Um imunoensaio multiplex baseado em grânulos para quantificar vários alvos de citocinas

Pegue uma placa multipoços com filtros na base.

Adicione uma amostra de teste contendo citocinas diferentes.

Adicione diferentes conjuntos de microesferas diferenciadas por tamanho e intensidade de fluorescência interna.

Cada conjunto é conjugado a um anticorpo direcionado a uma citocina específica.

Incube a placa no escuro sob agitação.

Os anticorpos se ligam às citocinas-alvo, imobilizando-as nas microesferas.

Aplique um vácuo para remover as citocinas não ligadas. As citocinas ligadas à microesfera são retidas devido ao menor tamanho dos poros da membrana.

Adicione um coquetel de anticorpos de detecção conjugados com biotina que se ligam às citocinas ligadas à microesfera.

Adicione uma estreptavidina fluorescente conjugada com repórter e incube no escuro sob agitação. A estreptavidina se liga à biotina, imobilizando o repórter no complexo da microesfera.

Remova as moléculas não ligadas e ressuspenda as microesferas.

Usando citometria de fluxo, identifique as citocinas ligadas determinando o tamanho e a fluorescência interna das microesferas.

Para determinar a quantidade de uma citocina específica, meça a intensidade de fluorescência do repórter.

Para realizar o ensaio, deixe todos os reagentes aquecerem à temperatura ambiente antes de usar.

Placas filtrantes de polipropileno são usadas nesta demonstração. É absolutamente essencial que a placa seja mantida na vertical durante todo o procedimento de ensaio, incluindo as etapas de lavagem, para evitar a perda dos grânulos.

Umedeça previamente o papel de filtro adicionando 100 microlitros de 1x tampão de lavagem a cada poço e deixe a placa descansar por 1 minuto em temperatura ambiente. Remova o volume do buffer usando o coletor de vácuo. Seque o excesso de tampão de lavagem do fundo do prato pressionando o prato em uma pilha de toalhas de papel limpas. Em seguida, coloque a placa em cima da tampa da placa invertida.

Para amostras sobrenadantes de cultura de células, adicione 25 microlitros de tampão de ensaio a todos os poços. Adicione 25 microlitros de cada padrão aos poços padrão. Por fim, adicione 25 microlitros de cada amostra aos poços de amostra. Vortex as contas misturadas por 30 segundos. Em seguida, adicione 25 microlitros das contas misturadas a cada poço, agitando o frasco de contas intermitentemente para evitar que as contas se assentem.

Sele a placa com um selador de placas. Depois de selado, embrulhe toda a placa, incluindo a tampa da placa invertida, com papel alumínio. Coloque a placa em um agitador de pratos, prenda-a e agite a aproximadamente 500 RPM por duas horas em temperatura ambiente. Sem inverter, coloque a placa no coletor de vácuo e aplique o vácuo como antes. Em seguida, adicione 200 microlitros de 1x tampão de lavagem a cada poço.

Remova o conteúdo dos poços da placa de ensaio por filtração a vácuo. Seque o excesso de tampão de lavagem do fundo do prato com um absorvente ou toalhas de papel antes de repetir esta etapa mais uma vez. Em seguida, adicione 25 microlitros de anticorpos de detecção a cada poço. Depois de selar a placa com um selador de placa novo, embrulhe toda a placa, incluindo a tampa da placa invertida, com papel alumínio.

Coloque a placa em um agitador de pratos e agite a aproximadamente 500 RPM por 1 hora em temperatura ambiente. Sem aspirar, adicione 25 microlitros de reagente de ficoeritrina estreptavidina diretamente em cada poço. Sele e embrulhe o prato como antes. Então. coloque a placa em um agitador de pratos e agite a aproximadamente 500 RPM por 30 minutos em temperatura ambiente.

Depois de repetir a etapa de filtração a vácuo duas vezes, adicione 200 microlitros de 1x tampão de lavagem a cada poço. Ressuspenda as contas em um agitador de pratos por 1 minuto. Usando uma pipeta multicanal, transfira as amostras da placa filtrante para os tubos FACS para ler as amostras em um citômetro de fluxo.