Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes

Este vídeo demonstra um método para medir a carga bacteriana e gerar e analisar suspensões unicelulares de camundongos, fígado e baço. Primeiro, um inóculo de listeria é preparado e injetado por via intravenosa em camundongos. Sangue, fígado e baço são então colhidos de camundongos sacrificados em pontos de tempo escolhidos.

As suspensões unicelulares são preparadas a partir de tecidos colhidos e homogeneizados de tecidos AC cultivados em placas de ágar sangue de cavalo. As suspensões celulares resultantes podem então ser analisadas quanto à viabilidade e conteúdo de células imunes por análise por fax, enquanto a carga bacteriana é determinada com base nas unidades formadoras de colônias. Este método pode ajudar a caracterizar as respostas imunes à infecção por esteróides, como aquelas entre cepas de mal suscetíveis e resistentes, ao mesmo tempo em que determina a carga bacteriana em órgãos infectados.

Comece este procedimento preparando o inóculo de listeria de acordo com a concentração desejada As instruções para cultura, armazenamento e preparação de listeria podem ser encontradas no protocolo escrito que acompanha. Quando o inóculo estiver pronto, transfira duas alíquotas de 100 microlitros para tubos microfundidos estéreis contendo 900 microlitros de PBS para fazer uma diluição de um a 10, depois transfira 100 microlitros de cada diluição para placas HBA de ágar sangue de cavalo e espalhe completamente com um espalhador estéril para realizar contagens de UFC da Unidade de formação de colônias e, em seguida, incube as placas invertidas a 37 graus Celsius durante a noite. Em seguida, transfira os ratos para uma gaiola limpa.

Coloque a gaiola 50 centímetros sob uma lâmpada infravermelha de 250 watts por cinco minutos para garantir que a veia da cauda esteja dilatada. Isso permite uma melhor visualização durante a injeção aqui, a cepa de camundongo resistente à listeria, C 57 black six e a cepa de camundongo suscetível à listeria. A válvula C será injetada misturando suavemente a suspensão de listeria invertendo o tubo algumas vezes.

Em seguida, carregue uma seringa de um mililitro com uma agulha de calibre 27 para injeção de 200 microlitros por mouse. Certifique-se de que todas as bolhas de ar dentro da seringa sejam sangradas antes da injeção. Coloque o mouse em um dispositivo de restrição.

Em seguida, localize a veia lateral da cauda do camundongo identificando primeiro a artéria da cauda, que se encontra no meio do lado dorsal. Em seguida, gire a cauda ligeiramente para o lado lateral para identificar a veia. Limpe suavemente a cauda com um pano de etanol 70% e injete após retirar a seringa.

Aplique pressão brevemente na ferida de entrada com um quadrado de gaze estéril. Observe que é muito mais difícil identificar a veia da cauda em camundongos de cor preta após a injeção. Retorne o camundongo à sua gaiola depois de injetar toda a placa de camundongos e incube o inóculo restante para contagens de unidades formadoras de colônias.

Como antes do dia seguinte, contar o número de colónias e determinar as concentrações pré e pós-injecção do inóculo de listeria. O halo característico ao redor das colônias individuais, como mostrado aqui, é devido à hemólise beta. Uma vez determinadas as contagens pré e pós-injeção, calcule a média das unidades formadoras de colônias adicionando as contagens de unidades formadoras de colônias pré e pós-injeção e dividindo por dois.

Finalmente, em vários momentos após a injeção, colete sangue e colha o fígado e o baço de camundongos sacrificados. Se a análise por fax for realizada, o fígado deve ser perfundido antes da remoção para obter sangue, realizar um sangramento cardíaco imediatamente após a eutanásia e coletar o máximo de sangue possível em um tubo de coleta apropriado. Para perfundir o fígado, primeiro abra a cavidade abdominal e remova e descarte a vesícula biliar.

O espeleólogo de veias interior é uma veia que corre paralela à coluna vertebral e transporta sangue da parte inferior do corpo, incluindo o fígado, para o coração. Usando uma tesoura, sirva a veia logo abaixo do coração para criar uma saída para a saída do fluido perfundido. Em seguida, vire os lobos do fígado em direção à cabeça e empurre os intestinos para a direita para expor a veia porta hepática, que alimenta o fundo do fígado.

Do lado inferior direito, insira uma agulha dobrada de calibre 26 de meia polegada de comprimento na veia porta hepática e injete 10 mililitros de PBS. Após a injeção de um a dois mililitros de PBS, o fígado passará de uma cor vermelha escura para marrom claro. A solução injetada sairá do espeleólogo da veia inferior cortada A perfusão hepática garante que as células colhidas sejam do fígado e não do sangue circulante.

Em seguida, remova o fígado perfundido da cavidade corporal do camundongo e mergulhe-o no tubo de tampão de fatos no gelo. Em seguida, remova o baço e coloque-o no gelo para processamento de maneira semelhante à descrita na próxima seção. Para que o fígado gere suspensões de células hepáticas únicas, comece transferindo o fígado perfundido do tampão de fax para um filtro de células de 70 mícrons colocado dentro de uma placa de Petri de 60 milímetros.

Usando um êmbolo de seringa de cinco litros, empurre o tecido através do filtro de células para a placa de Petri. Transfira a suspensão de célula única para um tubo cônico de 50 mililitros e traga o volume total para 40 mililitros. Com buffer de fax frio.

Vórtice a suspensão celular. Em seguida, reserve uma alíquota quata de um mililitro para determinação da carga bacteriana. Mais tarde no procedimento, coloque o tubo de 50 mililitros na centrífuga e faça a pelota das células girando 500 vezes G por cinco minutos de quatro graus Celsius.

Depois de descartar o supinato, repita esta etapa de lavagem suspendendo o pellet em 40 mililitros de tampão de fax frio e centrifugando. Mais uma vez, resus. Suspender o pellet em 20 mililitros de isotónico por orifício à temperatura ambiente, centrifugar a suspensão da célula a 700 vezes G durante 12 minutos à temperatura ambiente.

Após a rotação, uma folha de hepatócitos em forma de disco flutuará no topo do perol e os leucócitos serão reproduzidos no fundo do tubo, descartando a camada de hepatócitos e perol despejando-a em um recipiente de lixo. Em seguida, suspenda o sedimento contendo leucócitos em quatro mililitros de tampão TAC para eritrócitos Liz e incube as células à temperatura ambiente por até 10 minutos com inversão frequente. Após a incubação, filtre a suspensão celular através de uma membrana de náilon de 100 mícrons em um novo tubo de centrífuga de 10 mililitros.

Cubra a suspensão de célula filtrada com um mililitro de tampão de fax EDTA, conforme mostrado aqui. Em seguida, centrifugue a 350 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a rotação, resus dobrando cinco mililitros de tampão de fax EDTA, depois gire novamente e reenvie o pellet em 0,5 a três mililitros de fax, tampão de EDTA, dependendo do tamanho do pellet, determine o número de leucócitos hepáticos viáveis usando um hemocitômetro baseado em fígado de exclusão azul triam.

As suspensões de células únicas podem então ser marcadas com anticorpos específicos para os marcadores de superfície celular desejados e analisadas por fatos. Uma vez que as suspensões de células únicas tenham sido geradas a partir do tecido hepático e do baço, as cargas bacterianas serão determinadas para partes do procedimento. Uma máquina de estômago será usada para homogeneizar o tecido que mantém uma bolsa de emergência do estômago fechada para evitar vazamentos.

Comece colocando-o em uma bancada limpa. Enrole uma caneta redonda grossa sobre o tecido até que o tecido esteja amassado dentro do saco. Adicione cinco mililitros de PBS a cada saco de co estomacal contendo tecido amassado.

Coloque o estômago ou bolsas no estômago e corra em alta velocidade por 10 minutos. A máquina de estômago tem duas pás que pressionam o estômago ou os sacos a uma velocidade especificada, misturando o conteúdo em um homogeneizado uniforme e contendo quaisquer aerossóis aerodinâmicos usando uma pipeta, misture o homogeneizado no saco. Em seguida, transfira 300 microlitros em duplicata para uma placa de fundo plano de 96 poços.

Dentro dos poços da placa de 96 poços, execute uma a 10 diluições em série para uma diluição de 10 a cinco. Para cada amostra de homogeneizado de tecido, use cuidadosamente um espalhador estéril para espalhar 0,1 mililitros de cada diluição em uma placa HBA pré-seca. Incube placas de 37 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, contar o número de unidades formadoras de colónias para cada diluição e calcular as unidades formadoras de colónias por tecido, tendo em conta a porção dos factores de diluição tecidual e o volume do homogeneizado. Veja se os camundongos C 57 black six foram infectados com cerca de 2000 unidades formadoras de colônias de listeria três e sete dias após a infecção, os camundongos foram sacrificados e o fígado foi perfundido e colhido com o baço. Diluição de homogenato esplênico ou suspensão hepática de célula única foi cultivada em placas de HBA para determinar a carga bacteriana.

Nos resultados mostrados aqui, a linha pontilhada indica o limite de detecção em 100 unidades formadoras de colônias por órgão. Observe que a carga de listeria é maior no terceiro dia do que no sétimo dia. Isso ocorre porque, no sétimo dia, várias células imunológicas levam à eliminação da listeria.

Nesses dois tecidos, baço e fígado, suspensões unicelulares foram coradas com azul trian e carregadas em uma hemograma. As células do citômetro dentro da área de contagem indicada na caixa vermelha serão contadas. As células não viáveis assumirão o triam azul e parecerão azuis, enquanto as células viáveis permanecerão sem coloração.

Como mostrado aqui, o número de células viáveis no baço mostrado à esquerda e o número de leucócitos viáveis no fígado mostrado à direita aumenta durante o curso da infecção. Esse aumento se deve às células imunológicas, incluindo neutrófilos e linfócitos que se ativam, proliferam e migram para esses dois locais de infecção. Como exemplo dos níveis de células imunes durante o curso da infecção por listeria, gráficos de fax representativos e o número de células T positivas para CD oito são mostrados aqui.

O número de células T positivas para CD oito diminui transitoriamente devido à linfopenia no baço nos dias dois a três, antes de aumentar visivelmente a partir do quinto dia após a infecção no baço e no fígado. Após este procedimento, outros métodos, como oscilação de andrógenos, células T específicas do antígeno e ensaios funcionais de células imunes classificadas, podem ser realizados para caracterizar ainda mais as respostas imunes à infecção por listeria.