Name: Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Aprenda a medir carga bacteriana e gerar suspensões de células únicas de fígado e baço de camundongos infectados com Listeria monocytogenes. Este método permite analisar respostas imunes e caracterizar diferenças entre linhagens suscetíveis e resistentes.

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Os autores gostariam de agradecer a Anna Walduck, Christina Cheers, Stuart Berzins, Dale Godfrey, Yifan Zhan e Jonathan Wilksch para aconselhamento e reagentes. Este trabalho foi financiado pela Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2008-602) e Nacional de Saúde Australiano e Medical Research Council (575.552). NW é suportado por uma concessão de Pós-Graduação da Austrália. OW é apoiado por uma Wright RD Fellowship da Australian National Health Medical Research Council.

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<li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+model+for+listeriosis%3A+role+of+internalin+in+crossing+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier.</a> Science. 292, 1722-1725 (2001).</li>
<li>Marco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+Listeria+monocytogenes+in+mice+infected+by+the+oral+route%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Penetration of Listeria monocytogenes in mice infected by the oral route.</a> Microb Pathog. 23, 255-263 (1997).</li>
<li>Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+infection+with+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Animal model for infection with Listeria monocytogenes.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter. 19, 19-19 (2001).</li>
<li>Neuenhahn, M., Schiemann, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+in+mouse+models+of+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DCs in mouse models of intracellular bacterial infection.</a> Methods Mol Biol. 595, 319-329 (2010).</li>
<li>Conlan, J. W., North, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+essential+for+early+anti-Listeria+defense+in+the+liver%2C+but+not+in+the+spleen+or+peritoneal+cavity%2C+as+revealed+by+a+granulocyte-depleting+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are essential for early anti-Listeria defense in the liver, but not in the spleen or peritoneal cavity, as revealed by a granulocyte-depleting monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 179, 259-268 (1994).</li>
<li>Czuprynski, C. J., Brown, J. F., Wagner, R. D., Steinberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+antigranulocyte+monoclonal+antibody+RB6-8C5+prevents+expression+of+acquired+resistance+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+previously+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Administration of antigranulocyte monoclonal antibody RB6-8C5 prevents expression of acquired resistance to Listeria monocytogenes infection in previously immunized mice.</a> Infect Immun. 62, 5161-5163 (1994).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Listeria é um dos organismos mais amplamente utilizados para caracterizar as respostas imunes do hospedeiro a bactérias intracelulares6. O protocolo apresentado aqui permite medir a carga bacteriana e as respostas das células imunes no mesmo tecido de um determinado camundongo. Essa medição dupla em um tecido específico para cada camundongo infectado possibilita comparações mais robustas dentro e entre coortes de camundongos (seja representando diferentes linhagens ou pontos temporais pós-infecção). Embora a infecção por Listeria por administração oral também possa ser usada para estudar as respostas imunes em camundongos, a infecção por injeção intravenosa é frequentemente empregada porque: 1) garante entrega rápida e eficaz à corrente sanguínea; 2) resulta em uma infecção sistêmica sincronizada e consistente; e 3) a espécie Mus possui uma mutação no gene que codifica o receptor E-caderina, o que limita a infecção por Listeria via administração oral (essa mutação afeta a capacidade de Listeria se ligar ao receptor de E-caderina do camundongo e atravessar eficientemente o revestimento epitelial do trato gastrointestinal)16-18.
Existem algumas etapas críticas neste protocolo. Primeiro, o estoque do inóculo de Listeria deve ser obtido a partir de uma cultura fresca em HBA de incubação noturna para garantir viabilidade e virulência. Segundo, é importante determinar com precisão a concentração de UFC do inóculo antes e após a injeção em todos os camundongos, a fim de assegurar que a concentração de UFC não difira significativamente entre o primeiro e o último camundongo injetado. Terceiro, a injeção de Listeria na veia da cauda deve ser realizada de maneira consistente em todos os camundongos. Por fim, é necessário perfundir o fígado para esgotar os leucócitos não residentes, garantindo uma medição precisa das células imunes no fígado e não dos leucócitos que circulam no sangue periférico. Todas essas etapas, se não forem realizadas com sucesso, podem resultar em variabilidade indesejada na carga bacteriana e/ou nas respostas imunes entre camundongos individuais infectados com Listeria.
Duas limitações deste protocolo são a habilidade do pesquisador em infectar camundongos por injeção intravenosa e a detecção da carga bacteriana em tecidos. Se uma pessoa estiver injetando um grande número de camundongos, a viabilidade de Listeria (ou seja, a concentração de UFC) pode diminuir ao longo do tempo após o descongelamento do inóculo (por exemplo, &gt;2 horas entre a injeção do primeiro e do último camundongo). Cabe ao pesquisador determinar quantos camundongos ele/ela pode injetar antes que o inóculo seja comprometido. Outra limitação deste método é que a carga de Listeria não pode ser medida com precisão abaixo de 100UFC/órgão devido às quantidades relativamente pequenas de homogenato tecidual cultivado (por exemplo, a Figura 3 indica que 100UFC/órgão é o limite de detecção). Para medir com maior precisão valores mais baixos de UFC/órgão, pode-se cultivar uma quantidade maior do homogenato tecidual (até 0,5 mL por placa, podendo-se usar múltiplas placas), de modo que uma proporção maior do tecido seja amostrada para a detecção de Listeria. Se um Stomacher não estiver disponível, métodos alternativos para homogeneizar o tecido, como o uso de um homogeneizador de tecidos, podem ser utilizados em substituição nas etapas 7.1–7.2. Em termos práticos, se o espaço no incubador a 37 °C for limitado para o cultivo de amostras teciduais de camundongos infectados, as placas de cultura em HBA podem ser incubadas à temperatura ambiente por 2–3 dias (as colônias crescerão mais lentamente à temperatura ambiente). No entanto, a temperatura ambiente não deve ser utilizada ao cultivar culturas para a preparação de estoques congelados de Listeria.
Este protocolo fornece uma abordagem básica para a caracterização da infecção por Listeria em camundongos e pode ser usado com outras cepas de Listeria além da EGD. Além do fígado e do baço, suspensões simples de células podem também ser obtidas de linfonodos. Em qualquer dos casos, essas suspensões simples de células podem ser utilizadas para diversas análises, incluindo a quantificação de subpopulações de células imunes e a estimulação in vitro de células imunes separadas. Uma vez dominadas as técnicas básicas, este protocolo também pode ser modificado para isolar linfócitos T específicos por Listeria19, caracterizar células dendríticas20 ou realizar a depleção de células imunes em determinados momentos após a infecção21,22, a fim de caracterizar mais completamente a resposta imune em camundongos infectados com Listeria.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Cavalo ágar sangue de base No.2 </td><td> Oxoid </td><td> CM0271 </td><td> Preparação de base de agar para placas HBA </td></tr><tr><td> Sangue de cavalo (desfibrinado) </td><td> Oxoid </td><td> HB1000 </td><td> Adicionar 5-10% a base de agar </td></tr><tr><td> Infusão de cérebro coração (BHI) caldo (10 mL) </td><td> Oxoid </td><td> TM456 </td><td></td></tr><tr><td> Cérebro media coração infusão desidratado </td><td> Oxoid </td><td> CM1135 </td><td></td></tr><tr><td> De 96 poços da placa de fundo chato </td><td> BD Biosciences </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 70 coador célula M </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Pequena placa de Petri </td><td> BD Biosciences </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Stomacher 80 Biomaster laboratório sistema </td><td> Seward </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sacos de plástico Stomacher </td><td> Sarstedt </td><td> 86 9924 530 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Sigma </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> FACS tampão </td><td></td><td></td><td> 0,1% (w / v) de soro albumina bovina em PBS </td></tr><tr><td> Isotônica Percoll (33,75% em Percoll PBS) </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 33.75mL Percoll, 3.75mL PBS 10x, 62.5mL 1x PBS faz 100mL Percoll isotônica </td></tr><tr><td> TAC do buffer </td><td></td><td></td><td> Tris 17mm, cloreto de amônio 140mm em água destilada </td></tr><tr><td> FCS / EDTA </td><td></td><td></td><td> Soro fetal bovino com 10mM EDTA </td></tr><tr><td> FACS / EDTA </td><td></td><td></td><td> FACS tampão + EDTA 5mM </td></tr><tr><td> Azul de tripano </td><td> Sigma </td><td> T6146 </td><td> 0,4% (w / v) em PBS, esterilizado por filtração </td></tr><tr><td> 2mL Cryovial </td><td> Greiner Bio One </td><td> 121263 </td><td></td></tr><tr><td> 27 seringa de insulina gauge/1mL </td><td> Terumo Medical Products </td><td> SS10M2713 </td><td></td></tr><tr><td> Agulha </td><td> Terumo Medical Products </td><td> NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in) </td><td></td></tr><tr><td> Seringa </td><td> Terumo Medical Products </td><td> SS-01T (1mL), SS-053 (5ml), SS-10S (10 ml) </td><td></td></tr></tbody></table>

medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com listeria monocytogenes</em

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) é um patógeno Gram-positivas facultativas intracelular 1. Estudos com camundongos empregam normalmente injeção intravenosa de Listeria, o que resulta em infecção sistêmica 2. Após a injeção, Listeria rapidamente dissemina para o baço e do fígado devido à absorção pelas CD8α + células dendríticas e células de Kupffer 3,4. Uma vez fagocitado, várias proteínas bacterianas permitir Listeria para escapar do fagossomo, sobreviver dentro do citosol, e infectar as células vizinhas 5. Durante os três primeiros dias de infecção, as células imunes inatas diferentes (por exemplo, monócitos, neutrófilos, células NK, células dendríticas) mediar os mecanismos que minimizam a proliferação bactericida Listeria. Células T CD8 + são posteriormente recrutados e responsável pelo desembaraço eventual de Listeria a partir do host, geralmente dentro de 10 dias de infecção 6. Clearance de sucesso de Listeria de camundongos infectados depende do aparecimento de respostas apropriadas imune do hospedeiro 6. Há uma ampla gama de sensibilidades entre linhagens de camundongos puras 7,8. Geralmente, os camundongos com aumento da susceptibilidade à infecção por Listeria são menos capazes de controlar a proliferação bacteriana, demonstrando aumento da carga bacteriana e / ou liberação atrasada em comparação com camundongos resistentes. Estudos genéticos, incluindo as análises de ligação e linhagens de camundongos knockout, identificaram vários genes para os quais variação da seqüência afeta as respostas do hospedeiro à infecção Listeria 6,8-14. Determinação e comparação da cinética de infecção entre linhagens de camundongos diferentes é, portanto, um importante método para a identificação de fatores genéticos do hospedeiro que contribuem para respostas imunes contra a Listeria. Comparação da resposta do hospedeiro a diferentes cepas de Listeria é também uma forma eficaz de identificar os fatores de virulência bacteriana que pode servir como potenciais alvos para a terapia com antibióticos ou concepção de uma vacina. Descrevemos aqui um método simples para medir a carga bacteriana (unidades formadoras de colônias [UFC] por tecido) e preparação de suspensões de uma única célula do fígado e do baço para FACS análise das respostas imunes em ratos infectados Listeria. Este método é particularmente útil para a caracterização inicial da infecção por Listeria em linhagens de camundongos romance, bem como a comparação das respostas imunitárias diferentes entre linhagens de camundongos infectados com Listeria. Usamos a Listeria monocytogenes EGD estirpe 15 que, quando cultivadas em ágar sangue, exibe uma zona de auréola característica em torno de cada colônia, devido à hemólise β-1 (Figura 1). Carga bacteriana e resposta imune pode ser determinado em qualquer ponto do tempo após a infecção por homogeneizado de cultura de tecidos em placas de ágar sangue e preparar suspensões de células de tecido para análise FACS utilizando os protocolos descritos abaixo. Gostaríamos de observar que os indivíduos que estão imunocomprometidos ou grávidas não devem manusear Listeria, e os institucionais pertinentes Biossegurança e animal gestão de instalações deve ser consultado antes do início dos trabalhos.

Listeria monocytogenes é um organismo modelo para estudar as respostas imunológicas e suscetibilidade genética para as bactérias intracelulares em camundongos. Este método permite que sejam medidos carga bacteriana e gerar uma única célula suspensões de fígado e do baço de ratos para análise FACS para determinar mudanças em células do sistema imunológico devido à infecção por Listeria.

Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) é um patógeno intracelular facultativo Gram-positivo1. Estudos com camundongos geralmente utilizam a injeção intravenosa de ...

Este vídeo demonstra um método para medir a carga bacteriana e gerar e analisar suspensões de células únicas a partir do fígado e baço de camundongos. Primeiro, um inóculo de *Listeria* é preparado e injetado por via intravenosa em camundongos. Em seguida, sangue, fígado e baço são coletados de camundongos eutanasiados em pontos de tempo escolhidos.Suspensões de células isoladas são preparadas a partir de tecidos coletados e homogeneizados de tecidos cultivados em placas de ágar sangue de cavalo. As suspensões celulares resultantes podem então ser analisadas quanto à viabilidade e ao conteúdo de células imunes por meio de análise de fax, enquanto a carga bacteriana é determinada com base nas unidades formadoras de colônia. Este método pode ajudar a caracterizar respostas imunes à infecção por esteroides, como aquelas entre cepas macho suscetíveis e resistentes, ao mesmo tempo em que determina a carga bacteriana em órgãos infectados.Inicie este procedimento preparando o inóculo de *Listeria* na concentração desejada; as instruções para o cultivo, armazenamento e preparação da *Listeria* podem ser encontradas no protocolo escrito anexo. Uma vez que o inóculo esteja pronto, transfira duas alíquotas de 100 microlitros para tubos microfusos estéreis contendo 900 microlitros de PBS para obter uma diluição de 1 para 10; em seguida, transfira 100 microlitros de cada diluição para placas de ágar sangue de cavalo (HBA) e espalhe bem com um espalhador estéril para realização da contagem de unidades formadoras de colônias (UFC); depois, incube as placas invertidas a 37 graus Celsius durante a noite. Em seguida, transfira os camundongos para uma gaiola limpa.Coloque a gaiola a 50 centímetros sob uma lâmpada infravermelha de 250 watts durante cinco minutos para garantir que a veia caudal esteja dilatada. Isso permite uma melhor visualização durante a injeção aqui, o camundongo resistente à listeria, C 57 black six, e a linhagem de camundongo suscetível à listeria. A válvula C será injetada; misture suavemente a suspensão de listeria invertendo o tubo algumas vezes.Em seguida, carregue uma seringa de um mililitro com uma agulha de 27 graus para a injeção de 200 microlitros por camundongo. Certifique-se de que todas as bolhas de ar dentro da seringa sejam eliminadas antes da injeção. Coloque o camundongo em um dispositivo de contenção.Em seguida, localize a veia lateral da cauda do camundongo identificando primeiro a artéria da cauda, localizada no meio do lado dorsal. Em seguida, gire levemente a cauda para o lado lateral para identificar a veia. Limpe suavemente a cauda com uma toalha umedecida com etanol 70%, depois injete após recuar a seringa.Aplique brevemente pressão sobre o local da entrada com uma gaze estéril quadrada. Observe que é muito mais difícil identificar a veia da cauda em camundongos de cor preta após a injeção. Devolva o camundongo à sua gaiola após injetar todos os camundongos da placa e incube o inóculo restante para contagem de unidades formadoras de colônia.Como no dia anterior, conte o número de colônias e determine as concentrações do inóculo de listeria antes e após a injeção. O halo característico ao redor de colônias individuais, como mostrado aqui, é devido à hemólise beta. Uma vez determinadas as contagens antes e após a injeção, calcule a média das unidades formadoras de colônias somando as contagens de unidades formadoras de colônias antes e após a injeção e dividindo por dois.Por fim, em diversos momentos após a injeção, colete sangue e retire o fígado e o baço de camundongos eutanasiados. Se a análise de fax for realizada, o fígado deve ser perfundido antes da remoção para obtenção de sangue; realize uma punção cardíaca imediatamente após a eutanásia e colete o maior volume possível de sangue em um tubo de coleta apropriado. Para perfundir o fígado, primeiramente, abra a cavidade abdominal e remova e descarte a vesícula biliar.A veia cava inferior é uma veia que percorre paralela à coluna vertebral e transporta sangue da parte inferior do corpo, incluindo o fígado, até o coração. Usando um par de tesouras, seccione a veia logo abaixo do coração para criar uma saída pela qual o fluido de perfusão possa escoar. Em seguida, vire os lobos hepáticos em direção à cabeça e desloque os intestinos para a direita, expondo a veia porta hepática, que se dirige à parte inferior do fígado.Pelo lado inferior direito, insira uma agulha curvada de meia polegada e calibre 26 na veia porta hepática e injete 10 mililitros de PBS. Após a injeção de um a dois mililitros de PBS, o fígado mudará de uma cor vermelho-escura para marrom claro. A solução injetada sairá pela veia cava inferior seccionada. A perfusão hepática garante que as células coletadas sejam provenientes do fígado e não do sangue circulante.Em seguida, remova o fígado perfundido da cavidade corporal do camundongo e submerja-o no tubo com tampão FACS sobre gelo. Em seguida, remova o baço e coloque-o sobre gelo para processamento de maneira semelhante à descrita na próxima seção. Para que o fígado gere suspensões simples de células hepáticas, comece transferindo o fígado perfundido do tampão FACS para um filtro celular de 70 micrômetros colocado dentro de uma placa de Petri de 60 milímetros.Usando o êmbolo de uma seringa de cinco litros, empurre o tecido através da peneira celular para dentro da placa de Petri. Transfira a suspensão de células isoladas para um tubo cônico com tampa de rosca de 50 mililitros e complete o volume total para 40 mililitros com tampão fax frio.Vortexe a suspensão celular. Em seguida, separe uma alíquota de um mililitro para determinação da carga bacteriana. Mais adiante no procedimento, coloque o tubo de 50 mililitros na centrífuga e pelote as células por meio de centrifugação a 500 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.Após descartar o sobrenadante, repita esta etapa de lavagem ressuspendendo o pellet em 40 mililitros de tampão fax frio e centrifugando. Novamente, ressuspenso. Suspenda o pellet em 20 mililitros de tampão isotônico por tubo à temperatura ambiente e centrifugue a suspensão celular a 700 ×g durante 12 minutos à temperatura ambiente.Após a centrifugação, uma camada em forma de disco de hepatócitos flutuará sobre o perol, enquanto os leucócitos formarão um pellet no fundo do tubo. Descarte a camada de hepatócitos e o perol despejando-os em um recipiente de resíduos. Em seguida, ressuspenda o pellet contendo leucócitos em quatro mililitros de tampão TAC para lisar eritrócitos e incube as células à temperatura ambiente por até 10 minutos, com inversões frequentes. Após a incubação, filtre a suspensão celular através de uma membrana de náilon de 100 mícrons para um novo tubo cônico de 10 mililitros.Sobreponha à suspensão celular filtrada um mililitro de tampão fax EDTA, conforme mostrado aqui. Em seguida, centrifugue a 350 ×g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, ressuspenda em cinco mililitros de tampão fax EDTA, centrifugue novamente e ressuspenda o pellet em 0,5 a três mililitros de tampão fax EDTA, dependendo do tamanho do pellet. Determine o número de leucócitos hepáticos viáveis utilizando um hemocitômetro com base na exclusão por azul de tripano no fígado.Suspensões de células isoladas podem então ser marcadas com anticorpos específicos para os marcadores de superfície celular desejados e analisadas por citometria de fluxo. Uma vez que as suspensões de células isoladas tenham sido obtidas a partir de tecidos hepáticos e esplênicos, as cargas bacterianas serão determinadas para partes do procedimento. Uma homogeneizadora de estômago será utilizada para homogeneizar o tecido, mantendo-se o saco de estômago ER fechado para prevenir vazamentos.Comece colocando-o sobre uma bancada limpa. Passe um rolo grosso e redondo sobre o tecido até que o tecido fique esmagado dentro do saco. Adicione cinco mililitros de PBS a cada saco contendo o tecido esmagado.Coloque o estômago ou os sacos no interior do estômago e mantenha em alta velocidade por 10 minutos. A máquina de estômago possui duas pás que comprimem o estômago ou os sacos a uma velocidade determinada, homogeneizando o conteúdo em uma mistura uniforme e contendo quaisquer aerossóis. Com o auxílio de uma pipeta, misture o homogeneizado dentro do saco. Em seguida, transfira 300 microlitros em duplicata para uma placa de 96 poços com fundo plano.Nos poços da placa de 96 poços, realize uma diluição serial de 1 para 10 até uma diluição de 10 elevado a cinco. Para cada amostra de homogenato tecidual, use cuidadosamente um espalhador estéril para distribuir 0,1 mililitros de cada diluição em uma placa de HBA previamente seca. Incube as placas a 37 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, conte o número de unidades formadoras de colônia para cada diluição e calcule as unidades formadoras de colônia por tecido, levando em consideração os fatores de diluição do tecido e o volume do homogeneizado. Verifique se camundongos C57 black six foram infectados com cerca de 2000 unidades formadoras de colônia de *Listeria* aos três e sete dias pós-infecção; os camundongos foram eutanasiados e o fígado foi perfundido e coletado junto com o baço. Diluições do homogeneizado esplênico ou suspensão simples de células hepáticas foram cultivadas em placas de HBA para determinar a carga bacteriana.Nos resultados apresentados aqui, a linha tracejada indica o limite de detecção em 100 unidades formadoras de colônia por órgão. Observe que a carga de listeria é maior no terceiro dia do que no sétimo dia. Isso ocorre porque, até o sétimo dia, várias células imunes promovem a eliminação da listeria.Nesses dois tecidos, baço e fígado, as suspensões de células individuais foram coradas com azul de trian e carregadas em um hemo. As células dentro da área de contagem indicada pela caixa vermelha serão contadas. As células não viáveis absorverão o azul de triam e aparecerão azuis, enquanto as células viáveis permanecerão incolores.Como mostrado aqui, o número de células viáveis no baço, mostrado à esquerda, e o número de leucócitos viáveis no fígado, mostrado à direita, aumenta ao longo do curso da infecção. Esse aumento é devido a células imunes, incluindo neutrófilos e linfócitos, que se ativam, proliferam e migram para esses dois locais de infecção. Como exemplo dos níveis de células imunes durante o curso da infecção por listeria, são apresentados aqui histogramas representativos e o número de células T positivas para CD8.O número de linfócitos T positivos para CD oito diminui temporariamente devido à linfopenia no baço nos dias dois a três, aumentando significativamente a partir do quinto dia após a infecção, tanto no baço quanto no fígado. Após este procedimento, outros métodos, como oscilação de andrógenos, linfócitos T específicos para antígenos e ensaios funcionais de células imunes classificadas, podem ser realizados para caracterizar mais detalhadamente as respostas imunes à infecção por *Listeria*.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Lo, B. C., et al. Fibrose intestinal induzida por infecção crônica por salmonela. J. Vis. Exp. (2019)O vídeo demonstra a quantificação da carga bacteriana em um modelo murino de infecção crônica com Salmonella typhimurium resistente à estreptomicina. Após a eutanásia e dissecação estéril, tecidos cecais e esplênicos são colhidos, homogeneizados com contas de aço para liberar bactérias e diluídos em série. As diluições são placadas em ágar seletivo, e colônias visíveis são contadas para...

Quantificação da Carga Bacteriana Tecidular em um modelo camundongo de infecção intestinal crônica

Fonte: McMullen, P. D., Freitag, N. E. Avaliação da invasão bacteriana de células cardíacas em cultura e colonização cardíaca em camundongos infectados usando Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra a injeção de Listeria monocytogenes na veia caudal de um camundongo para estabelecer infecção sistêmica. Ele mostra a circulação bacteriana, a colonização de órgãos e a quantificação da carga bacteriana no coração por meio da homogeneização do tecido, realização de diluições...

Quantificação da Carga Bacteriana no Coração do Camundongo Após a Injeção na Veia Caudal de Listeria monocytogenes

Source: Ahn, J. J., et al. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates bacterial load measurement in spleen and liver tissues isolated from mice infected with an intracellular bacterial pathogen. Bacteria, accumulated within tissue-resident phagocytes during systemic infection, are released using detergent-based lysis and mechanical disruption. Serial dilutions of the homogenates are plated on...

Quantification of Bacterial Load in Mouse Spleen and Liver After Systemic Infection

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

Este vídeo demonstra a quantificação da carga bacteriana infecciosa do cérebro de camundongo perfundido infectado com Listeria monocytogenes.

Avaliação da colonização bacteriana em um cérebro de camundongo após infecção por Listeria monocytogenes

Este artigo descreve um novo método para a infecção oral de camundongos,...

Transmissão Oral de<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Em camundongos através de ingestão de alimentos contaminados

Listeria monocytogenes causa infecções fetais em gestantes e meningite em populações suscetíveis.  Subpopulações de bactérias podem colonizar tecido cardíaco, causando miocardite em pacientes e animais de laboratório.  Aqui apresentamos um protocolo que descreve como avaliar a invasão de células cardíacas L. monocytogenes in vitro e colonização cardíaca em animais infectados.

Avaliação da invasão bacteriana de células cardíacas na cultura e colonização cardíaca em camundongos infectados usando listeria monocytogenes

Este protocolo descreve como para inocular ratinhos C57BL / 6J com a estirpe de Listeria monocytogenes EGD (L. monocytogenes) e para medir o interferão-γ (IFN-γ) respostas de células assassinas naturais (NK), as células T assassinas naturais (NKT), e adaptativa linfócitos T após a infecção. Este protocolo descreve como também a realização de estudos de sobrevivência de ratinhos após a infecção com uma dose de LD 50 modificada do agente patogénico.

Infecção experimental com<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como um modelo para estudar o anfitrião Respostas interferão-y

Durante a infecção, a Listeria monocytogenes é capaz de atravessar a barreira hemato - encefálica para colonizar o cérebro. Neste protocolo, demonstramos como avaliar a colonização bacteriana de órgãos após a infecção de camundongos. Está previsto um procedimento para executar a perfusão de órgão inteiro para determinação específica dos números bacterianas do parênquima cerebral.

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Aqui nós apresentamos um protocolo elegante na vivo avaliação da vacina respostas imunes de eficácia e de acolhimento. Este protocolo pode ser adaptado para modelos de vacina que estudar virais, bacterianas ou parasitárias patógenos.

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

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