Ensaio Colorimétrico à Base de Sulfonato de Batofenantrolina: Um Método Simples e Rápido para Quantificação de Ferro Não-Heme em Tecido Hepático de Camundongo

Nos tecidos, o ferro, mineral essencial crucial para vários processos metabólicos, normalmente existe sequestrado para hemoproteínas e proteínas de ferro não heme. As hemoproteínas incluem ferro ferroso ou heme ligado a anéis de porfirina, enquanto as proteínas de ferro não heme não possuem a estrutura do anel de porfirina e compreendem principalmente ferro férrico ou não heme.

Para estimar o teor de ferro não-heme no tecido hepático de camundongo, trate um fragmento de tecido hepático de camundongo seco e colhido com baixas concentrações de ácido clorídrico e ácido tricloroacético. Incube em altas temperaturas para digerir o tecido e facilitar a precipitação de proteínas induzida por ácido.

Devido às baixas concentrações de ácido, o ferro não-heme é liberado das proteínas associadas. O ferro heme, estando ligado ao anel de porfirina, permanece inalterado.

Após o resfriamento, transfira o volume desejado de sobrenadante contendo ferro não heme para uma placa de vários poços. Adicionar o quelante de ferro cromogénico, sulfonato de batofenantrolina, BPS, suplementado com ácido tioglicólico, um agente redutor, em tampão adequado e incubar.

O ácido tioglicólico reduz todo o ferro férrico não-heme a ferro ferroso, que pode se ligar facilmente ao BPS na proporção de 1:3, formando um complexo altamente estável de cor rosa. Além disso, o ácido tioglicólico evita a interferência devido a quaisquer cátions metálicos divalentes contaminantes, como o cobre, que possam interagir com o BPS.

Coloque a placa de vários poços em um leitor de microplacas para medir a absorbância dos complexos ferrosos rosa-BPS, representativos da concentração de ferro não heme no fragmento de tecido hepático de camundongo.

Transfira cada pedaço seco de tecido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 1 mililitro da mistura ácida ao tubo e feche-o. Prepare um branco ácido da mesma maneira, exceto que o tecido é omitido aqui.

Incube os tubos a 65 graus Celsius por 20 horas para digerir o tecido.

Após o resfriamento à temperatura ambiente, use uma micropipeta equipada com pontas de plástico para transferir 500 microlitros do extrato ácido transparente para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Prepare reações cromógenas diretamente nas microplacas de poliestireno de fundo plano, 96 poços, transparentes e não tratadas. Incube em temperatura ambiente por 15 minutos.

Meça a absorbância da amostra em um leitor de placas em um comprimento de onda de 535 nanômetros em relação a uma referência de água deionizada.