Multiplexados Metodologia de Testes de imunoensaio fluorimétrico e solução de problemas
12 de dezembro de 2011
Usando a tecnologia Luminex Corporation microesfera xMAP, desenvolvemos o imunoensaio multiplexado fluorométrico (MFIA) para serovigilância de várias espécies de animais de laboratório. O MFIA é um microarray de suspensão onde o antigénio controlo de tecido, ou imunoglobulinas são ligados covalentemente a um código de cores de poliestireno microesferas. O método de ensaio MFIA, bem como vários tópicos de resolução de problemas é abordada.
O objetivo geral do experimento a seguir é detectar anticorpos contra agentes infecciosos adventícios em animais de laboratório. Isso é realizado incubando soro de teste com microesferas revestidas com antígeno. Em seguida, o soro é incubado com uma imunoglobulina anti-específica marcada com biotina, que detecta quaisquer complexos imunes antígeno-anticorpo.
Em seguida, é adicionada uma solução de FICO eryn Fluor marcada com estreptavidina para detectar qualquer imunoglobulina biotinilada. Os resultados obtidos mostram o status positivo ou negativo de anticorpos contra agentes comuns em roedores de laboratório com base na fluorescência multiplexa, no escore imunológico do ensaio e nos valores fluorescentes da amostra. A principal vantagem do uso dessa técnica em comparação ao método existente, como o ELISA, é que a MFIA é um ensaio multiplex. Isso permite ao pesquisador analisar até cem ensaios diferentes em um único teste.
Bem, esta técnica reduz a quantidade de amostras de soro e descartes descartáveis utilizados nos métodos existentes, ao mesmo tempo em que aumenta a quantidade de informações geradas a partir de um único teste. Tivemos inicialmente a ideia de usar este método quando estávamos testando um grande número de amostras de soro para múltiplos agentes e desejávamos reduzir a mão de obra e também o tempo de teste. Demonstrando o procedimento estará Donna Cohen, uma tecnologista sênior do nosso laboratório. Para começar, tenha prontos os dois buffers necessários para o procedimento de imunoensaio fluorescente multiplexo ou MFIA.
O primeiro é um diluente primário, disponível na Charles River e que contém agentes bloqueadores proprietários para reduzir interações inespecíficas no tampão de lavagem do ensaio. Prepare uma solução de PBS com BSA 1% pH 7,4 para remover partículas. Filtre o tampão através de uma unidade de filtro de garrafa de 0,2 mícron em recipientes estéreis rotulados, utilizando o tampão de lavagem do ensaio.
Prepare duas concentrações x de espécies antissoro biotiniladas, IGG ou BAG, e strep AVID e FICO eritina ou SPE, que serão usadas para marcar os complexos antígeno-anticorpo formados durante a etapa de incubação com soro-teste, para preparar amostras dos seguintes materiais e descartáveis: micropipetas multicanal e de canal único e ponteiras, e placas de microtitulação de 96 poços com baixa ligação proteica para diluição de proteínas. Após coletar as amostras de sangue e isolar o soro, vortexe brevemente o soro antes de diluir as amostras no diluente primário em uma placa de microtitulação de 96 poços para garantir uma evacuação adequada e uniforme dos poços. Pré-umedecer todos os poços da placa de teste de 96 poços com tampão de lavagem do ensaio e aspirar lentamente a solução ao longo de todo o ensaio.
A aspiração deve levar de cinco a dez segundos para evitar a agregação das microesferas e sua compactação na membrana de filtro, o que pode retardar os tempos de leitura ao final do ensaio. Verifique se a drenagem do líquido cessou, pressionando a parte inferior da placa de teste com papel toalha. É importante pressionar a placa de teste após cada etapa de lavagem para evitar a capilaridade dos poços durante a incubação.
Para preparar as esferas, comece por vórtex da suspensão estoque de esferas conjugadas. Em seguida, sonique brevemente em banho de ultrassom. É crucial ressuspender adequadamente as esferas para evitar aglomerados, o que pode resultar em tempos de leitura mais longos.
Em seguida, distribua a suspensão estoque 20 x para uma solução de perlas trabalhando a 2 x no diluente primário. Então, distribua 50 microlitros da suspensão de perlas a 2 x em cada poço do ensaio na placa-teste previamente umedecida. Pipete 50 microlitros de cada soro-teste e controle a 2 x para a placa-teste com base em um mapa de placa pré-definido.
Fixe a tampa à placa. Cubra-a com papel alumínio e incube a placa de teste por 60 minutos em um agitador orbital à temperatura ambiente para evitar a evaporação das soluções, o que pode comprometer o sucesso do ensaio. Mantenha a placa de teste coberta com a tampa da placa durante todos os passos de incubação.
Além disso, a agitação deve ser superior a 400, mas inferior a 700 rpm, para que as microesferas permaneçam em suspensão, permitindo que os anticorpos do soro tenham acesso a todas as superfícies dos antígenos conjugados. Após lavar a placa com incubações sequenciais das microesferas com BAG e SPE, lave novamente as amostras. Em seguida, reconstitua as microesferas adicionando 125 microlitros do tampão de lavagem do ensaio e agite por dois minutos para leitura da placa.
Coloque-o no leitor do ensaio dentro de 10 minutos após a ressuspensão das microesferas; as microesferas passam uma a uma por um detector onde são expostas a dois lasers. Um laser excita os corantes internos que identificam o conjunto de cores das microesferas e o outro excita o corante marcador FICO eritina. A intensidade da fluorescência da FICO eritina para um número predeterminado de microesferas é relatada como a leitura FM FI. Leia o primeiro poço para verificar se o painel de microesferas selecionado corresponde ao perfil das microesferas nos poços de teste.
Se houver microesferas caindo fora da região designada para microesferas na tela do protocolo, foi feita uma seleção incorreta de perfil. Microesferas que foram adequadamente ressuspendidas preencherão suas regiões especificadas conforme indicado no software do leitor de ensaios. Se as microesferas estiverem agregadas, elas preencherão suas regiões a uma taxa lenta.
Você pode remover a placa de teste do leitor e ressuspender manualmente os poços para separar as microesferas. Remova a placa de teste do leitor e, usando um pipetador multicanal, pipete cada poço três a quatro vezes. Em seguida, devolva a placa de teste ao leitor e continue examinando os resultados.
Relate erros como contagens inadequadas de microesferas ou quedas nos escores de microesferas IgG anti IgG, e repita o ensaio para essas amostras. Após exportar os dados para o Excel e calcular a MFI líquida, determine se algum dos controles do ensaio de teste exclui o soro imune de faixa alta. Quaisquer controles com falha são inaceitáveis e o ensaio deve ser repetido.
Esta tabela representa os dados de soro de teste e controles do ensaio provenientes de uma placa típica de ensaio. Todos os controles de IgG foram aprovados? Os resultados deste ensaio indicam que diversas amostras reativas aos tecidos e controles de IgG falharam, conforme observado nas poças laranjas.
A1C um e F1 indicam uma falha reativa do tecido TC, na qual a pontuação TC é representada entre parênteses; os poços B um e E um ilustram os dois tipos de falhas do controle interno de IgG, anticorpo teste insuficiente ou reagentes do teste, BAG ou SPE respectivamente. Os resultados da placa de teste são interpretados somente se o controle de adequação do sistema e o controle de soro atenderem aos critérios de aceitação mostrados aqui. Microesferas revestidas com imunoglobulina anti-soro específico da espécie podem apresentar pontuações insatisfatórias devido à adição de uma quantidade insuficiente de amostra, diluição da amostra muito elevada, espécie incorreta ou ao uso de soro proveniente de um hospedeiro imunodeficiente.
Se os resultados do controle do ensaio de teste forem satisfatórios, as pontuações individuais do ensaio são classificadas de acordo com o seguinte. Após este procedimento, devemos utilizar métodos adicionais, como ELISA, IFA e ou Western blot, para confirmar achados iniciais inesperados ou positivos. É fundamental verificar esses resultados antes de tomar qualquer decisão sobre o manejo dos animais.
Isso pode ser feito utilizando diferentes metodologias na mesma amostra ou em amostras adicionais da mesma colônia. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o ensaio imunológico multiplex com detecção fluorométrica e interpretar os resultados obtidos em sua instalação. Isso permitirá que você reduza a mão de obra enquanto obtém mais informações de cada poço da amostra testada.
Visão Geral
Este estudo apresenta o desenvolvimento do Ensaio Imunofluorométrico Multiplexado (MFIA) utilizando a tecnologia xMAP da Luminex Corporation para sorovigilância em animais de laboratório. O MFIA permite a detecção simultânea de anticorpos contra múltiplos agentes infecciosos, aumentando a eficiência e reduzindo o uso de recursos nos testes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Testes sorológicos
- Saúde de animais de laboratório
Antecedentes
- Métodos sorológicos tradicionais, como ELISA, são demorados e intensivos em recursos.
- A MFIA permite multiplexação, possibilitando a triagem de inúmeros ensaios simultaneamente.
- Este método tem como objetivo melhorar a detecção de anticorpos em animais de laboratório.
- O uso eficiente de amostras de soro e descartáveis é uma vantagem fundamental da MFIA.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método mais eficiente para detectar anticorpos contra agentes infecciosos em animais de laboratório.
- Reduzir o tempo e o trabalho associados aos métodos tradicionais de teste.
- Fornecer uma avaliação abrangente do status de anticorpos em um único teste.
Métodos Utilizados
- Incubação do soro de teste com microesferas revestidas com antígeno.
- Uso de anti-imunoglobulina biotinilada para detectar complexos antígeno-anticorpo.
- Aplicação de soluções de detecção marcadas com estreptavidina para medição da fluorescência.
- Configuração de ensaio multiplex utilizando formato de placa de microtitulação de 96 poços.
Resultados Principais
- Detecção bem-sucedida de anticorpos contra diversos agentes infecciosos em animais de laboratório.
- Redução do volume de soro e do uso de descartáveis demonstrada em comparação com ensaios tradicionais.
- Resultados quantitativos obtidos por meio de análise de fluorescência multiplexada.
- Identificação de possíveis problemas com agregação de microesferas que afetam o desempenho do ensaio.
Conclusões
- A AMIF é uma alternativa viável aos métodos sorológicos tradicionais.
- Essa técnica aumenta a eficiência da sorovigilância em ambientes laboratoriais.
- Pode ser necessária mais otimização para enfrentar desafios técnicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A Imunoensaio Fluorométrico Multiplexado (MFIA) atende à necessidade de sorovigilância de alto rendimento em pesquisas pré-clínicas, permitindo a detecção simultânea de anticorpos contra múltiplos agentes infecciosos. Essa capacidade reduz o consumo de amostras, o uso de reagentes e o tempo do ensaio, ao mesmo tempo que aumenta a densidade de dados por poço do teste. Para a pesquisa e desenvolvimento em biofármacos, a MFIA auxilia na validação precoce de alvos e na redução de riscos mecanicistas, fornecendo dados confiáveis e quantitativos sobre o status imunológico a partir de volumes limitados de amostras pré-clínicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio de perfis abrangentes de exposição a patógenos em modelos animais.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao esclarecer variáveis confundidoras decorrentes de infecções adventícias.
- Confiabilidade Preditiva: Aprimora a triagem de portfólios ao identificar modelos com integridade imunológica comprometida.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores mediante verificação rigorosa do status de saúde.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade de ensaios por meio de microesferas de controle interno (tecido, IgG e controles de adequação do sistema).
- Escalabilidade: Permite prontidão para triagem em até 100 ensaios por poço, melhorando a reutilização da plataforma em campanhas de triagem de anticorpos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Discute a relevância para doenças ao garantir que modelos animais estejam livres de agentes infecciosos confundidores que poderiam distorcer os resultados fenotípicos.
- Valor Operacional: Descreve a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, mantendo a integridade do modelo ao longo das fases do estudo.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Apoia critérios de prosseguir/não prosseguir com base no status de saúde sorológico antes da administração do composto.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A AMIF insere-se no continuum de descoberta desde a Descoberta Inicial até a Identificação de Fármacos e trabalhos Pré-clínicos, atuando como uma etapa de triagem quanto à adequação do modelo antes da triagem de compostos ou testes de eficácia.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método apoia o teste de hipóteses ao verificar que os fenótipos observados não são causados por infecções subclínicas.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio por meio de saídas quantitativas de MFI líquido e controles embutidos que garantem a confiabilidade dos dados.
- Análises: Destaca as medições de fluorescência multiplex e os cálculos de escore líquido que permitem comparação entre diferentes condições experimentais e painéis de antígenos.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método com a continuidade pré-clínica, assegurando que os sistemas relevantes para a doença permaneçam imunologicamente ingênuos ou adequadamente caracterizados.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável para monitoramento contínuo da saúde de colônias em múltiplos projetos e locais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução de ambiguidade mecanicista decorrente de fatores infecciosos perturbadores.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio de detecção multiplex baseada em microesferas e controles internos.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre avançar ou interromper projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados decorrentes de exposição não detectada a patógenos.
- Impacto na Carteira: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base na saúde verificada de modelos animais.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica necessária em princípios de imunoensaio, tecnologia Luminex e interpretação de dados multiplexados.
- Necessidades de instrumentação e infraestrutura analítica, incluindo leitor Luminex, agitador de placas e sistema de detecção de fluorescência.
- Requisitos de padronização entre equipes para preparo de reagentes, manipulação de microesferas e consistência do protocolo de lavagem.
- Considerações de adaptação entre sistemas modelo, incluindo seleção de antígenos específicos da espécie e validação de microesferas controle.
- Limitações práticas apoiadas pelo material de origem: agregação de microesferas afetando os tempos de leitura e a necessidade de ressuspensão adequada para evitar falsos negativos ou fundo elevado.
