Imagem de fluorescência ao longo da vida da agregação de proteínas PolyQ em neurônios de Caenorhabditis elegans

Comece com vermes Caenorhabditis elegans anestesiados, pareados por idade, com deficiência de chaperona.

Ambos os grupos expressam proteínas poliQ marcadas com fluoróforo em seus neurônios que são propensas a dobramentos incorretos.

Em vermes de controle, as proteínas chaperonas limitam a agregação de poliQ mal dobrada, enquanto, em vermes deficientes em chaperonas, o poliQ mal dobrado forma prontamente agregados.

Coloque a lâmina de controle em uma platina de microscópio confocal para Microscopia de Imagem de Fluorescência (FLIM).

Ilumine os vermes usando um laser pulsado.

O laser excita o fluoróforo, que emite um fóton à medida que retorna ao estado fundamental.

FLIM mede a vida útil da fluorescência - a duração em que o fluoróforo permanece em seu estado excitado.

Em vermes deficientes em chaperonas, a agregação polyQ agrupa fluoróforos, promovendo a transferência de energia entre fluoróforos adjacentes em vez da emissão de fótons, reduzindo assim o tempo de vida da fluorescência.

O software FLIM processa esses tempos de vida para gerar mapas codificados por cores, permitindo a visualização da agregação.

Um tempo de vida de fluorescência reduzido em vermes deficientes em chaperonas, em comparação com os controles, indica aumento da agregação de poliQ.

Certifique-se de que os nematóides estejam completamente imóveis. Abra o software de aquisição FLIM. Localize o botão Tab e pressione Enable Outputs. Coloque a lâmina com o C. elegans montado no palco e, usando uma lente de ampliação de 10 vezes no modo de transmissão, localize a posição dos nematóides na lâmina. Remova o slide, mude a objetiva para uma lente de ampliação de 63 vezes e aplique o meio de imersão necessário.

Coloque a lâmina no palco e localize os nematóides. Comece a digitalizar a amostra. Selecione uma região de interesse e concentre-se em seu plano de projeção máximo. Na interface do software FLIM, visualize o número de fótons detectados. O valor do ADC deve estar entre 1 vezes 10 elevado ao quarto e 1 vezes 10 elevado ao quinto. Se necessário, mude o foco para um plano diferente ou aumente a potência do laser para coletar mais fótons.

- Certifique-se de evitar o acúmulo de fótons, mas colete uma quantidade suficiente de fótons para criar um bom ajuste e medição da vida útil.

- Na barra de menus, selecione a guia para definir os parâmetros de aquisição. Selecione Scan Sync In para permitir a detecção de um único fóton. Defina a aquisição para um período fixo de tempo ou um número fixo de fótons. Pressione Iniciar para iniciar a aquisição. Abra o software e importe os arquivos de dados FLIM via Arquivo, Carregar dados FLIM. Carregue todas as amostras de uma condição, mesmo que obtidas em sessões diferentes e de repetições biológicas diferentes.

Se necessário, segmente um único nematóide para muitas imagens FLIM por meio do Segmentation, Segmentation Manager. Arraste a ferramenta de corte ao redor da área de interesse até que ela seja realçada. Depois de concluído, pressione OK. Selecione uma pequena região onde a imagem baseada em intensidade de um C. elegans apareça. A curva de decaimento dessa região aparece na grande janela de decaimento no lado direito da interface.

Para extrapolar o tempo de vida na guia Dados, defina um valor mínimo integrado arbitrário entre 40 e 300 para excluir todos os pixels que estão muito escuros para produzir um bom ajuste. Selecione um número de tempo mínimo e um número máximo de tempo para limitar o sinal FLIM a esses valores. Não altere as contagens predefinidas de fótons de um. Insira a taxa de repetição em megahertz do laser utilizado durante a aquisição.

Insira um valor máximo de porta para excluir todos os pixels saturados. Na guia Tempo de vida, selecione um acessório global a ser usado. Não altere nenhum outro parâmetro, exceto o número de seleção exponencial, se for sabido que o decaimento de fluorescência escolhido é multiexponencial e exibe mais de um único tempo de vida.

Carregue o IRF através do menu IRF. Para estimar o deslocamento do IRF, selecione IRF, Estimar, Deslocamento do IRF. Um conjunto de valores aparece automaticamente na guia IRF. Uma vez estabelecido, não altere nenhum outro parâmetro desta guia. Depois que todos os parâmetros estiverem definidos, pressione Ajustar conjunto de dados. O ajuste resultante destacado em uma linha azul deve se sobrepor a todos os eventos. Um bom ajuste é obtido quando todos os eventos são alinhados ao longo do ajuste.

Clique na guia Parâmetros localizada nos menus superiores direitos da interface do software e selecione estatística, média ponderada e verifique se o valor do qui-quadrado está o mais próximo possível de um. O valor do tempo de vida da imagem selecionada é, portanto, revelado como tau 1. Exporte qualquer informação de interesse através de Arquivo, Exportar Imagens de Intensidade, Tabela de Resultados de Ajuste, Imagens, Histogramas.