Imagem e quantificação de agregados de proteínas em cérebros de drosófilas geneticamente modificadas

Comece com cérebros de Drosophila geneticamente modificados. Esses cérebros expressam uma proteína mutante vermelha marcada com fluorescência no neurônio que pode se espalhar para a célula glial circundante, expressando a proteína normal amarela marcada com fluorescência, causando sua agregação.

Adicione uma solução fixadora que preserve a integridade celular.

Remova o fixador e lave com um tampão.

Adicione um reagente antidesvanecimento e incube para evitar o desbotamento dos sinais fluorescentes.

Transfira o cérebro para uma lâmina e remova o excesso de líquido.

Permita que os cérebros adiram ao slide.

Usando pequenos pedaços de uma lamínula como espaçadores, coloque uma lamínula em cima deles. Adicione o reagente antidesbotamento e sele-o.

Sob um microscópio confocal, capture imagens usando diferentes comprimentos de onda de excitação para fluorescência vermelha e amarela.

Usando um software de análise de imagem, quantifique os agregados de proteínas.

A co-localização da fluorescência vermelha e amarela indica a disseminação de proteínas mutantes.

Depois que todos os cérebros forem dissecados, transfira o tubo de coleta para um nutador em temperatura ambiente e balance-os por cerca de 5 minutos. Após o período de fixação, remova a maior parte da solução fixadora usando uma pipeta P1000 e descarte-a, tomando muito cuidado para deixar os cérebros nas trompas. Isso requer sucção suave e observação cuidadosa.

Em seguida, adicione 1 mililitro de PBST fresco ao cérebro. Cubra o tubo e deixe-o balançar no nutator por cerca de um minuto para lavar o fixador restante. Em seguida, remova a solução e repita esta pequena etapa de lavagem.

Siga as duas lavagens curtas com uma lavagem de 5 minutos, depois três lavagens de 20 minutos e, finalmente, uma única lavagem de 1 hora. Após a última lavagem, remova cuidadosamente a maior parte do PBST e mergulhe os cérebros em 30 microlitros de reagente anti-desbotamento à base de glicerol. Em seguida, incube os cérebros a 4 graus Celsius no escuro sem movimento por 1 a 24 horas.

Mais tarde, remova os cérebros do tubo de coleta usando uma ponta de pipeta embotada e transfira-os para uma lâmina de microscópio. Em seguida, oriente suavemente os cérebros conforme necessário para imagens usando fórceps. Várias amostras podem ser montadas na mesma lâmina em linhas separadas.

Em seguida, remova o excesso de reagente anti-desbotamento da lâmina usando o canto de um tecido de laboratório dobrado. Não deixe o tecido entrar em contato com o cérebro. Em seguida, deixe as amostras no escuro por 5 a 10 minutos para permitir que os cérebros adiram à lâmina.

Em seguida, pegue pequenos pedaços de vidro quebrado e posicione-os ao redor do cérebro, cobrindo uma área de cerca de 19 milímetros quadrados. Em seguida, abaixe suavemente uma lamínula de 22 milímetros quadrados sobre o mosaico de cérebros e vidro para fazer uma montagem de ponte. Em seguida, dispense lentamente o reagente anti-desbotamento fresco sob a lamínula para preencher os espaços vazios. Faça isso com muito cuidado para que o cérebro e o vidro permaneçam no lugar. Em seguida, sele a lamínula com esmalte. Primeiro, basta aplicá-lo nos cantos. Deixe os pincels de canto secarem 5 a 10 minutos antes de completar a vedação ao longo das bordas. Os cérebros devem ser visualizados o mais rápido possível.

Visualize os cérebros montados usando um microscópio confocal equipado com uma objetiva de óleo de 40x ou 63x para coletar fatias z na região do cérebro onde os transgenes são expressos. Em seguida, analise os dados quantificando os pontos nas fatias z individuais ou, alternativamente, depois de renderizar as fatias em três dimensões.

Para quantificar agregados de Huntington mutantes que estão bem separados e têm pouco sinal de fundo, abra a série z confocal no modo de visualização 3D . Em seguida, use o Assistente de análise para identificar pontos individuais em um canal selecionado.

Nas configurações, ajuste o limite e os filtros para representar com precisão todos os agregados de tamanho heterogêneo como objetos individuais na imagem. Em seguida, habilite Dividir Objetos em Pré-Filtro de Processamento Binário para separar agregações intimamente associadas. As informações quantitativas sobre os objetos identificados pelo software são relatadas em Medições.

Após a contagem dos pontos, caracterizá-los ainda mais em software de análise de imagens. Por exemplo, faça medições relevantes dos pontos ou superfícies para obter informações agregadas de diâmetro, volume ou intensidade. Alguns agregados de Huntington do tipo selvagem podem ser quantificados movendo-se manualmente através da pilha z e contando os pontos verdes que são distinguíveis do sinal difuso circundante.

Tenha cuidado para evitar contar agregados individuais duas vezes quando eles aparecerem em mais de uma fatia. Outra análise de interesse é determinar a frequência de co-localização entre os agregados Huntington Q25-YFP e Huntington Q91-mCherry. Faça isso usando a contagem manual, movendo-se fatia por fatia através de uma pilha z confocal.