$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Comece colocando os componentes do moedor de lenços de papel no gelo. Este dispositivo inclui um almofariz e dois pilões de diâmetros diferentes.
Despeje um tampão de sal resfriado na argamassa e, em seguida, adicione tecido cerebral de camundongo.
O tampão mantém o equilíbrio osmótico, preservando a estrutura e a função celular.
Triture o tecido com vários movimentos suaves usando o pilão de menor diâmetro, que corta mecanicamente o tecido em pedaços menores.
Em seguida, acaricie com o pilão de diâmetro maior, facilitando a quebra do tecido em suas células componentes.
Transfira a mistura para um tubo e centrifugue.
Remova o sobrenadante.
Adicione tampão de sal resfriado e vórtice para quebrar os aglomerados de células e a mielina.
Em seguida, adicione um meio de gradiente de densidade e centrifugue.
Devido às diferenças de forma e massa, as células se acomodam na camada inferior, enquanto os detritos e a mielina se acumulam na camada superior.
Descarte o sobrenadante.
Adicione uma solução adequada para obter uma suspensão de células múltiplas para uso posterior.
Para homogeneização de tecidos, adicione 3 mililitros de HBSS pré-resfriado à argamassa de vidro pré-resfriada de um moedor de lenços Dounce e transfira a metade de um dos cérebros colhidos para a argamassa. Macerar suavemente o tecido com 10 pinceladas de pilão A, seguidas de 10 pinceladas de pilão B, e transferir a mistura homogeneizada para um novo tubo cônico de 15 mililitros.
Encha o tubo até um volume final de 10 mililitros com HBSS pré-resfriado para centrifugação e ressuspenda o pellet em 7 mililitros de HBSS fresco com vórtice antes de manter a amostra no gelo. Para remoção de detritos, adicione 3 mililitros de solução isotônica pré-resfriada a cada amostra digerida ou homogeneizada e subtraia suavemente as amostras para garantir que estejam homogeneamente misturadas.
Em seguida, centrifugue as amostras e remova cuidadosamente o disco esbranquiçado de detritos e mielina flutuando na superfície da solução. Quando os detritos tiverem sido descartados, colete todos, exceto os últimos 100 microlitros do sobrenadante de cada tubo, sem perturbar os pellets. Ressuspenda cada pellet em 1 mililitro de solução FACS/BL para transferência para tubos de microcentrífuga individuais de 1,5 mililitro.
Após a centrifugação com a solução de partículas, é importante remover o disco de detritos e o sobrenadante com muito cuidado, sem desalojar o pellet celular, para evitar a perda de amostra.
Após a centrifugação, aspire cuidadosamente o sobrenadante de cada tubo e ressuspenda os pellets em 350 microlitros de FACS/BL fresco por tubo.