Avaliação de anticorpos neutralizantes funcionais contra SARS-CoV-2

Comece com soro humano diluído em série contendo concentrações variadas de anticorpos neutralizantes contra o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave ou SARS-CoV-2.

Introduzir vírus pseudotipados com RNA de luciferase, integrase e transcriptase reversa, encapsulados em uma bicamada lipídica contendo proteínas spike SARS-CoV-2.

Os anticorpos neutralizam os vírus com base na diluição do soro, com diluições mais baixas exibindo neutralização máxima.

Introduzir células-alvo que expressam receptores da enzima conversora de angiotensina-2 ou receptores ACE2 e protease transmembrana serina-2 ou TMPRSS2.

Em diluições séricas mais altas, os vírus não neutralizados interagem com os receptores ACE2, enquanto TMPRSS2 cliva a proteína spike, permitindo a fusão do vírus.

Após a entrada, o RNA da luciferase é transcrito reversamente para o DNA que se integra ao genoma do hospedeiro e produz a enzima luciferase.

Substitua o meio por um tampão de ensaio contendo substrato de luciferase e um agente de lisagem.

As células se lisam, liberando luciferase intracelular, que interage com o substrato e produz alta luminescência.

Quantifique a luminescência nas diluições de soro para determinar a porcentagem de neutralização viral - a diluição que atinge cinquenta por cento de neutralização representa o título de neutralização.

Para começar, adicione 50 microlitros de DMEM com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina às linhas B a H, colunas 1 a 12 de uma placa branca de 96 poços.

Adicione 5 microlitros de soros convalescentes nos poços da fileira A, colunas 2 a 10, em um volume total de 100 microlitros de DMEM com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina. Adicione 5 microlitros de anti-soros positivos e negativos nos poços A11 e A12 como controles.

Remova 50 microlitros da solução dos poços da linha A e execute diluições seriais duplas de todos os poços abaixo dela. Para cada diluição, use uma pipeta multicanal para misturar as soluções 5 a 10 vezes, pipetando para cima e para baixo sem criar bolhas de ar.

Depois de completar a diluição serial, descartar os 50 microlitros finais do último poço de cada coluna.

Centrifugue a placa por 1 minuto a 500 rotações por minuto para garantir que nenhum líquido seja deixado nas paredes do poço. Calcule a quantidade de DMEM necessária para diluir o PV SARS-CoV-2 conforme descrito no manuscrito do texto.

Misturar a solução fotovoltaica diluída numa bacia de pipeta e alíquota de 50 microlitros em cada alvéolo, excepto nos poços A6 a A12, que compreendem o controlo apenas por célula. Os poços A1 a A6 servem como controle somente fotovoltaico.

Placa de centrífuga por 1 minuto a 500 rotações por minuto para garantir que nenhum vírus seja deixado nas paredes do poço. Em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 1 hora para permitir que o soro se ligue à glicoproteína SARS-CoV-2.

Em seguida, prepare uma placa de células-alvo HEK 293T / 17 transfectadas 24 horas antes com plasmídeos ACE2 e TMPRSS2. Retire o meio de cultura da placa e lave-o duas vezes com 2 mililitros de PBS, adicionando-o a um lado do prato para evitar o descolamento celular.

Descarte o PBS e adicione 2 mililitros de tripsina ao prato. Coloque a placa em uma incubadora até que as células sejam separadas.

Depois que as células se separarem, adicione 6 mililitros de DMEM com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina à placa para extinguir a atividade da tripsina e ressuspender as células suavemente.

Conte as células usando um contador de células automatizado ou contando a lâmina da câmara. Adicione 1 x 10⁴ células alíquotas em um volume total de 50 microlitros a cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 a 72 horas.

Após a incubação, remova os meios de cultura de todos os poços e adicione 25 microlitros de uma mistura 1:1 de PBS e um reagente comercial de ensaio de luciferase. Leia a placa usando um sistema comercial de ensaio de luciferase com um luminômetro de microplaca.

Usando os dados brutos gerados pelo luminômetro, calcule os títulos de anticorpos neutralizantes IC50 conforme descrito no manuscrito do texto.