Imagem de fase quantitativa tridimensional para caracterização de subtipos de linfócitos

Carregue uma suspensão do subtipo linfócito em uma câmara de imagem.

Posicione a câmara no estágio do microscópio de imagem de fase quantitativa 3D.

Ajuste os parâmetros do microscópio e o plano focal para obter imagens ideais.

Durante a imagem de linfócitos, o feixe de laser se divide em feixes de referência e amostra.

O Dispositivo de Microespelho Digital, com uma matriz de microespelhos no caminho do feixe de amostra, permite que o feixe gire 360 graus em torno do eixo óptico.

Cada feixe que passa pelo linfócito sofre uma mudança de fase com base nas variações do índice de refração dentro da célula.

A amostra resultante e os feixes de referência se recombinam, formando um holograma 2D.

Uma sequência de hologramas contendo informações de fase e amplitude de diferentes ângulos é capturada através da rotação do feixe ao redor do linfócito.

Adquira vários hologramas de fundo com ângulos de iluminação variados, excluindo linfócitos.

Usando o algoritmo de tomografia de difração, reconstrua os hologramas em um tomograma de índice de refração 3D, fornecendo informações morfológicas e bioquímicas dos linfócitos sem a necessidade de marcação.

Para obter imagens ideais, dilua cada amostra de célula a uma concentração de 180 células por microlitro de meio RPMI e injete lentamente 120 microlitros da primeira amostra diluída em uma câmara de imagem. Depois de confirmar a falta de bolhas dentro da câmara, coloque uma gota de água destilada na lente objetiva de um microscópio de fase quantitativa 3D e coloque a câmara de imagem no estágio de tradução do microscópio. Ajuste a platina para que a amostra se alinhe com a lente objetiva e clique em Foco e superfície na guia Calibração da perspectiva do microscópio do software de imagem para ajustar as posições axiais da objetiva e das lentes condensadoras, respectivamente.

Clique em Modo Automático para alinhar a objetiva e as lentes condensadoras. Para otimizar o alinhamento, abra o Modo de digitalização e ajuste manualmente as lentes para alinhar o padrão do dispositivo de microespelho digital ao centro. Em seguida, retorne ao Modo Normal e ajuste o estágio de tradução para localizar uma célula no campo de visão. Ajuste a posição axial da lente objetiva para encontrar o plano focal até que o limite da amostra visualizado na tela seja quase invisível.

É importante ajustar perfeitamente o foco da célula para gerar um tomograma 3D RI ideal. Se a imagem não for tirada corretamente, a reconstrução 3D será prejudicada, resultando em um tomografia ruidosa.

Ajuste o estágio de tradução para encontrar um local sem uma célula e clique em Calibrar para medir vários hologramas 2D com ângulos de iluminação variados. Ajuste o estágio de conversão para localizar uma célula no centro do campo de exibição e, na guia Aquisição, nomeie a amostra que está sendo criada.

Clique em Instantâneo 3D para medir os hologramas da célula usando os mesmos ângulos de iluminação dos hologramas 2D que acabaram de ser medidos. Quando os dados adquiridos aparecerem no painel de gerenciamento de dados, clique com o botão direito do mouse em Dados e clique em Processar para reconstruir um tomograma de índice de refração 3D a partir dos hologramas 2D usando o algoritmo de tomografia por difração implementado no software de imagem. Após a geração de imagens, no painel Gerenciamento de dados, clique com o botão direito do mouse em Dados e clique em Abrir para visualizar os dados.

Clique no centro da célula para reposicioná-la e clique em Tomografia RI no painel Gerenciador de dados. Na guia Predefinição, clique em Carregar e clique duas vezes em lymphocytes.xml, que é uma função de transferência predefinida fornecida pelo software de imagem para visualizar o tomograma de acordo com as distribuições de RI 3D. Role o mouse para aumentar o zoom e arraste a célula para girá-la em qualquer direção.