Ensaio de Imunoesferas Multianalita: Uma Técnica de Imunoensaio Baseada em Fluxo para Detecção Simultânea de Vários Subtipos de Anticorpos em Amostra de Soro Humano

O ensaio de imunoesferas multianalitas usa várias microesferas revestidas de antígeno para reconhecer seus anticorpos alvo correspondentes simultaneamente.

Para iniciar este ensaio, pegue uma mistura de microesferas em um tubo contendo o tampão apropriado. Cada grânulo é revestido com um antígeno específico em sua superfície, permitindo fácil diferenciação dos grânulos uns dos outros.

Pipetar a mistura de imunoesferas revestida para os alvéolos de uma placa de ensaio de microtitulação. Suplementar os alvéolos com a amostra de soro contendo diferentes isotipos de anticorpos alvo. Essas variantes têm diferenças sutis em suas estruturas, permitindo que cada poço tenha vários anticorpos primários.

Incubar, para permitir que os isotipos de anticorpos da amostra se liguem a antígenos específicos capturados nas respectivas esferas imunológicas. Lave com um tampão de ensaio para remover anticorpos primários não ligados. Adicione anticorpos secundários marcados com corante fluorescente, correspondentes a cada variante do anticorpo primário, no poço.

Cada anticorpo secundário marcado se liga ao sítio Fc do respectivo anticorpo primário. Vários complexos de anticorpos primários de antígeno capturados por esferas são marcados com fluorescência. Lave a placa para remover anticorpos secundários não ligados.

Leia a placa usando um analisador fluorescente capaz de detectar simultaneamente diferentes fluoróforos em seus respectivos comprimentos de onda. Dependendo da detecção do sinal, vários isotipos de anticorpos séricos e sua ligação a diferentes antígenos podem ser avaliados.

Para desempenho do ensaio, ressuspenda as microesferas acopladas por vórtice por 30 segundos e sonice por 60 a 90 segundos. Em seguida, remova a quantidade necessária de cada colóide de grânulo do respectivo tubo e combine os colóides de grânulos em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetro.

Em seguida, insira o tubo em um separador magnético e deixe a separação por 60 segundos. Com o tubo ainda no separador magnético, remova o sobrenadante, sem perturbar o pellet do grânulo.

Depois de remover os grânulos do separador, ressuspenda os grânulos em 100 microlitros de tampão de ensaio. Vortex por 30 segundos antes de colocar o tubo em um separador magnético por 60 segundos, para separar as contas. Repita a lavagem duas vezes.

Em seguida, ajuste a concentração da mistura de microesferas de trabalho de três plex adicionando um volume apropriado de tampão de ensaio para gerar uma concentração final de 100 microesferas por 1 μL, para cada alvo.

Alíquota de 25 microlitros da mistura de microesferas em cada poço de uma placa de 96 poços. Dilua as amostras de plasma ou soro 500 vezes em tampão de ensaio e prepare as amostras padrão de acordo com a titulação desejada.

Adicione 25 microlitros de tampão de ensaio como amostra em branco e adicione cada uma das amostras diluídas ou padrão em cada poço designado de uma placa de amostra de 96 poços. Quando terminar, cubra a placa com uma vedação de alumínio ou papel alumínio para incubar por 1 hora em temperatura ambiente em um agitador de placas ajustado para 700 rotações por minuto.

Prepare uma solução de anticorpos anti-detecção humana, ou soluções de anticorpos secundários, a 4 μg/mL com tampão de ensaio, conforme descrito no manuscrito. Coloque a placa em um separador magnético para lavar rapidamente e, em seguida, inverta com força a placa sobre um recipiente de risco biológico para remover o líquido dos poços. Com a placa ainda invertida, bata com força na placa contra um maço grosso de papel.

Em seguida, lave cada poço com 100 microlitros de tampão de ensaio e remova o líquido por inversão forçada sobre um recipiente de risco biológico. Repita a lavagem duas vezes. Após a última lavagem, descarte todos os maços de papel usados em um recipiente de risco biológico.

Em seguida, adicione 25 microlitros de solução de trabalho de anticorpo secundário a cada poço de uma placa de 96 poços e cubra a placa com papel alumínio para incubar em um agitador de placas a 700 rotações por minuto.

Após 30 minutos de incubação, lave os poços da placa duas vezes com tampão de ensaio, conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de ensaio em cada poço da placa de 96 poços. Cubra o prato com papel alumínio e incube por cinco minutos em um agitador de pratos em temperatura ambiente.

Analise uma amostra de 60 microlitros através do analisador do instrumento de acordo com o manual do sistema.