Dissecando interação hospedeiro-vírus em replicação lítica de um herpesvírus modelo

O objetivo geral do experimento a seguir é usar várias abordagens virológicas e bioquímicas para dissecar o papel de uma via de sinalização do hospedeiro na replicação lítica de um vírus modelo do herpes. Aqui, como exemplo, examinamos o papel da proteína de sinalização antiviral mitocondrial Mavs durante a infecção pelo vírus do herpes gama HV 68. Primeiro a examinar o papel do Mavs durante a infecção aguda, os camundongos do tipo selvagem e do Mavs knockout são infectados com gama HV 68 após uma infecção viral aguda.

O pulmão do camundongo é coletado e as cargas virais são determinadas por um ensaio de placa no qual as amostras são diluídas e plaqueadas em série. Em monocamadas, o número de placas é então contado. O aumento das cargas virais nos camundongos knockout sugere que o gene de interesse desempenha um papel antiviral.

Por outro lado, cargas virais reduzidas em camundongos knockout indicam que o gene é necessário para a infecção viral Para validar esses achados. A cinética de crescimento viral in vitro em várias etapas é examinada em fibroblastos embrionários de camundongos, fibroblastos embrionários de camundongos do tipo selvagem e mavs knockout são infectados com gama HV 68 e incubados por várias vezes. As células são então coletadas e ensaios de placa são realizados para comparar a cinética de crescimento em várias etapas entre células do tipo selvagem e células deficientes em mavs.

Para validar ainda mais essas descobertas, as células de fibroblastos embrionários de camundongos selvagens e mavs knockout são infectadas com gama HV 68. Em seguida, o DNA e o RNA são extraídos separadamente das células infectadas e os transcritos genômicos virais são analisados por PCR em tempo real. Tivemos a ideia para este protocolo pela primeira vez quando estudamos o papel de uma via de imunidade do hospedeiro durante uma infecção lítica por vírus.

Este protocolo pode ser potencialmente aplicado para investigar as regras das vias de sinalização do hospedeiro durante a infecção por outros patógenos. Comece este procedimento permitindo que camundongos de seis a oito semanas de idade se aclimatem por um período de quatro dias após o envio. O experimento a seguir será realizado em uma instalação de risco biológico.

Na preparação, coloque equipamentos de proteção individual, incluindo jaleco, luvas, máscara e botas trabalhando em um gabinete de biossegurança. Nível dois. Preparar a suspensão viral com 40 a 10 000 PFU de gama HV 68 e 30 microlitros de PBS estéril para cada ratinho que será infetado.

Mantenha a suspensão viral no gelo após uma injeção intraperitoneal de cetamina xilazina. Certifique-se de que os ratos foram sedados beliscando o dedo do pé. Em seguida, usando uma pipeta, aplique 30 microlitros da suspensão viral gota a gota na narina esquerda ou direita.

Deite o mouse de lado por cinco a 10 minutos para facilitar a entrega do vírus nas vias aéreas ao pulmão. Em seguida, coloque os ratos de volta na gaiola e monitore-os até que se recuperem totalmente da sedação. Em seguida, o tecido pulmonar é coletado dos camundongos injetados para preparar um lisado celular para avaliar o título viral em vários dias após a infecção.

Coloque os pulmões colhidos de camundongos sacrificados em tubos estéreis de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de esferas de sílica de zircônia de 1,0 milímetro no gelo. Se não prosseguir para a próxima etapa no mesmo dia. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius.

Caso contrário, adicione um mililitro de DMEM sem soro frio. Coloque o tubo em um batedor de esferas e pressione start para homogeneizar os pulmões por 30 segundos. Para evitar o superaquecimento da amostra que pode inativar o vírus.

Refrigerar o tubo sobre gelo durante pelo menos um minuto após 30 segundos de homogeneização. Em seguida, repita este processo. Em seguida, centrifugue o tecido homogeneizado a 16.000 RCF a quatro graus Celsius por um minuto.

Após a rotação, os detritos celulares estarão no fundo do tubo e os lipídios estarão na superfície. Imediatamente Pegue o snat conforme mostrado aqui para realizar um ensaio de placa usando uma monocamada NIH três T três ou BHK 21. Em seguida, um ensaio de placa é realizado Para determinar o título viral presente na amostra, inicie o ensaio de placa fazendo uma diluição em série do sobrenadante viral.

Primeiro, usando uma pipeta multicanal, adicione 270 microlitros de mídia a uma placa de 96 poços. Deixe a primeira linha em branco. Em seguida, adicione 200 microlitros de sobrenadante à primeira linha da placa de 96 poços cada amostra em triplicata.

Em seguida, transfira 30 microlitros da amostra da primeira linha para a próxima linha e misture. Em seguida, transfira 30 microlitros da mistura para a próxima linha e misture. Repita esta etapa várias vezes para fazer diluições seriais dez vezes.

Em seguida, adicione o sobrenadante viral diluído na monocamada celular. Em uma placa de 24 poços. Coloque a placa em uma incubadora e agite a placa a cada 30 minutos durante uma incubação de duas horas após a incubação para remover os detritos celulares, aspire o sobrenadante da placa.

Em seguida, lave as células uma vez com meio fresco. Após a lavagem, adicione meio contendo metilcelulose às células. Incube as células por quatro a seis dias.

Depois de quatro a seis dias. Use um microscópio para ler o número da placa para cada amostra. Registar o número de placas para cada diluição.

Em seguida, calcule a média e o desvio padrão. Poços contendo muitas ou poucas placas não podem ser usados para calcular com precisão o título. Portanto, para cada amostra, use uma diluição na qual haja de sete a 70 placas.

Esta amostra diluída 1000 vezes tem uma média de 23 placas por poço. Para calcular o título viral na solução não diluída, multiplique o fator de diluição pelo número de placas pelo número de microlitros em um mililitro. Em seguida, divida isso pelo volume de sobrenadante diluído adicionado por poço.

Então, neste exemplo, 1000 vezes 23 placas vezes 1000 microlitros por mililitro dividido por 100 microlitros é igual a 2,3 vezes 10 elevado à quinta unidade formadora por mililitro. Em seguida, uma solução de estoque viral com um título conhecido é usada para determinar a cinética de crescimento de gama HV 68 em fibroblastos embrionários de camundongos ORMs começam dividindo mitos de tipo selvagem e aqueles deficientes em um gene hospedeiro em uma placa de 24 poços a 10.000 células por poço. No dia seguinte, substitua o meio em cada poço por 0,5 mililitros de uma suspensão baixa MOI gama HV 68.

Coloque a placa na incubadora a 37 graus Celsius e deixe a incubação prosseguir por duas horas durante a incubação. Balance a placa a cada 30 minutos após a incubação. Use uma pipeta para remover a suspensão viral e adicione 0,5 mililitros de DM EM completo fresco contendo 8% de soro bovino fetal às células infectadas pelo vírus.

Coloque as células de volta na incubadora vários dias após a infecção. Colha as células da extremidade média pipetando para cima e para baixo várias vezes. Transfira-os para tubos de centrífuga estéreis de 1,5 mililitro, congele imediatamente os tubos a 80 graus Celsius negativos para liberar gama HV 68 do Mets.

Execute três ciclos de congelamento e descongelamento. Descongele as células colocando-as a 37 graus Celsius. Em seguida, faça um vórtice e coloque-os de volta no freezer de 80 graus Celsius negativos.

Determine o título viral por um ensaio de placa usando uma monocamada NIH três T três ou BHK 21, conforme mostrado anteriormente, para examinar se a replicação do DNA ou RNA é afetada pela deficiência em genes hospedeiros ou genes virais. Comece com mes infectado em vários dias após a infecção, descarte o sobrenadante, enxágue as células com PBS frio e células de gelo de tripsina. Em seguida, pulverizar as células por centrificação a 1000 RCF à temperatura ambiente durante um minuto após a centrifugação, rejeitar o sobrenadante e armazenar as células a 80 graus Celsius negativos.

Extrair DNA e RNA totais, que são de origem hospedeira e viral. Em seguida, centrifugue as colunas de centrifugação. Realize PCR em tempo real usando DNA total e primer específico para transcritos líticos virais.

Determine a quantidade relativa do genoma intracelular gama HV 68 em referência a um gene de manutenção do hospedeiro, como a beta actina. Prepare o CDNA com RNA total e oligo DT primer. Realize PCR em tempo real usando CD NA e primers como acima para determinar a quantidade relativa de transcritos virais.

Em referência ao gene hospedeiro de limpeza, Mavs é a abreviação de sinalização antiviral mitocondrial, como mostrado aqui. A molécula adaptadora de Mavs transmite a sinalização de receptores semelhantes a olhos de rig citosólicos para ativar os fatores reguladores de NF kappa B e interferon IRFs que, por sua vez, regulam positivamente a expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias e interferons. As cargas virais no pulmão de camundongos do tipo selvagem infectados com gamma HV e camundongos com ninhada deficiente em Mavs são mostradas aqui.

A deficiência em Mavs reduziu significativamente as cargas virais no pulmão 10 dias após a infecção, indicando que o Mavs é necessário para uma infecção viral eficiente in vivo. Esta figura mostra uma curva de crescimento viral em várias etapas em fibroblastos embrionários de camundongos do tipo selvagem e aqueles deficientes em deficiência de Mavs em Mavs. Crescimento viral significativamente atrasado em fibroblastos embrionários de camundongos, indicando que Mavs é necessário para replicação viral eficiente in vitro Os níveis de mRNA de genes líticos virais em fibroblastos embrionários de camundongos infectados com gama HV 68 foram analisados por deficiência de PCR em tempo real em Mavs, reduziram significativamente os níveis de mRNA de três genes líticos essenciais.

Todos esses resultados coletivamente apóiam a conclusão de que Mavs é necessário para a ativação da transcrição gama HV 68 e replicação lítica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como interrogar a interação patógeno hospedeiro em vários níveis, tanto no VO quanto no Vevo. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos pode ser extremamente hesitante.

Precauções como o uso de equipamentos de proteção individual devem ser tomadas durante as apresentações.