Bioensaio de células Caco-2: um método in vitro para medir a biodisponibilidade de ferro em fontes alimentares complexas

Os enterócitos são células especializadas do intestino delgado que desempenham um papel crucial na absorção de nutrientes, incluindo a absorção de ferro.

Para avaliar a biodisponibilidade do ferro - a proporção de ferro ingerido acessível para funções fisiológicas - pegue uma solução acidificada contendo a amostra do alimento. Agora, adicione pepsina - uma enzima de digestão de proteínas, do estômago. Em pH ácido, a pepsina inicia a digestão gástrica quebrando proteínas dietéticas complexas em pequenos peptídeos.

Adicione bicarbonato de sódio para aumentar o pH e interromper a digestão gástrica. Adicione uma solução contendo enzimas pancreáticas e bile para simular a digestão intestinal. Transferir a mistura para a parte superior de um sistema de cultura celular de duas câmaras.

A câmara inferior contém enterócitos diferenciados do Caco-2 - uma linha celular de adenocarcinoma de cólon. Uma membrana de diálise separa a câmara superior da inferior. A membrana permite a difusão de espécies de baixo peso molecular.

A mistura de enzimas pancreáticas e bile na câmara superior decompõe carboidratos, proteínas e lipídios em subunidades menores - liberando ferro na forma de íons férricos.

Os intensificadores de biodisponibilidade nos alimentos convertem os íons férricos liberados para o estado ferroso - aumentando sua solubilidade. Esses íons passam pela membrana para atingir a câmara inferior.

Os transportadores de íons metálicos na membrana celular dos enterócitos auxiliam na captação de íons ferrosos. Uma vez dentro, o ferro se liga à apoferritina - uma proteína de armazenamento de ferro que resulta em um complexo, a ferritina. Colha as células para quantificar a ferritina para avaliar a biodisponibilidade do ferro.

Pesar a amostra num tubo de centrifugação estéril de 50 mililitros. Ajuste o pH usando ácido clorídrico e adicione 10 mililitros de solução salina fisiológica contendo 140 milimolares de cloreto de sódio e 5 milimolares de cloreto de potássio. Em seguida, defina o processo de digestão gástrica adicionando 0,5 mililitros da solução de pepsina suína preparada à amostra.

Em seguida, incube em um agitador de balanço em uma configuração suave, por 1 hora a 37 graus Celsius, e inicie o processo de digestão intestinal de cada amostra ajustando o pH para 5,5-6,0 com bicarbonato de sódio 1,0 molar.

Adicione 2,5 mililitros da solução de bile pancreática a cada tubo de amostra e ajuste o pH para 6,9-7,0 com bicarbonato de sódio 1,0 molar.

Usando a solução contendo cloreto de sódio 140 milimolar e cloreto de potássio 5 milimolar, adicione líquido de modo que cada tubo contenha exatamente 15 gramas de material total.

Agora, transfira 1,5 mililitros de cada digestão intestinal para a câmara superior do poço contendo as células Caco-2 da placa de cultura de 6 poços. Recoloque a tampa da placa e incube a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono em um agitador de balanço a 6 oscilações por minuto, por 2 horas.

Remova o anel de inserção com o digestor. Em seguida, adicione 1 mililitro de meio essencial mínimo a pH 7 em cada poço e mantenha a placa de volta na incubadora por 22 horas.

Agora, remova o meio de cultura celular e adicione 2 mililitros de água de 18 mega ohm (MΩ) à monocamada celular. Transfira-o para um sonicador e colha todo o lisado celular em tubos de microcentrífuga para análises de proteínas celulares e ferritina celular.