Isolamento e Cultura de Células de Telencéfalos Dorsolaterais de Embriões de Camundongos

Pegue um embrião de camundongo em um tampão e separe o crânio para isolar o cérebro.

Remova as meninges, a camada membranosa que cobre o cérebro.

Disseque o cérebro para separar os hemisférios.

Isole os telencéfalos dorsolaterais dos hemisférios e transfira-os para um tubo.

Os telencéfalos dorsolaterais são ricos em neurônios e células progenitoras neurais.

Centrifugue e remova o sobrenadante.

Adicione uma solução enzimática. As enzimas quebram a matriz do tecido, soltando as células.

Introduzir um meio de proliferação contendo soro. As proteínas séricas inibem a atividade enzimática.

Use uma pipeta para dissociar mecanicamente o tecido, formando uma suspensão celular.

Centrifugue e remova o sobrenadante contendo enzimas inativadas e detritos teciduais.

Ressuspenda as células no meio de proliferação.

Transfira as células para uma microplaca revestida com substrato de cultura de células.

Incubar para que as células adiram ao substrato. O meio facilita a proliferação de células progenitoras.

Comece removendo os cérebros de 5 a 10 embriões E14 em uma placa de Petri com meio de dissecação a frio. Use uma pinça para retirar cuidadosamente a pele e o crânio e isolar os cérebros. Ao trabalhar sob o estereomicroscópio, use uma pinça de dissecção para remover as meninges. Em seguida, divida o telencéfalo ao meio para separar os hemisférios.

Isolar o telencéfalo dorsolateral cortado ao longo da curva dorsomedial e do limite palial-subpalial. Transfira o telencéfalo dorsolateral para um tubo de 2 mililitros com meio de dissecção no gelo até que todos os cérebros sejam dissecados. Após a microdissecção do telencéfalo dorsolateral, coloque o tecido em um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, centrifugue o tubo contendo o tecido coletado e o meio de dissecção a frio por 5 minutos a 4 graus Celsius e 340 vezes g para precipitar o tecido. Após a centrifugação, remova o sobrenadante com a pipeta e adicione 1 mililitro de tripsina-EDTA a 37 graus Celsius 0,05% para digestão química. Incube por 15 minutos a 37 graus Celsius.

Após a incubação, adicione 2 mililitros de meio de proliferação para inibir a atividade da tripsina. Em seguida, polir a ponta de uma pipeta Pasteur de vidro sobre um queimador de gás ou bico de Bunsen por alguns segundos para estreitar ligeiramente a abertura. Aspire FCS para revestir a ponta da pipeta. Em seguida, dissocie mecanicamente as células com a pipeta Pasteur polida a fogo e revestida com FCS, pipetando para cima e para baixo, tomando cuidado para evitar a geração de bolhas.

Centrifugue as células dissociadas por 5 minutos a 4 graus Celsius e 340 vezes g. Remova o sobrenadante com uma pipeta. Em seguida, adicione 1 mililitro de meio de proliferação e ressuspenda as células usando uma pipeta. Remova o PBS da placa pré-tratada com poli-D-lisina. Em seguida, desenhe um sinal na parte inferior da placa que possa ser usado como referência para determinar o ponto zero.

Depois de ressuspender as células em meio de proliferação pela segunda vez, prepare uma diluição de 1 para 1 da suspensão celular usando uma solução de azul de tripano a 0,4%. Carregue nas lâminas da câmara de contagem e conte o número de células viáveis não coradas. As células inviáveis serão azuis. Dilua as células em meio de proliferação para obter 10⁶ células por mililitro. Adicione 500 microlitros da suspensão celular a cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.