Dissecção e 2-Photon Imagens de linfonodos periféricos em ratos

Olá, meu nome é Melanie Matthew. Eu sou do laboratório de Micah Helen na Universidade da Califórnia em Irvine. E hoje vamos tirar os gânglios linfáticos de um camundongo com o propósito de imagens in situ para fótons.

Isso envolve a remoção dos gânglios linfáticos inguinais, dos gânglios linfáticos axilares e dos gânglios linfáticos cervicais. Os seis gânglios linfáticos periféricos que são fáceis de acessar em um camundongo Para obter células fluorescentes em nossos gânglios linfáticos de camundongo. Para obter imagens por meio de duas imagens inferiores, primeiro temos que fazer a transferência adotiva de células marcadas com fluorescência.

Então, para este experimento, vou mostrar primeiro a transferência adotiva. Então, aqui está nossa seringa de insulina de calibre 28. Vou carregá-lo com algumas células ou células.

Primeiro eu quero desparar ou a seringa para que ela voe facilmente. E vou carregar as células com cuidado. Vou fazer o meu melhor para não tocar nas laterais do tubo com a seringa de insulina, pois isso embotará a seringa e tornará mais difícil fazer a injeção na veia da cauda do camundongo.

Se houver bolhas de ar, você precisa sacudi-las para fora, meio que tirá-las do caminho. Toque-os para fora do caminho aqui. Então aqui estamos.

Agora estamos prontos para injetar essas células na veia da cauda. Ok, então aqui está nosso mouse C 57 preto seis. Vamos colocá-la lenta e suavemente no injetor da veia da cauda.

Muitos dos ratos não gostam disso, mas isso os impede de pular quando você está fazendo a injeção real e se machucando mais, ou você está recebendo uma picada de agulha, possivelmente. Então, você prende o mouse muito lentamente dentro. E agora você procura a veia da cauda ao longo dos lados do rato, a cauda do rato.

Portanto, uma grande artéria corre ao longo do topo. E então, de cada lado da cauda do rato, há duas veias longas e agradáveis. Vá até a ponta.

Então você pega sua agulha e começa baixo na cauda e procura uma veia. Então eu posso ver ali, há uma veia. Vou molhá-lo um pouco com etanol, pode torná-lo um pouco mais claro de se ver.

Ok, agora vamos injetar a veia da cauda e é importante manter o lado chanfrado da agulha para cima. Isso abriu a ponta da agulha para cima. E mover-se quase paralelo à cauda.

Você não quer entrar em um ângulo porque as veias estão bem no topo. Você só quer deslizar a agulha na veia da cauda muito lentamente. E ao fazer isso, você será capaz de sentir isso com um pouco mais de experiência.

Mas nas primeiras vezes você quer empurrar o líquido e ver se há alguma resistência. Se não houver resistência, você está na veia da cauda e pode fazer uma injeção rápida e fácil como a que acabei de fazer agora. Então você pode puxar lentamente a agulha para fora.

Outra confirmação de que você está na veia é que você terá uma pequena bolha de sangue do refluxo. Portanto, ter um bom refluxo de sangue saindo do local da injeção um pouco confirmará que você definitivamente estava na veia da cauda. E o rato deve parar de sangrar logo após a injeção.

Ok, então aqui está nosso camundongo preto de seis E vamos remover os gânglios linfáticos do camundongo dos flancos inguinais, que estão aqui, aqui embaixo da axila, que é onde você encontra seus gânglios axilares aqui. E do outro lado aqui. E então os nódulos cervicais superficiais, que estão aqui na garganta, ali e ali, um de cada lado.

Hi.So agora estamos prontos para dissecar nosso mouse. E vou começar prendendo o mouse na placa aqui na placa de dissecação. E vá em frente e fixe a pausa. Sim.

Você quer ter certeza de que é um trabalho de fixação seguro. Isso nos permitirá expor melhor os gânglios linfáticos periféricos. Então, eu geralmente prendo as quatro patas para baixo.

Eu não me preocupo com a cauda. Algumas pessoas também gostam de prender o rabo. E então, para evitar que o pelo entre na região onde estamos dissecando e se espalhe por todos os nossos gânglios linfáticos e nossos instrumentos, borrifamos o camundongo com 70% de etanol.

E agora que o camundongo está com etanol, vou fazer uma incisão na linha média. E eu faço isso puxando o pelo para longe do corpo. A pele que você pode ver, eu posso puxá-la para cima e fazer uma pequena tenda.

E isso impedirá que você corte o peritônio, o que você não quer fazer neste caso. Ok, então vou começar com minha incisão na linha média aqui em cima. Eu faço um pequeno corte e me certifico de que não estou no peritônio.

Você pode ver que há o peritônio embaixo. Eu deslizo minha tesoura por baixo do corte e lentamente trabalho separando a pele do peritônio, fazendo pequenos cortes à medida que vou, porque vamos tirar os gânglios linfáticos cervicais. Vou cortar todo o caminho até a mandíbula do rato com muito cuidado e lentamente, certificando-me de não atingir nenhum vaso sanguíneo importante.

E então, como estamos pegando os gânglios linfáticos inguinais, que estão na parte inferior do retalho cutâneo, vou fazer uma incisão na linha média até a cauda, a base da cauda ali. Então lá vamos nós. Há uma incisão na linha média para nós que funcionará.

Agora vou separar a pele do peritônio. Vou fazer isso suavemente com uma pinça afastando a pele do peritônio à medida que avança. E estou expondo o primeiro linfonodo que vamos dissecar.

Este é o linfonodo inguinal aqui embaixo no retalho cutâneo inferior. Então, agora que retirei uma aba de pele do corpo principal do camundongo, vou prendê-la para expor o linfonodo inguinal. Portanto, essa é uma melhor exposição do linfonodo inguinal, o que nos permitirá dissecá-lo de forma limpa.

Então, aqui temos o linfonodo inguinal exposto após a fixação. É normalmente encontrado no retalho de pele, logo acima da perna aqui. E é, você pode encontrá-lo olhando para a junção em forma de Y dos vasos sanguíneos que correm acima dela.

E aí está. Está enfiado com um pouco de gordura e os vasos sanguíneos correndo por cima. Tudo bem, agora vou remover o linfonodo inguinal.

Eu despasto minha pinça ao longo de ambos os lados do linfonodo para afastá-lo da gordura. Não queremos gordura. Com nossas imagens de dois fótons, isso obscurecerá a penetração do laser no tecido.

Vamos ver. É importante retirar toda a gordura do linfonodo, bem como manter o córtex do linfonodo intacto. Tudo bem, lá vamos nós.

Então, aqui está nosso linfonodo iena. Vou colocá-lo em nossa mídia e a boa maneira de saber se você tirou toda a gordura é se o linfonodo afunda. Depois de colocá-lo na mídia, ele vai afundar até o fundo.

Se houver alguma gordura, ela flutuará. Tudo bem, agora vou tirar o linfonodo auxiliar. Ele está localizado na axila do camundongo, ao longo de um vaso sanguíneo importante.

Então, às vezes pode ser complicado porque você terá muito sangramento que obscurecerá o nódulo. Mas vou mostrar o que faço e espero que não tenhamos nenhum sangramento desta vez. Então, eu desfaço o retalho de pele antes de tudo e, na verdade, desfaço esse antebraço ao lado do nó que quero pegar.

Isso me permite puxar a pele com mais destreza usando meus dedos, mas segure esse músculo que passa por cima da axila e isso deve sair e o nó axilar com alguns puxões suaves. E eu vou procurá-lo agora. E aí está.

Está bem ali na axila ao longo de um grande vaso sanguíneo. Então, agora vou dissecar o nó axilar e você pode prender novamente a pele ou segurá-la com os dedos, o que você se sentir mais confortável. Mas eu gosto de trabalhar com cuidado com isso.

Há muito pouca gordura ao redor desse linfonodo, o que o torna bom para imagens, mas fica próximo a um vaso sanguíneo importante, então você pode perdê-los às vezes se não tomar cuidado. Então, para o nó axilar, estou agarrando o tecido conjuntivo ao redor dele e apenas separando-o lentamente dos vasos sanguíneos. E Ok, e lá vamos nós.

Há o nosso nó axilar. Então está bem ali. É um bom linfonodo longo e plano.

E estou segurando um pouco do tecido conjuntivo que sobrou na lateral do nó para não danificarmos o nó real. Vamos fazer uma imagem para manter os gânglios linfáticos hidratados. Antes de fazermos a imagem do nosso instituto, nós os colocamos em meios independentes de CO2 em câmaras individuais para que possamos acompanhar os gânglios linfáticos inguinais, axilares e cervicais.

A maneira como você pode saber se fez uma boa preparação para o linfonodo é se ele vai afundar depois de dissecá-lo. Isso significa que há muito pouca gordura no linfonodo. Ok, agora vou remover o linfonodo cervical, cervical superficial.

E eu faço isso, começo fixando novamente a partir de quando tirei o nó axilar, meio que exponho o tecido cervical um pouco melhor. E os gânglios linfáticos cervicais estão perto dos músculos da mandíbula do camundongo. Na verdade, ao longo do lado.

Eles são os mesmos gânglios linfáticos que você pode sentir quando fica doente. Eles são os que seu médico sentirá se você estiver resfriado. E para fazer isso, eu gosto de enfiar meu dedo embaixo do tecido para puxá-lo para frente enquanto passo minha pinça ao longo do lado.

Eu deveria ter um linfonodo que sai. Oh, aí está. Está lá em cima no tecido.

Aí está. Portanto, há um nódulo cervical superficial. Você deve ter cuidado para não tomar glândulas salivares.

Você não encontrará células T em suas glândulas salivares. E esses linfonodos em particular têm quatro células T positivas marcadas com CFSC neles. Então, vamos mostrar alguns vídeos in situ dessas células t se movendo no tecido.

Ok, agora vou colar o linfonodo em uma lamínula de plástico inquebrável para que possamos prendê-lo na parte inferior do nosso estágio de imagem in situ. Dessa forma, não teremos movimento do tecido ou deriva de tecido enquanto estamos visualizando as células T. Então eu tenho aqui minhas lamínulas de plástico inquebráveis.

A primeira coisa que vou fazer é cortar um deles no tamanho certo para o nosso linfonodo. Então eu apenas pego minha tesoura e corto um pequeno quadrado aqui. Ok, então agora vou aplicar cola nele.

É um pouco de cola. Espalhe-o ao redor da peça de slide que cortamos. E então eu vou pegar um lenço umedecido e tirar um pouco da cola.

Esta é a cola que cobrirá o nó. Queremos apenas uma camada muito fina para não obscurecer a imagem. Vou então tirar um linfonodo da solução.

Então, vamos começar com nosso primeiro linfonodo aqui fora da mídia. Você quer ser gentil com isso. Você não quer danificar o córtex do nó.

Vou segurar apenas o canto dele e colá-lo na lâmina tocando o canto do linfonodo suavemente até a lâmina primeiro e depois puxando o linfonodo pela lâmina, prendendo-o à lâmina. Então eu usei esse pedacinho de gordura que foi deixado na borda do linfonodo para fazer isso. Então, na verdade, não estou interrompendo o córtex do nó.

Em seguida, pego o linfonodo e agora, para curar a cola, vou mergulhá-lo no mesmo poço de onde tirei a cola. Então, vou virá-lo de cabeça para baixo e mergulhá-lo suavemente na mídia que carrega toda a cola. Retire um pouco da cola exo que curou com ela.

Lá vamos nós. Agora temos um linfonodo preparado para imagens de dois fótons. Então é assim que você prepara os gânglios linfáticos para imagens de dois fótons in situ.

Agora vamos levá-los ao nosso microscópio, configurá-lo e obter ótimas imagens de células T que transferimos adotivamente. Então, aqui temos células T marcadas com CFSE se movendo dentro de um linfonodo inguinal. Este vídeo é acelerado cerca de 500 vezes e você pode ver que as células são altamente móveis.

Eles são ampliados em cerca de 20 x com nossa objetiva de imersão em água de 20 x. Este é apenas um exemplo de movimento de células T. Não fizemos nada para manchar as células circundantes.

Normalmente, em dois experimentos fotográficos mais avançados, você pode ter células dendríticas coradas, células B coradas e células T interagindo com células NK coradas. Você pode rotular praticamente qualquer tipo de célula que você esperaria ver dentro do linfonodo e ir em frente e imaginá-lo. Então é isso para o nosso instituto Protocolo de imagem de linfonodos.