumas gotas da suspensão bacteriana no topo da linha designada e deixe escorrer até chegar ao final da placa, ajudando na disseminação uniforme das bactérias. Achate a placa e incuba.

Durante a incubação, cada bactéria usa os nutrientes do ágar para proliferar e formar colônias individuais. O número de colônias diminui, correspondendo a um aumento na diluição da suspensão bacteriana. Conte o número de colônias em uma linha específica para quantificar a carga bacteriana ocular.

No ponto final experimental apropriado, adicione 400 microlitros de PBS suplementado com inibidor de protease em um tubo de colheita autoclavado rotulado por olho no gelo e coloque uma pinça de ponta fina aberta em ambos os lados do olho infectado. Empurre as pontas para baixo em direção à cabeça para proptose o olho.

Quando as pinças estiverem atrás do globo ocular, aperte as pinças e puxe a pinça para longe da cabeça para separar o globo ocular. Em seguida, coloque imediatamente o globo ocular no tubo de colheita devidamente rotulado. Dentro de 60 minutos após a coleta da amostra, coloque os tubos de colheita fechados em um homogeneizador de tecidos e homogeneize as amostras por dois períodos de homogeneização de um minuto, com um período de descanso de 30 segundos entre eles.

Após a homogeneização, coloque as amostras no gelo e use alíquotas de 20 microlitros de homogeneizado para diluir em série as amostras em 180 microlitros de PBS por diluição até atingir um fator de 1 vezes 10 elevado a 8 negativo. Em seguida, rotule cada linha de uma placa quadrada de BHI pré-aquecida com a concentração de diluição apropriada e, com a placa inclinada em um ângulo de 45 graus, adicione 10 microlitros de cada diluição em linhas individuais na parte superior da placa. Deixe cada amostra escorrer até quase atingir o fundo da placa antes de colocá-la plana. Quando as amostras forem absorvidas pelo ágar, transfira a placa para uma incubadora de 37 graus Celsius. As colônias devem começar a ser visíveis após oito horas de incubação.

Para uma representação precisa da concentração na amostra, conte a linha que tem entre 10 a 100 colônias.