Name: Multiplexados Metodologia de Testes de imunoensaio fluorimétrico e solução de problemas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprenda a realizar o ensaio de imunoensaio fluorimétrico multiplexado para detectar anticorpos contra agentes infecciosos em animais de laboratório. Este método aumenta a eficiência da sorovigilância.

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A pesquisa apresentada aqui foi apoiado por Charles River.

<ol><li>MFIA Rodent Methods Manual [Internet]. , Charles River. Available from:
		
	 <a target="_blank" href=" http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA Rodent_Methods_Manual.pdf"> http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA Rodent_Methods_Manual.pdf</a> (2011).</li>
<li>Rodent MFIA Validation Summary Report [Internet]. , Charles River. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA _summary_report.pdf">http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA _summary_report.pdf</a> (2007).</li>
<li>Jacobson, R. H., et al. Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobson%2C+RH+%22Manual+of+Standards+for+Diagnostic+Tests+and+Vaccines%22">Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines</a>. , Office International des Epizooties (OIE). France. 8-15 (1996).</li>
<li>Wright, P. F. International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests for antibody detection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWright%2C+PF+%22Rev.+sci.+tech.+Off.+int.+Epiz%22">Rev. sci. tech. Off. int. Epiz</a>. 17 (2), Office International des Epizooties (OIE). France. 527-533 (1998).</li>
<li>Pepe, M. S. The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction. , Oxford University Press. Oxford, New York. (2003).</li>
<li>Barr, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+interpretation+of+diagnostic+tests+for+feline+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Comparison and interpretation of diagnostic tests for feline immunodeficiency virus infection.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 199, 1377-1381 (1991).</li>
</ol>

Todo o trabalho de autores por Charles River RADS, um importante fornecedor de serviços de sorologia em animais de testes e reagentes.

O processo de teste MFIA é altamente eficiente, que requer menos equipamento e menores volumes de amostra e de reagente do que os testes tradicionais singleplex. A funcionalidade do sistema de multiplex dá ao utilizador a flexibilidade para rastrear simultaneamente por várias estirpes ou serotipos de agentes comuns em roedores de laboratório (Coronavirus ie, parvovírus, etc.) Isto também permite, de concepção personalizada painéis grânulo com base na área de interesse (ou seja, a família de vírus específico) e é adaptável a outros tipos de triagem de biomoléculas, incluindo citocinas e outros biomarcadores. Além disso, permite-nos incorporar vários ensaios de controlo interno a fim de verificar a adequação do sistema de amostra e e, assim, garantir a precisão dos resultados. Estes incluem o controlo de tecido e ensaio de IgG anti-imunoglobulina de espécies de soro (αIg) conjuntos de esferas revestidas para avaliar a adequação da amostra. Um tecido de controlo do grânulo detecta a ligação não específica de imunoglobulina do soro e a esfera de controlo αIg confirmaque o soro foi adicionado e contém uma concentração de imunoglobulina suficiente. Outra grânulo de controlo, revestidas com imunoglobulina de espécies de soro, demonstra que os reagentes marcados e leitor de ensaio estão a funcionar correctamente. Outros comercialmente disponíveis multiplex ensaios formato sorológicos (microarrays ie, ImmunoComb) pode não oferecer o mesmo nível de confirmação de resultado. A habilidade para diminuir a possível fonte de fracasso ensaio antes de reteste pode ajudar o pesquisador economizar em tempo e materiais. Aspectos críticos do MFIA deve ser confirmada antes de repetir uma amostra falhou. Uma vez que o ensaio é realizado à temperatura ambiente, deve-se verificar que a temperatura de laboratório é de cerca de 27 ° C ± 2 ° C, as temperaturas mais elevadas podem conduzir a uma redução do que esperado para controlos e amostras. Lavagem é, talvez, o passo mais importante no ensaio. Garantindo que a placa de teste é devidamente lavado e ressuspenso blotted pode eliminara grande maioria dos erros de amostragem, devido à baixa contagem de talão (devido esferas de agregados) ou a adição de reagente insuficiente (perdido por capilaridade para fora da parte inferior da placa de ensaio do filtro). Rotineiramente contar 25 pérolas por ensaio (agente) e não encontraram nenhuma diferença estatística nos resultados por contagem maior número de pérolas que também conduzem a um maior tempo de leitura para a placa. Realizamos estudos de validação abrangentes de MFIA em várias espécies de animais de laboratório comumente utilizados (camundongo, rato, hamster, porquinhos e coelho) para demonstrar a precisão diagnóstica, reprodutibilidade e robustez, testando um grande número de conhecidos positivos e negativos amostras de soro, e comparando sua ELISA, IFA e resultados MFIA. Os limites de detecção (isto é, o padrão de titulação de soro imune endpoints) de MFIA foram comparáveis, e em alguns casos ultrapassou, os de ELISA correspondente. Especificidade do diagnóstico, medida com roedores SPF soros, superou 99%, o betwee correspondência geraln ELISA e MFIA realizada em conhecidos soros positivos e negativos conhecidos foi superior a 95%. Em resumo, estes resultados mostraram que MFIA multiplex é um bom substituto para o ELISA singleplex, e é adequada para a sua pretendida utilização, ou seja, em serovigilância rotina de colónias de animais laboratoriais.

multiplexados metodologia de testes de imunoensaio fluorimétrico e solução de problemas

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

Para assegurar a qualidade dos modelos animais utilizados em pesquisa biomédica, temos desenvolvido um número de estratégias de ensaio e métodos de diagnóstico para determinar se os animais foram expostos a agentes infecciosos adventícias (vírus, micoplasmas e outros microorganismos aeróbios). Infecções de animais imunocompetentes são geralmente transitórios, mas as respostas de anticorpos séricos a infecção, muitas vezes pode ser detectado dentro de dias a semanas e persistir durante toda a vida do hospedeiro. Serologia é a metodologia de diagnóstico primário pelo qual os animais de laboratório são monitorizados. Historicamente, o ensaio com enzima ligada indirecto (ELISA) foi o principal método de rastreio para serovigilância. O ELISA é realizado como uma singleplex, em que uma reacção antigénio-anticorpo microbiana é medida por poço. Em comparação a MFIA é realizado como um ensaio multiplex. Uma vez que as micro-esferas entram em 100 conjuntos de cores distintas, até 100 diferentes ensaios podem ser realizados Simultaneously numa única microplaca bem. Esta inovação diminui a quantidade de soro, os reagentes e produtos descartáveis ​​requeridos para testes de rotina, enquanto que aumentando a quantidade de informação obtida a partir de um único teste bem. Além disso, são capazes de incorporar múltiplas esferas de controlo internos para verificação da amostra e adequação do sistema e, assim, garantir a precisão dos resultados. Estes incluem o controlo de tecido e ensaio de IgG anti-imunoglobulina de espécies de soro (αIg) conjuntos de esferas revestidas para avaliar a adequação da amostra. Tal como no ELISA e IFA, o controlo de tecido detecta a ligação não específica de imunoglobulina no soro. O controle αIg (controle de Soro) confirma que o soro tenha sido adicionado e contém uma concentração de imunoglobulinas suficiente enquanto o IgG esfera de controlo (controle de Adequação do Sistema), revestido com imunoglobulina espécie de soro, demonstra que os reagentes marcados e Luminex leitor estão funcionando corretamente.

Usando a tecnologia Luminex Corporation microesfera xMAP, desenvolvemos o imunoensaio multiplexado fluorométrico (MFIA) para serovigilância de várias espécies de animais de laboratório. O MFIA é um microarray de suspensão onde o antigénio controlo de tecido, ou imunoglobulinas são ligados covalentemente a um código de cores de poliestireno microesferas. O método de ensaio MFIA, bem como vários tópicos de resolução de problemas é abordada.

Multiplexados Metodologia de Testes de imunoensaio fluorimétrico e solução de problemas

Para garantir a qualidade dos modelos animais utilizados na pesquisa biomédica, desenvolvemos diversas estratégias e métodos de testes diagnósticos para determinar se ...

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar anticorpos contra agentes infecciosos adventícios em animais de laboratório. Isso é realizado incubando soro de teste com microesferas revestidas com antígeno. Em seguida, o soro é incubado com uma imunoglobulina anti-específica marcada com biotina, que detecta quaisquer complexos imunes antígeno-anticorpo.Em seguida, adiciona-se uma solução de streptavidina marcada com FICO eryn Fluor force para detectar qualquer imunoglobulina biotinilada. Os resultados obtidos mostram o status positivo ou negativo de anticorpos para agentes comuns em roedores de laboratório, com base na fluorescência multiplexa, pontuação líquida do imunoensaio e valores de fluorescência da amostra. A principal vantagem do uso dessa técnica em comparação com métodos existentes, como o ELISA, é que o MFIA é um ensaio multiplex. Isso permite ao pesquisador analisar até cem ensaios diferentes em um único teste.Bem, esta técnica reduz a quantidade de amostras de soro e descartes descartáveis utilizados nos métodos existentes, ao mesmo tempo em que aumenta a quantidade de informações geradas a partir de um único teste. Tivemos inicialmente a ideia de usar este método quando estávamos testando um grande número de amostras de soro para múltiplos agentes e desejávamos reduzir a mão de obra e também o tempo de teste. Demonstrando o procedimento estará Donna Cohen, tecnologista sênior do nosso laboratório. Para começar, tenha prontos os dois buffers necessários para o procedimento de imunoensaio fluorescente multiplexo ou MFIA.O primeiro é um diluente primário, disponível na Charles River e que contém agentes bloqueadores proprietários para reduzir interações inespecíficas no tampão de lavagem do ensaio. Prepare uma solução de PBS com BSA 1% pH 7,4 para remover partículas. Filtre o tampão através de uma unidade de filtro de garrafa de 0,2 mícron para recipientes estéreis rotulados, utilizando o tampão de lavagem do ensaio.Prepare duas concentrações de espécies antis biotiniladas, IGG ou BAG e strep AVID e FICO eritina ou SPE, que serão usadas para rotular os complexos antígeno-anticorpo formados durante a etapa de incubação com soro de teste, para preparar amostras dos seguintes materiais e descartáveis: pipetadores múltiplos e de canal único e ponteiras, e placas de microtitulação de 96 poços com baixa ligação proteica para diluição de proteínas. Após coletar as amostras de sangue e isolar o soro, vortexe brevemente o soro antes de diluir as amostras no diluente primário em uma placa de microtitulação de 96 poços, para garantir uma pré-umidificação adequada e uniforme dos poços. Preencha todos os poços da placa de teste de 96 poços com tampão de lavagem do ensaio e aspire lentamente a solução durante todo o ensaio.A aspiração deve levar de cinco a 10 segundos para evitar a agregação das microesferas e a compactação delas na membrana de filtro, o que pode retardar os tempos de leitura ao final do ensaio. Verifique se a drenagem do líquido cessou, pressionando a parte inferior da placa de teste com papel toalha. É importante pressionar a placa de teste após cada etapa de lavagem para evitar a capilaridade dos poços durante a incubação.Para preparar as esferas, comece agitando a suspensão estoque de esferas conjugadas em vórtex. Em seguida, sonique brevemente em banho de ultrassom. É crucial ressuspender adequadamente as esferas para evitar aglomerados, o que pode resultar em tempos de leitura mais longos.Em seguida, distribua a suspensão estoque 20 x para uma solução de trabalho de duas vezes a concentração de perolas no diluente primário. Então, distribua 50 microlitros da suspensão de perolas duas vezes a concentração em cada poço do ensaio na placa de teste previamente umedecida. Pipete 50 microlitros de cada soro de teste e controle duas vezes a concentração para a placa de teste com base em um mapa de placa predefinido.Fixe a tampa à placa. Cubra-a com papel alumínio e incube a placa de teste por 60 minutos em agitador orbital à temperatura ambiente para evitar a evaporação das soluções, o que pode comprometer o sucesso do ensaio. Mantenha a placa de teste coberta com a tampa da placa durante todas as etapas de incubação.Além disso, a agitação deve ser superior a 400, mas inferior a 700 RPM, para que as microesferas permaneçam em suspensão, permitindo que os anticorpos do soro tenham acesso a todas as superfícies dos antígenos conjugados. Após lavar a placa com incubações sequenciais das microesferas com BAG e SPE, lave novamente as amostras. Em seguida, reconstitua as microesferas adicionando 125 microlitros de tampão de lavagem do ensaio e agite por dois minutos para leitura da placa.Coloque-o no leitor do ensaio dentro de 10 minutos após a ressuspensão das microesferas; as microesferas passam uma a uma por um detector onde são expostas a dois lasers. Um laser excita os corantes internos que identificam o conjunto de cores das microesferas e o outro excita o corante marcador FICO eritina. A intensidade da fluorescência da FICO eritina para um número predeterminado de microesferas é relatada como a leitura FM FI; leia o primeiro poço para verificar se o painel de microesferas selecionado corresponde ao perfil das microesferas nos poços de teste.Se houver microesferas caindo fora da região designada para microesferas na exibição do protocolo, uma seleção incorreta de perfil foi realizada. Microesferas que foram adequadamente ressuspendidas preencherão suas regiões especificadas conforme indicado no software do leitor de ensaios. Se as microesferas estiverem agregadas, elas preencherão suas regiões em um ritmo lento.Você pode remover a placa de teste do leitor e ressuspender manualmente os poços para separar as microesferas. Remova a placa de teste do leitor e, com uma pipeta multicanal, aspire e expulse o conteúdo de cada poço três a quatro vezes. Em seguida, devolva a placa de teste ao leitor e continue examinando os resultados.Relate erros como contagens inadequadas de microesferas ou quedas nos escores de microesferas IgG anti-IgG e repita o ensaio para essas amostras. Após exportar os dados para o Excel e calcular a MFI líquida, determine se algum dos controles do ensaio de teste exclui o soro imune de faixa alta. Quaisquer controles com falha são inaceitáveis e o ensaio deve ser repetido.Esta tabela representa os dados de soro de teste e controles do ensaio de uma placa típica. Todos os controles de IgG foram aprovados. Os resultados deste ensaio indicam que diversas amostras reativas aos tecidos e controles de IgG falharam, conforme observado nas poças laranjas.A1C um e F1 indicam uma falha reativa do tecido TC, na qual a pontuação TC é representada entre parênteses; os poços B um e E um ilustram os dois tipos de falhas do controle interno de IgG, anticorpo teste insuficiente ou reagentes do teste, BAG ou SPE respectivamente. Os resultados da placa de teste são interpretados somente se o controle de adequação do sistema e o controle de soro atenderem aos critérios de aceitação mostrados aqui. Microesferas revestidas com imunoglobulina anti-soro específico da espécie podem apresentar pontuações insatisfatórias devido à adição de uma quantidade insuficiente de amostra, diluição da amostra muito elevada, espécie incorreta ou ao uso de soro proveniente de um hospedeiro imunodeficiente.Se os resultados do controle do ensaio de teste forem satisfatórios, as pontuações individuais dos ensaios são classificadas de acordo com o seguinte. Após este procedimento, devemos utilizar métodos adicionais como ELISA, IFA e ou blot de Western para confirmar achados iniciais inesperados ou positivos. É crucial verificar esses resultados antes de tomar qualquer decisão sobre o manejo dos animais.Isso pode ser feito utilizando diferentes metodologias na mesma amostra ou em amostras adicionais da mesma colônia. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o ensaio imunométrico multiplex com detecção fluorescente e interpretar os resultados obtidos em sua instalação. Isso permitirá que você reduza a mão de obra enquanto obtém mais informações de cada poço da amostra testada.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Detecção Bacteriana Quantitativa Multiplexada usando Microesferas Magnéticas Marcadas com Corante

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