A técnica de fotoconversão para explorar a dinâmica celular inflamatória em pupas de insetos

0 views • 3:44 min • July 8th, 2025

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Comece com um prato com fundo de vidro contendo pupas transgênicas de Drosophila carregando epitélio ferido marcado com suas proteínas de superfície celular exibindo fluorescência verde.

As células imunes das pupas - ou hemócitos expressam fluoróforos verdes fotoconversíveis no citoplasma e proteínas fluorescentes vermelhas no núcleo, facilitando o rastreamento celular.

As células feridas liberam quimioatraentes - ou moléculas inflamatórias, atraindo os hemócitos para o local ferido.

A microscopia confocal revela a área ferida circundada por células epiteliais verdes.

Durante a cicatrização, hemócitos verdes com núcleos vermelhos próximos à ferida estendem as saliências da membrana - filopódios e lamelipódios e migram em direção à área ferida.

Com o tempo, à medida que o quimioatraente se difunde, os hemócitos distantes migram em direção à ferida, criando uma onda de células imunológicas.

Ilumine a subpopulação de hemócitos migratórios com um comprimento de onda de 405 nanômetros. Isso converte irreversivelmente o fluoróforo fotoconversível dos hemócitos de verde para vermelho.

Esses hemócitos fotoconvertidos reparam o epitélio ferido e se afastam do local da ferida, diferenciando os hemócitos fotoconvertidos dos hemócitos não fotoconvertidos e elucidando a dinâmica das células inflamatórias.

Depois de ferir as margens da asa da pupila, transfira rapidamente o prato com fundo de vidro para um microscópio apropriado para imagens de lapso de tempo. Em seguida, abra o software de captura de imagem apropriado.

No software, ligue os lasers apropriados e ajuste sua potência e deslocamento de ganho para obter sinal fluorescente suficiente sem saturação de pixels. Geralmente, a menor potência de laser possível na faixa de 5% a 20% funciona melhor para minimizar o fotobranqueamento.

Concentre-se em toda a asa da pupila sob baixa ampliação ou concentre-se na ferida sob alta ampliação para investigar o reparo da ferida. Para capturar o epitélio reparador e o recrutamento de células inflamatórias, primeiro configure o microscópio para registrar uma pilha z usando o ajuste de foco fino no painel de controle. Varredura do epitélio ferido até o espaço extracelular abaixo, contendo hemócitos migratórios.

Em seguida, configure o software para registrar fatias z através da asa da pupila a cada 3 mícrons ou em intervalos ainda mais apertados. Para imagens de lapso de tempo, registre z-stacks pelo menos a cada 30 segundos por pelo menos uma hora.

Ao usar as sondas fotoconversíveis para fotoconverter e rotular seletivamente um subconjunto de células durante a geração de imagens, abra os módulos apropriados no software de imagem para realizar a fotoconversão e ativar o laser de 405 nanômetros. Em seguida, selecione as células a serem fotoconvertidas no software FRAP usando uma ferramenta de seleção.

Em seguida, defina o curso de tempo para a conversão de fotos para um único quadro de iteração e defina o laser de 405 nanômetros para 20% da potência do laser e clique em Iniciar o experimento para realizar a conversão de fotos. Depois de concluído, saia do módulo FRAP e retorne à tela de imagem original. Lá, sintonize os lasers nos fluoróforos em uso e obtenha imagens das células fotoconvertidas e não fotoconvertidas usando gravações de lapso de tempo.

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Last updated: 4 July 2026