Name: Dissecção e 2-Photon Imagens de linfonodos periféricos em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 48 s
Description: Aprenda a dissecar linfonodos periféricos em ratos para imagem de dois fótons in situ. Este método demonstra transferência adotiva de células T CD4+ e visualização da motilidade celular em imunologia.

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Queremos agradecer Paquette Rebecca de assistência com a preparação de reagentes. MPM é apoiado por uma bolsa Ruth Kirchstein L. predoctoral dos Institutos Nacionais de Saúde e apoio de bolsas de GM-41514 (MDC), NS-48252 (KGC), GM-48071 (IP), também do National Institutes of Health.

1. Transferência adotiva de células: Veia da cauda ou injeção intra-ocular são métodos adequados para a introdução de células-tracker rotulados ou proteína fluorescente que expressam linfócitos. Neste vídeo. demonstramos transferência adotiva de células por injeção veia da cauda. a. Materiais Células T CD4 + são rotulados com 1,4 mM CFSE por 30 minutos a 37 º C, lavados duas vezes, e re-suspenso em 100 mL de RPMI-1640. Células são carregados em uma seringa de insulina estéreis 28 gauge para injecção. O número de células utilizado depende da experiência que está sendo feito. Normalmente, 5 milhões de células T são suficientes para a visualização de células T simples. Um limitador de roedores para o mouse é necessário para evitar danos ao animal e para si mesmo. b. Protegendo o animal O mouse é garantido para a transferência adotiva por lentamente apoio do animal para o limitador de roedores (ver vídeo) e fechando a extremidade aberta do tubo delicadamente pressionando o êmbolo. Não deixe de ir a cauda do rato durante este processo, como alguns animais de pequeno porte pode virar-se dentro do limitador. Este método evita que o animal de ferir-se e de mover-se durante a injecção. Ao configurar o limitador de roedores, não empurre o êmbolo para dentro mais longe do que é necessário para manter o animal de saltar para a frente. Além disso, não empurre o êmbolo contra o animal, e não deixar o animal no limitador por um período prolongado de tempo. c. Visualização da veia da cauda Puxe o rabo em sua direção para que seja levemente enrolado ao longo do seu dedo indicador e segurou contra o interior do dedo pelo seu polegar. Identificar as veias da cauda localizados em cada lado da cauda na posição vertical. A visualização é facilitada pelo aquecimento da cauda com água morna, em seguida, limpar-se com etanol. d. Injeção de células Quando a veia foi localizada, insira a seringa bisel voltado para cima em um ângulo paralelo rasa para a veia. Uma vez na veia, gentilmente o êmbolo, se você está na veia não deve haver nenhuma resistência à injeção. Se houver resistência, retire a seringa e tente novamente em um local diferente. Se você está na veia, lentamente o êmbolo até que a injeção é completa. A cauda não deve tornar-se distendido durante a injecção. Se isso acontecer, isso significaria que a agulha não está na veia. É possível &quot;perder&quot; a veia durante a injeção. Se isso acontecer, retire a agulha e tentar a sua injeção em um local diferente. Se você precisa tentar mais de uma injeção, o melhor é mover a cauda para cima em direção ao corpo do mouse a partir do local da injeção original. Planejar com antecedência para essa possibilidade, iniciando distalmente na cauda para dar-se espaço para mais uma tentativa de transferência adotiva. e. Pós-injeção considerações Após a injeção for concluída, um pequeno refluxo de sangue da veia irá ocorrer. Pressione suavemente o local da injecção com um limpa-wipe até parar de sangrar. Retire o êmbolo e deixe o animal andar para a frente, fora do limitador, enquanto delicadamente segurando a cauda. Sempre verifique com seu comitê de cuidados com animais e protocolos de uso de animais para garantir que está em conformidade. É importante praticar esta técnica várias vezes antes de tentar a experiência real. 2. Isolamento do Linfonodo Isolamento dos gânglios linfáticos por dois fótons de imagem requer a remoção cuidadosa do linfonodo correta do tecido circundante. a. Seleção e localização de linfonodos periféricos Seleção de linfonodos para imagens vai depender dos objetivos experimentais. Estar ciente de infecção local ou injeção de drenagem dos gânglios linfáticos, e selecione o nó apropriado para imagens. O artigo de Van den Broeck et al., Descreve a localização e morfologia dos gânglios linfáticos murino em detalhe 3. Neste vídeo, demonstramos a excisão de seis grandes linfonodos periféricos, que são adequados para o isolamento de células ou de imagem. b. Remoção dos linfonodos: Tenha em mente a integridade do tecido durante a remoção dos gânglios linfáticos. Tenha cuidado para não romper a cápsula ou em qualquer forma prejudicar a estrutura dos linfonodos. Perda da integridade estrutural de linfonodo irá comprometer o experimento. Se necessário, remover a gordura da superfície linfonodo com finas pinças de dissecação (# 5 Dumont) sob um microscópio de dissecação. Linfonodos não deveria ter qualquer gordura restante na superfície do nó, pois isso irá obscura de imagem por espalhamento da luz. Excisão adequada de linfonodos também é uma técnica importante para a prática antes da primeira experiência real. 3. Nod linfáticose de imagem de instalação e Considerações Linfonodo deve ser assegurada para a fase de imagem, que neste caso consiste em uma câmara embutida. Aquecido, de oxigênio perfundidos mídia é bombeado para a câmara de um lado através de uma bomba peristáltica e aquecedor de inline, e ele sai através de um canal de queda-graduada em uma câmara de coleta com um tubo de vácuo para um balão de recolha de resíduos. No nosso sistema, o linfonodo está submerso em 37 ° C media e super-perfundidos com classe médica carbogênio (5% CO 2, 95% O 2). A temperatura do meio de perfusão deve ser registrada como perto do nó de linfa como é possível. Seu sistema em particular pode exigir variações na taxa de fluxo de mídia e cenografia para acomodar o estágio do microscópio e objetiva. a. Linfáticos configuração de imagem nó: Conforme mostrado no vídeo, que segura o linfonodo pelo primeiro anexá-lo, medular voltada para baixo (para a imagem de T ou células B zonas usando um microscópio vertical) para uma lamela de plástico, cortado no tamanho apropriado. É importante usar uma cola de tecido não-tóxico (usamos VetBond ™ da 3M Corporation). A lamela é garantido na mídia que flui, colocando uma pequena bagatela de graxa de silicone na parte de baixo da lamínula, em seguida, aderir à essa base de vidro da câmara de imagem. b. 2-Photon considerações de imagem: Vários fatores podem causar linfócitos parar de se mover: temperatura muito alta ou muito baixa; potência do laser em excesso; compressão ou outros danos ao nó de linfa, e falta de oxigênio. Danos devido a potência do laser excessiva ou temperaturas&gt; ~ 39 ° C é irreversível. Se as células são fracas, é tipicamente melhor para aumentar o ganho de detector ou o protocolo de células-rotulagem em vez de usar um poder maior de laser para visualizar as células. Otimização de rotulagem ou expressão de proteínas fluorescentes pode ser necessária para trazer a fluorescência acima do nível de autofluorescência de fundo. Com ganho razoável e configurações de energia do laser, uma mudança dois log de fluorescência acima dos valores basais (medido por citometria de fluxo) é razoável para a visualização de células. Sintonizável com dois fótons lasers, o comprimento de onda usado para a excitação deve ser um pouco inferior ao dobro do máximo de excitação o fóton único do fluoróforo sendo fotografada. Em dois fótons experimentos usando mais de um rótulo ou proteína fluorescente pode ser necessário fazer experiências com o comprimento de onda de excitação usada para encontrar os melhores ajustes para ambos os rótulos. Excitação de dois fótons também pode ser usado para estruturas de colágeno endógeno imagem, aproveitando o intrínseco de segunda geração azul harmônica. Geração de segundo harmônico (SHG) ocorre quando dois fótons são combinados dentro de um material e emitir um único fóton de duas vezes a freqüência dos fótons original. Em tecido, de dois fótons de excitação ocorre quando a luz do laser incidente é perpendicular a uma estrutura de proteínas altamente ordenada como o colágeno. Questões práticas a respeito de dois fótons de imagem foram discutidas nas revisões preview 4, 5.

<ol><li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes%3A+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB%2FcAnNCrl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+tissue+imaging%3A+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li>
<li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+the+immune+system%3A+progress%2C+pitfalls+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li>
</ol>

Neste protocolo de vídeo que mostram os procedimentos para a transferência de células adotivos e isolamento de linfonodo e preparativos necessários para a imagem da motilidade de linfócitos em um linfonodo periférico. Dois fótons de imagem tem várias vantagens sobre imagem confocal em ambos os tecidos explantado (mostrado aqui) e em preparações intravital. Notavelmente, a utilização de infra-vermelho de excitação minimiza espalhamento de luz e permite uma imagem a 300 micrômetros abaixo da cápsula do linfonodo e mais profundo em cerca de 4 tecidos. Além disso, multi-fotão excitação é restrito ao ponto focal da objetiva, minimizando foto branqueamento e dano tecidual lado de fora do plano focal. Como acontece com qualquer nova técnica, no entanto, dois fótons de imagem não é uma panacéia e suas limitações e perigos potenciais devem ser mantidos em mente 5. Entre elas está a exigência de que - excetuando sinais intrínsecos, como geração de segundo harmônico por colágeno, células de interesse devem ser rotulados por sondas fluorescentes extrínseco ou pela expressão de proteínas fluorescentes. A impressão é assim criado que estas células marcadas estão nadando em um vazio negro e que na verdade eles estão imersos em e interagir com um ambiente complexo de elementos estruturais e uma miríade de outros sem rótulo, as células invisíveis. Nos seis anos desde a introdução de dois fótons de imagem para imunologia, esta técnica tem permitido aos pesquisadores endereço de longa data perguntas a visualização direta em tecidos vivos intactos, incluindo processos de interações célula-célula, motilidade celular e localização, vias de sinalização celular e de células citotóxicas matando eventos. O campo tem evoluído rapidamente para além inicial descrições fenomenológicas, e análises quantitativas em conjunto com modelagem e simulação computacional estão começando agora a fazer sentido como os movimentos aparentemente caótica celular e interações dentro dos gânglios linfáticos levar a uma resposta imune eficiente. Este progresso é totalmente revisto em uma publicação recente 1, que lista mais de 100 artigos descrevendo a aplicação de dois fótons de microscopia para immunoimaging.

dissecção e 2-photon imagens de linfonodos periféricos em ratos

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Dois fótons de imagens revelou uma coreografia elegante da motilidade e interações celulares dentro do nó de linfa em condições basais e no início de uma resposta imune 1. Aqui, apresentamos métodos para transferência adotiva de células T rotulados, o isolamento dos gânglios linfáticos, e motilidade de imagens de células CD4 + T no linfonodo explantado como descrita pela primeira vez em 2002 2. Imagem de dois fótons de células do sistema imunológico requer que as células são fluorescente etiquetado, seja através da coloração com um corante rastreador celular ou por expressar uma proteína fluorescente. Nós demonstramos o procedimento de transferência adotiva de células derivadas de camundongos injetando doador na veia da cauda, ​​onde o lar de órgãos linfóides dentro de aproximadamente 15-30 min. Destinatário de um animal Ilustramos o isolamento de um nó de linfa e descrever métodos para garantir uma montagem adequada do linfonodo extirpado. Outras considerações, tais como a oxigenação adequada dos meios de comunicação perfundidos, temperatura e potência do laser são discutidas. Finalmente, apresentamos as imagens de vídeo 3D de CD4 + células T ingênuo exibindo motilidade estado de equilíbrio a 37 ° C.

Dois fótons de imagem revelou motilidade linfócitos e interações celulares dentro do nó de linfa em condições basais e durante uma resposta imune 1. Aqui, demonstramos transferência adotiva de células T, o isolamento dos gânglios linfáticos, e motilidade de imagens de células CD4 + T no linfonodo explantado.

Dissecção e 2-Photon Imagens de linfonodos periféricos em ratos

A imagem por excitação de dois fótons revelou uma coreografia elegante de motilidade e interações celulares dentro do linfonodo em condições basais e durante o...

Olá, meu nome é Melanie Matthew. Sou do laboratório de Micah Helen na Universidade da Califórnia em Irvine. E hoje vamos retirar linfonodos de um camundongo para fins de imagem em fótons in situ.Isso envolve a remoção dos linfonodos inguinais, dos linfonodos axilares e dos linfonodos cervicais. Os seis linfonodos periféricos que são de fácil acesso em um camundongo. Para obter células fluorescentes nos linfonodos de nossos camundongos. Para realizar a imagem por meio de microscopia de dois fótons, primeiro precisamos fazer a transferência adotiva de células marcadas com fluorescência.Para este experimento, vou mostrar a vocês primeiro a transferência adotiva. Aqui está a nossa seringa de insulina de 28 graus. Vou carregá-la com algumas células ou células.Primeiro, quero desobstruir a seringa para que ela flua facilmente. E vou carregar cuidadosamente as células. Vou fazer o possível para não tocar nas paredes do tubo com a seringa de insulina, pois isso pode embotar a agulha e tornar mais difícil a injeção na veia da cauda do camundongo.Se houver bolhas de ar, é necessário eliminá-las, tirando-as do caminho. Bata para removê-las daqui. Pronto, agora está tudo certo.Agora estamos prontos para injetar essas células na veia da cauda. Ok, aqui está nosso camundongo C57 black six. Vamos recuá-lo lentamente e com cuidado para dentro do injetor da veia da cauda.Muitos camundongos não gostam disso, mas isso evita que eles pulem durante a injeção propriamente dita, o que poderia machucá-los mais ou causar uma possível picada de agulha em você. Portanto, basta acomodar cuidadosamente o camundongo no interior. Agora, procure a veia da cauda ao longo dos lados da cauda do camundongo.Então, uma grande artéria percorre a parte superior. E em ambos os lados da cauda do camundongo, há duas veias longas e bem definidas. Estendem-se até a ponta.Então você pega sua agulha e começa na parte inferior da cauda, procurando uma veia. Vejo aqui bem neste ponto uma veia. Vou umedecê-la um pouco com etanol, o que pode torná-la um pouco mais visível.Ok, agora vamos injetar na veia da cauda e é importante manter o bisel da agulha voltado para cima, ou seja, a extremidade aberta da agulha para cima. E mover-se quase paralelamente à cauda.Você não deve inserir a agulha em um ângulo, pois as veias estão logo na superfície. Você apenas deseja deslizar a agulha na veia da cauda muito lentamente. E ao fazer isso, com um pouco mais de experiência, você deverá ser capaz de sentir quando ela entra.Mas nas primeiras tentativas, você deve empurrar o líquido para verificar se há alguma resistência. Se não houver resistência, você está na veia da cauda e pode realizar uma injeção rápida e fácil, como acabei de fazer. Em seguida, pode retirar lentamente a agulha.Outra confirmação de que você está na veia é o aparecimento de uma pequena bolha de sangue proveniente do refluxo. Assim, observar um bom refluxo de sangue saindo um pouco do local da injeção confirmará que você certamente atingiu a veia da cauda. E o camundongo deve parar de sangrar em breve após a injeção.Ok, aqui está nosso camundongo black six. Vamos remover os linfonodos do camundongo das regiões inguinais, que estão aqui, aqui nas axilas, onde se localizam os linfonodos axilares, e do outro lado aqui. E então os linfonodos cervicais superficiais, que estão aqui na região da garganta, um de cada lado.Olá. Agora estamos prontos para dissecar nosso camundongo. Vou começar fixando o camundongo na tábua, aqui na placa de dissecação. E já vamos adiante e fixar as patas. Sim.Você quer garantir que seja um fixação segura. Isso nos permitirá expor melhor os linfonodos periféricos. Portanto, normalmente fixo as quatro patas para baixo.Não me preocupo com a cauda. Algumas pessoas gostam de prender também a cauda. E então, para evitar que pelos entrem na região onde estamos dissecando e se espalhem pelos nossos linfonodos e nossos instrumentos, pulverizamos o camundongo com etanol a 70%.E agora que o camundongo está anestesiado com etanol, vou fazer uma incisão na linha média. Faço isso puxando os pelos para longe do corpo. A pele, como você pode ver, posso levantá-la e formar uma pequena barraca.E isso vai impedir que você corte o peritônio, o que não deve ser feito neste caso. Ok, então vou começar com minha incisão mediana aqui em cima. Faço um pequeno corte e verifico se ainda não atingi o peritônio.É possível observar que há o peritônio por baixo. Deslizo minha tesoura sob o corte e lentamente vou separando a pele do peritônio, fazendo pequenos cortes conforme avanço, pois vamos coletar os linfonodos cervicais. Vou cortar até a linha da mandíbula do camundongo com muita cautela e lentidão, certificando-me de não atingir nenhum vaso sanguíneo importante.E então, como estamos coletando os linfonodos inguinais, que estão na porção inferior do retalho de pele, vou fazer uma incisão mediana até aproximadamente a cauda, na base da cauda aqui. Pronto. Temos aqui uma incisão mediana que atenderá ao nosso propósito.Agora vou separar a pele do peritônio. Farei isso suavemente com pinça, puxando a pele para longe do peritônio à medida que avanço. E estou expondo o primeiro linfonodo que vamos dissecar.Este é o linfonodo inguinal aqui na dobra cutânea inferior. Agora que retirei uma dobra de pele do corpo principal do camundongo, vou fixá-la para expor o linfonodo inguinal. Essa é uma melhor exposição do linfonodo inguinal, o que nos permitirá dissecá-lo de forma limpa.Aqui temos o linfonodo inguinal exposto após a fixação. Ele geralmente é encontrado na aba de pele, logo acima da perna. Pode ser localizado observando a junção em formato de Y dos vasos sanguíneos que correm acima dele.E aqui está. Está acomodado com um pouco de gordura e os vasos sanguíneos correndo por cima. Muito bem, agora vou remover o linfonodo inguinal.Deslizo minha pin&ccedil;a ao longo de ambos os lados do n&oacute;dulo linf&aacute;tico para afast&aacute;-lo da gordura. N&atilde;o queremos nenhuma gordura. Com nossa imagem de dois f&oacute;tons, ela obstruir&aacute; a penetra&ccedil;&atilde;o do laser no tecido.Vamos ver. É importante separar toda a gordura do linfonodo, bem como manter a córtex do linfonodo intacta. Muito bem, agora sim.Aqui está o nosso linfonodo de iena. Vou colocá-lo no meio de cultura, e a melhor maneira de verificar se você removeu toda a gordura é observar se o linfonodo afunda. Assim que o colocar no meio, ele irá direto para o fundo.Se houver alguma gordura, ela flutuará. Muito bem, agora vou retirar o linfonodo auxiliar. Ele está localizado na axila do camundongo, bem ao lado de um vaso sanguíneo importante.Às vezes pode ser complicado porque você pode ter muito sangramento, o que obscurece o nódulo. Mas vou mostrar o que faço, e espero que não tenhamos sangramento desta vez. Primeiro, afasto o retalho de pele e, na verdade, afasto esta região do antebraço ao lado do nódulo que quero remover.Isso me permite puxar a pele com mais destreza usando os dedos, mas segurando este músculo que passa sobre a axila, e isso deve fazer surgir um linfonodo axilar com um leve puxão. E agora vou procurar por ele. E aqui está.Está bem ali na axila, ao longo de um vaso sanguíneo principal. Agora vou dissecar o linfonodo axilar e você pode prender novamente a pele com alfinetes ou segurá-la com os dedos, conforme se sentir mais confortável. Mas gosto de trabalhar com cuidado nesta região.Há muito pouca gordura ao redor deste linfonodo, o que o torna adequado para imageamento, mas ele está próximo a um vaso sanguíneo importante, de modo que pode-se perdê-lo às vezes se não se tomar cuidado. Então, para o linfonodo axilar, estou segurando o tecido conjuntivo ao seu redor e lentamente separando-o dos vasos sanguíneos. E está bem, e pronto.Aqui está o nosso nó axilar. Está bem aqui. É um linfonodo longo e achatado, bem definido.E estou segurando um pouco do tecido conjuntivo remanescente na lateral do nódulo para não danificar o nódulo propriamente dito. Vamos realizar a imagem para manter os linfonodos hidratados. Antes de realizarmos a imagemagem institucional, colocamos os nódulos em meio independente de CO2 em câmaras individuais, para que possamos acompanhar os linfonodos inguinais, axilares e cervicais.A maneira de saber se você fez uma boa preparação do linfonodo é observar se ele afunda ao fundo após ser dissecado. Isso indica que há muito pouca gordura no linfonodo. Agora vou remover o linfonodo cervical, o cervical superficial.E eu faço isso, começo recolocando o alfinete a partir do momento em que retirei o n&oacute;do axilar, expondo um pouco melhor o tecido cervical. E os n&oacute;dulos linf&aacute;ticos cervicais ficam pr&oacute;ximos aos m&uacute;sculos da mand&iacute;bula do camundongo. Na verdade, ao longo do lado.São os mesmos linfonodos que você pode sentir quando fica doente. São os que ficam aqui e que seu médico examina quando você tem um resfriado. Para isso, costumo colocar meu dedo sob o tecido para puxá-lo levemente para frente enquanto passo a pinça ao longo do lado.Deveria ter um linfonodo que aparece. Ah, lá está. Está ali no tecido.Aqui está. Então, há um linfonodo cervical superficial. Você deve ter cuidado para não remover glândulas salivares.Você não encontrará células T em suas glândulas salivares. E esses linfonodos específicos possuem linfócitos T positivos para CD4 marcados com CFSC. Então vamos mostrar a você alguns vídeos de localização dessas células T se movimentando no tecido.Ok, agora vou colar o linfonodo a uma lamínula plástica irquebrável para que possamos fixá-lo na base da platina de imagemagem in situ. Dessa forma, evitaremos movimentação do tecido ou deriva tecidual enquanto estivermos obtendo imagens dos linfócitos T. Então, aqui tenho minhas lamínulas plásticas irquebráveis.A primeira coisa que vou fazer é cortar um deles no tamanho adequado para o nosso linfonodo. Então, pego minha tesoura e corto um quadrado pequeno aqui. Ok, agora vou aplicar cola nele.É um pouco de cola. Espalhe-a ao redor do pedaço de lâmina que cortamos. Em seguida, vou pegar um lenço de papel kim e absorver um pouco da cola.Esta é uma cola que irá cobrir o nódulo. Queremos apenas uma camada muito fina para que não obstrua a imagem. Em seguida, vou retirar um nódulo linfático da solução.Então, vamos começar com o nosso primeiro linfonodo aqui da região medial. Você deve ser gentil com isso. Não quer danificar a córtex do linfonodo.Vou segurar apenas o canto do linfonodo e colá-lo à lâmina tocando suavemente o canto do linfonodo na lâmina primeiro e, em seguida, puxando o linfonodo ao longo da lâmina, fixando-o firmemente. Para isso, utilizei um pequeno fragmento de gordura que restou na borda do linfonodo. Dessa forma, na verdade, não estou perturbando a córtex do linfonodo.Em seguida, pego o linfonodo e, para curar a cola, vou mergulhá-lo no mesmo poço de onde o retirei. Vou virá-lo de cabeça para baixo e mergulhá-lo suavemente no meio, levando consigo toda a cola. Retiro um pouco da cola exó que foi curada junto com ele.Agora sim. Temos um linfonodo preparado para imagem de dois fótons. Assim é como se prepara linfonodos para imagem de dois fótons in situ.Agora vamos levá-los até nosso microscópio, montar o equipamento e obter excelentes imagens dos linfócitos T que transferimos adotivamente. Aqui temos linfócitos T marcados com CFSE se movimentando dentro de um linfonodo inguinal. Este vídeo está acelerado cerca de 500 vezes e é possível observar que as células são altamente móveis.Eles são ampliados cerca de 20 x com nosso objetivo de imersão em água de 20 x. Este é apenas um exemplo de movimento de células T. Nada fizemos para corar as células circundantes.Normalmente em experimentos mais avançados de duas fotonas, é possível ter células dendríticas coradas, linfócitos B corados e linfócitos T interagindo com células NK coradas. Você pode marcar praticamente qualquer tipo celular que espera encontrar dentro do linfonodo e prosseguir com a obtenção de imagens. Assim, concluímos o nosso protocolo de imagem de linfonodo no instituto.

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Biologia

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Recentemente técnicas de imagem desenvolvidos utilizando fluorescência no infravermelho próximo (NIRF) pode ajudar a elucidar a função do sistema linfático desempenha na metástase do cancro, a resposta imune, reparação de feridas, e outras doenças associadas linfático.

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Um método de dissecção para colher linfonodos de drenagem poplítea murina para imagens ex vivo

De alta resolução de imagem intravital com melhor contraste de até 120 mM profundidade em linfonodos de camundongos adultos é conseguido através espacialmente modular o padrão de excitação de um multi-focal microscópio de dois fotões. Em 100 microns de dimensão medimos resoluções de 487 nm (laterais) e 551 nm (axial), evitando, assim, os limites de espalhamento e difração.

Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

Este protocolo descreve uma técnica para populações diferentes da pilha da imagem em drenar nós de linfa sem alterações na estrutura do órgão.

Visualizando estrutura de linfonodos e localização celular usando microscopia confocal ex-vivo

Um protocolo é apresentado combinando limpeza tecidual com microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) para obter imagens tridimensionais e de resolução celular dos vasos linfáticos e linfonodos (LNs) coletando o fluido cefalorraquidal (CSF) e fluido peridural espinhal.

Imagen tridimensional da Vasculatura e Drenagem Linfática Vertebral usando iDISCO+ e Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz

O manuscrito demonstra um método inovador para o estudo in vivo da contratilidade dos vasos linfáticos cervicais e do fluxo linfático em camundongos para testar várias funções fisiológicas dos vasos linfáticos cervicais (cLVs) e as estratégias terapêuticas para a modulação dos mecanismos reguladores linfáticos de drenagem e desobstrução cerebral.

Configuração Reprodutível para Imagem de Dois Fótons In Vivo da Contratilidade dos Vasos Linfáticos Cervicais e do Fluxo Linfático em Camundongos

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