Microscopia de luz-folha para visualização tridimensional de células do sistema imunológico humanas

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia, como exatamente as células imunes se comportam em um contexto fisiologicamente relevante, como pesquisar células-alvo de forma eficiente em um ambiente tridimensional. A principal vantagem deste método é gerar uma folha de luz muito fina para iluminar apenas o plano focal sem afetar as células fora do plano. Isso permite uma velocidade de aquisição muito rápida com uma redução pronunciada do branqueamento e da fotocitotoxicidade.

Demonstrando este procedimento estará o Dr. Renping Zhao, um pós-doutorado do meu laboratório. Para começar, sob uma capa de cultura de células, transfira 400 microlitros de solução de estoque de colágeno resfriado para um tubo estéril de 1,5 mililitro. Adicione lentamente 50 microlitros de PBS 10X resfriado.

Em seguida, misture a solução inclinando suavemente o tubo. Adicione 48 microlitros de hidróxido de sódio 0,1 molar à solução de colágeno para ajustar o pH para 7,2 a 7,6. Use tiras de teste de pH para determinar o valor do pH da mistura.

Adicione dois microlitros de água destilada deionizada estéril para trazer o volume final para 500 microlitros. Misture bem e armazene a solução de colágeno no gelo ou a quatro graus Celsius até o uso posterior. Após a marcação fluorescente das células vivas de acordo com o protocolo de texto, sob a capa de cultura de células, transfira uma vez 10 para a sexta célula para um tubo estéril de 1,5 mililitro.

Centrifugar o tubo a 200 vezes g durante oito minutos. Em seguida, descarte o sobrenadante e use 200 microlitros de meio de cultura para ressuspender o pellet. Adicione 85,9 microlitros da solução de colágeno neutralizado à suspensão celular e misture adequadamente para atingir uma concentração de colágeno de 2,5 miligramas por mililitro.

Deixe a mistura de colágeno celular no gelo no capô. Em seguida, insira um êmbolo no capilar correspondente até que o êmbolo esteja saindo um milímetro do capilar. Em seguida, molhe o êmbolo mergulhando-o no meio de cultura.

Pular esta etapa pode resultar na introdução indesejável de bolhas de ar entre o êmbolo e a matriz de colágeno. Mergulhe o capilar na mistura de colágeno celular e puxe lentamente o êmbolo para trás 10 a 20 milímetros. Em seguida, com um borrifador de etanol a 70%, umedeça uma toalha de papel e use-a para limpar a parede externa do capilar para remover a solução de colágeno restante.

Agora use massa de modelar para montar o capilar na parede interna de um tubo de cinco mililitros. Empurre a mistura de colágeno celular até a borda do capilar. Em seguida, incube o tubo com o capilar a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por uma hora para polimerizar o colágeno.

Após a incubação, adicione um a dois mililitros de meio de cultura ao tubo. Em seguida, expulse cuidadosamente a haste de colágeno polimerizada para o meio até que aproximadamente metade do colágeno esteja pendurado no meio. Incube o capilar por mais 30 minutos.

Para realizar a microscopia de folha de luz, monte a câmara de amostra de acordo com as instruções do fabricante. Depois de ligar o microscópio e a incubadora, se estiver fazendo imagens ao vivo, coloque o capilar na câmara de amostra, localize a amostra e encontre a área de interesse para aquisição de imagens. Ative os lasers correspondentes.

Em seguida, defina a potência do laser e o tempo de exposição. Defina também o tamanho do passo da pilha Z, as posições inicial e final da pilha Z e o intervalo de tempo para imagens de células vivas. Em seguida, inicie a aquisição da imagem.

Transfira um mililitro de paraformaldeído a 4% em PBS para um tubo de cinco mililitros sob uma capa química. Em seguida, mergulhe o capilar com o colágeno polimerizado na solução de paraformaldeído e use argila de modelagem para montar o capilar na parede interna do tubo. Pressione suavemente o êmbolo até que metade da haste de colágeno esteja pendurada na solução de paraformaldeído.

Em seguida, puxe o êmbolo para trás para levar a haste de colágeno de volta ao capilar. Remova o capilar do tubo e descarte o paraformaldeído. Monte o capilar em um tubo novo e adicione um mililitro de PBS.

Certifique-se de que o capilar esteja imerso no PBS. Pressione suavemente o êmbolo até que metade da haste de colágeno esteja pendurada na solução e incube por cinco minutos. Puxe o êmbolo para trás para pegar a haste de colágeno no capilar.

Em seguida, substitua o PBS por PBS novo e expulse a haste de colágeno na solução. Após a terceira lavagem, adicione um a dois mililitros de tampão de permeabilização de bloqueio no tubo. Expulse a haste de colágeno na solução e incube o tubo em temperatura ambiente por 30 a 60 minutos.

Substitua o tampão de permeabilização de bloqueio por 200 a 500 microlitros de anticorpos primários no tampão de permeabilização de bloqueio e incube a haste de colágeno submersa na solução por uma hora. Depois de usar PBST para lavar a haste de colágeno três vezes, incube a haste em anticorpos secundários no tampão de permeabilização de bloqueio à temperatura ambiente por uma hora. Após mais três lavagens em PBS, puxe a haste de colágeno de volta para o capilar e mantenha a amostra em PBS até a imagem.

Como visto neste filme, durante a migração, as células CTL transfectadas com uma proteína de fusão de actina EGFP formaram grandes saliências em forma de limão, franjadas por estruturas finas semelhantes a fusos. As trajetórias dos CTLs são ilustradas aqui com velocidade e persistência ou o deslocamento dividido pelo comprimento total da pista como os parâmetros medidos. As velocidades variam de 0,01 a 0,19 mícrons por segundo, com uma diferença de quase 20 vezes, e a persistência varia de zero a 0,7.

Esta figura mostra células CTL fixas em gel de colágeno 3D coradas para perforina-1 endógena e actina. A amostra foi iluminada de um lado ou de ambos os lados. De diferentes posições Z, as células são coradas uniformemente, indicando boa penetração de anticorpos nos géis de colágeno.

O CTL fixo exibiu a mesma morfologia das células vivas, indicando que a morfologia é bem mantida com este protocolo. Ao tentar este procedimento, é muito importante lembrar de evitar bolhas de ar e ajustar o valor do pH adequadamente. Seguindo este procedimento, outros métodos, como coloração de células vivas com moléculas de superfície específicas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como correlacionar o comportamento celular com a diferenciação ou com diferentes subtipos de células ou para investigar a interação célula-célula e o destino celular.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular, imunologia e pesquisa do câncer explorarem o comportamento celular, o destino celular, a diferenciação e a interação celular no sistema fisiologicamente mais relevante in vitro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar amostras com células embutidas em uma matriz de colágeno tridimensional, como visualizar amostras usando microscopia de folha de luz, viva ou fixa, e como rastrear a migração celular em 3D.