Multiplexados Metodologia de Testes de imunoensaio fluorimétrico e solução de problemas

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar anticorpos contra agentes infecciosos adventícios em animais de laboratório. Isso é obtido incubando o soro de teste com microesferas revestidas de antígeno. Em seguida, o soro é incubado com uma antiimunoglobulina específica de espécie marcada biotinilada, que detecta quaisquer complexos imunes de anticorpos antígenos.

Em seguida, uma solução de força de fluor marcada com estreptavidina FICO eryn é adicionada para detectar quaisquer resultados de imunoglobulina biotinilada obtidos que mostrem status de anticorpos positivos ou negativos para agentes comuns em roedores de laboratório com base em fluorescência multiplex, pontuação líquida de imunoensaio, valores de amostra fluorescente. A principal vantagem de usar essa técnica em relação ao método existente, como o Eliza, é que o MFIA é um ensaio multiplex. Isso permite que um pesquisador rastreie até cem ensaios diferentes em um único teste.

Bem, essa técnica diminui a quantidade de regiões de soro e descartáveis de descarte usados nos métodos existentes, aumentando a quantidade de informações geradas a partir de um único teste. Bem, tivemos a ideia de usar esse método pela primeira vez quando estávamos testando um grande número de amostras de Sera para vários agentes e queríamos reduzir o trabalho e o tempo de teste. Demonstrando o procedimento estará Donna Cohen, uma tecnóloga sênior do nosso laboratório Para começar, tenha prontos dois tampões necessários para o procedimento multiplex, fluorescência, imunoensaio ou MFIA.

O primeiro é um diluente primário, que está disponível na Charles River e contém agentes bloqueadores proprietários para diminuir as interações inespecíficas para o tampão de lavagem do ensaio. Prepare uma solução de PBS com 1% BSA pH 7,4 para remover partículas. Filtre o tampão através de uma unidade superior de frasco de 0,2 mícron em recipientes rotulados estéreis usando tampão de lavagem de ensaio.

Preparar duas concentrações x de antiespécies biotiniladas, IGG ou BAG e estreptococos AVID e FICO erything ou SPE, que serão utilizados para marcar os complexos de anticorpos antigénios formados durante a fase de incubação do soro de ensaio para preparar amostras dos seguintes materiais e descartáveis montados micropipetas e pontas de canal único e multicanal, e 96 placas de microtitulação de baixa ligação às proteínas para diluição de proteínas. Depois de coletar amostras de sangue e isolar o soro agitar o soro brevemente antes de diluir as amostras em diluente primário em uma placa de microtitulação de 96 poços para garantir a evacuação adequada e uniforme do poço pré-umedecida. Cada poço da placa de teste de 96 poços com tampão de lavagem de ensaio aspira lentamente a solução durante todo o ensaio.

A aspiração deve levar de cinco a 10 segundos para evitar a agregação de grânulos e a compactação de grânulos na membrana do filtro, o que pode retardar os tempos de leitura no final do ensaio. Verifique se a drenagem de líquido parou enxugando a parte inferior da placa de teste com toalhas de papel. É importante secar a placa de teste após cada etapa de lavagem para evitar a absorção dos poços durante a incubação.

Para preparar os grânulos, comece por vórtice a suspensão do grânulo acoplado à matéria-prima. Em seguida, sonicá-los brevemente em um banho. É crucial ressuspender os grânulos adequadamente para evitar aglomerados de grânulos agregados, o que pode resultar em tempos de leitura mais longos.

Em seguida, dispense a suspensão de estoque 20 x para uma solução de dois grânulos de trabalho no diluente primário. Em seguida, dispense 50 microlitros da suspensão de dois x grânulos em cada poço de ensaio da placa de teste pré-umedecida. Pipete 50 microlitros de cada dois x soro de teste e controle para a placa de teste com base em um mapa de placa predefinido.

Prenda a tampa ao prato. Cubra-o com papel alumínio e incube a placa de teste por 60 minutos em um agitador orbital à temperatura ambiente Para evitar a evaporação de soluções que podem impedir o sucesso do ensaio. Mantenha a placa de teste coberta com a tampa da placa durante todas as etapas de incubação.

Além disso, a agitação da velocidade deve ser superior a 400, mas inferior a 700 RPMs, de modo que os grânulos permaneçam em suspensão para permitir que os anticorpos séricos acessem todas as superfícies dos antígenos acoplados. Após lavar a placa em incubações sequenciais dos grânulos com BAG e SPE, lave novamente as amostras. Em seguida, ressuspenda as contas adicionando 125 microlitros de ensaio, lave, tampone e agite por dois minutos para ler a placa.

Coloque-o no leitor de ensaio dentro de 10 minutos após a suspensão das contas, as contas passam uma de cada vez por um detector onde são expostas a dois lasers. Um laser excita os corantes internos que identificam o conjunto de cores das contas e o outro excita o corante repórter FICO erything. A intensidade da fluorescência da substância FICO para um número predeterminado de grânulos é relatada quando o FM FI lê o primeiro poço para verificar se o painel de grânulos selecionado corresponde ao perfil do grânulo nos poços de teste.

Se houver contas fora de sua região de contas designada na exibição do protocolo, uma seleção incorreta do perfil foi feita. Os grânulos que foram ressuspensos corretamente preencherão suas regiões especificadas, conforme indicado no software leitor de ensaio. Se as contas forem agregadas, elas preencherão suas regiões em um ritmo lento.

Você pode remover a placa de teste do leitor e ressuspender manualmente os poços para separar os grânulos. Remova a placa de teste do leitor e usando um triplo de pipeta multicanal cada poço três a quatro vezes. Em seguida, devolva a placa de teste ao leitor e continue examine os resultados.

Relate erros como contagens inadequadas de grânulos ou queda de escores de grânulos IgG anti IgG e repita o ensaio para essas amostras. Depois de exportar os dados para o Excel e calcular o MFI líquido, determine se algum dos ensaios de teste controla excluindo o soro imunológico de alta faixa. Quaisquer controlos falhados são inaceitáveis e o ensaio deve ser repetido.

Esta tabela representa os dados para o soro de teste e os controles de ensaio de uma placa de ensaio típica. Todos os controles de IgG foram aprovados. Os resultados do teste para esta peça indicam que várias amostras de controle de IgG e reativas ao tecido falharam, como visto em poços de laranja.

A1C um e F1 indicam uma falha reativa tecidual TC onde a pontuação TC é representada entre parênteses, Wells B um e E um ilustram os dois tipos de falhas de controle interno de IgG, anticorpo de teste insuficiente ou reagentes de teste, BAG ou SPE, respectivamente. Os resultados da placa de teste são interpretados apenas se o controle de adequação do sistema e o controle de soro atenderem aos critérios de aceitação mostrados aqui. Microesferas revestidas com imunoglobulina sérica antiteste específica da espécie podem apresentar pontuações de reprovação devido à adição de amostra insuficiente muito alta, diluição da amostra, espécie incorreta ou soro de teste de um hospedeiro imunodeficiente.

Se os resultados do teste de controle do ensaio forem satisfatórios, as pontuações individuais do ensaio são classificadas de acordo com o seguinte. Seguindo este procedimento, devemos usar métodos adicionais como Eliza, IFA e ou Western blot para confirmar os achados iniciais inesperados ou positivos. É crucial verificar esses resultados antes de tomar qualquer decisão de manejo animal.

Isso pode ser feito usando metodologias diferentes na mesma amostra ou amostras adicionais da mesma colônia. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar o fluoro multiplex, imunoensaio métrico e interpretar os resultados obtidos em suas instalações. Isso permitirá que você reduza a mão de obra enquanto coleta mais informações de cada poço de amostra de teste.