Isolamento de células mononucleares do cérebro de camundongos: uma técnica de centrifugação por gradiente de densidade para isolar células mononucleares residentes no cérebro

As células mononucleares no cérebro, compreendendo linfócitos e monócitos, desempenham papéis cruciais na manutenção da função cerebral e da homeostase.

Para isolar essas células mononucleares, primeiro pegue um cérebro de camundongo recém-colhido perfundido com solução salina.

A perfusão permite a remoção do sangue e seus componentes dos vasos sanguíneos, permitindo o isolamento das células imunes residentes no cérebro nas etapas subsequentes.

Agora, enxágue o cérebro com meios adequados para remover os glóbulos vermelhos aderentes. Siga o enxágue com picadas para adquirir pequenos pedaços de tecido.

Homogeneizar os pedaços de tecido para obter uma suspensão de células individuais e fragmentos de células.

A esta suspensão, adicione meio resfriado e meio de gradiente de densidade adequado em volumes apropriados para formar um meio de gradiente de baixa densidade.

Em seguida, adicione um volume específico de um meio gradiente de alta densidade; a mídia gradiente de alta densidade forma uma camada separada na parte inferior, criando um gradiente de densidade descontínuo.

Centrifugue a suspensão em condições de alta velocidade e baixa temperatura. As células mononucleares ocupam a interface entre as duas camadas de mídia de gradiente de densidade.

Descarte a camada superior contendo detritos celulares e mielina - a bainha de tecido adiposo que envolve os axônios das células nervosas.

Transfira a camada de interface para um novo tubo contendo um meio e uma centrífuga adequados.

As células mononucleares purificadas sedimentam como pellets e podem ser ressuspensas em tampão para análise posterior.

Corte o crânio cuidadosamente do nariz ao pescoço e transfira o cérebro de cada animal da caixa craniana para tubos individuais de 50 mililitros contendo 10 mililitros de meio RPMI.

Misture bem os tubos para remover os glóbulos vermelhos aderentes e remova o meio por aspiração. Adicione 10 mililitros de meio fresco a cada tubo e transfira os cérebros para pratos individuais de 100 milímetros.

Pique finamente cada cérebro com uma navalha e use uma pipeta de plástico para transferir o máximo de tecido de um prato de cada vez em 6 mililitros de meio para um homogeneizador de vidro sinterizado de 7 mililitros gelado.

Triture o cérebro usando o êmbolo "solto" do pilão antes de usar o êmbolo "apertado" para trazer o tecido até que a suspensão fique homogênea. Em seguida, despeje a pasta de tecido resultante em um tubo cônico pré-resfriado de 15 mililitros no gelo.

Quando todas as amostras tiverem sido homogeneizadas, ajuste o volume em cada tubo para 7 mililitros com meio fresco antes de adicionar cada suspensão de tecido a um novo tubo resfriado de 15 mililitros contendo 3 mililitros de matriz de membrana basal 100% por tubo.

Misture por inversão algumas vezes e use uma pipeta de 3 mililitros para adicionar cuidadosa e lentamente 1 mililitro de solução de gradiente de densidade a 70% sob cada amostra de solução de tecido.

Separe as células por centrifugação com gradiente de densidade e remova quase toda a camada superior, tendo o cuidado de remover completamente toda a mielina.

Transfira a interface para um novo tubo de 15 mililitros e ajuste o volume para 10 mililitros com meio fresco. Em seguida, centrifugue as amostras novamente e remova o sobrenadante antes de ressuspender os pellets em cerca de 100 microlitros de meio por tubo.

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