PDMS Fabricação de dispositivos e modificação da superfície

Meu nome é Ken Kotz. Eu sou um pós-doutorado aqui no Bio MAs Resource Center afiliado ao Massachusetts General Hospital. Meu principal projeto de pesquisa envolve o isolamento de neutrófilos usando um dispositivo de captura de imunoafinidade com estruturas microfluídicas.

Usamos este dispositivo em cinco hospitais diferentes em todo o país para isolar o RNA para análise genômica a jusante. Basicamente, o que você tem é um mestre de SU oito fotorresistíveis em cima de silício. Vamos derramar um elastômero de duas partes APDMS em cima desse mestre e esse PDMS formará um molde.

Removemos o molde mestre de sua caixa e o colocamos em uma placa de Petri. O mestre é preso por fita adesiva no fundo de uma placa de Petri. Na balança, pesamos uma mistura de PDMS, endurecedor e resina de base.

A proporção é de uma parte de endurecedor para 10 partes de resina. Normalmente, para nossos dispositivos que foram cortados, pesamos 20 a 30 gramas da resina e dois a três gramas, respectivamente, do endurecedor. Depois de despejar o endurecedor e a resina no pequeno barco de soro de leite, usamos um garfo de plástico padrão para misturar os dois.

Certifique-se de misturar vigorosamente e dobrar a mistura uma sobre a outra para garantir que o endurecedor seja distribuído uniformemente dentro da resina. Normalmente, monitoramos o quão bem os dois foram misturados. Ao observar o número de bolhas de ar, tentamos obter uma distribuição uniforme de pequenas bolhas de ar por todo o elastômero.

Em seguida, despejamos o PDMS em cima do mestre SU oito que está na placa de Petri. Colocamos o mestre com o PDMS em cima dele em uma redoma a vácuo e evacuamos a câmara para desgaseificar o ar que misturamos a ela. Normalmente, o processo de desgaseificação leva de 30 minutos a uma hora.

Após a desgaseificação, removemos os dispositivos da câmara de vácuo e os colocamos em um forno a 65 a 80 graus C. O tempo mínimo de cura nessas temperaturas é de três a seis horas. Em nosso laboratório, normalmente deixamos os dispositivos no forno durante a noite.

Normalmente, usamos uma faca de aço cirúrgica número 11. Fazemos cortes retos a cerca de meio centímetro da borda do mestre de silício e cortamos ao redor da borda do mestre fazendo um disco grande. Descascamos o molde PDMS do mestre e colocamos o lado do recurso para cima em uma placa de Petri limpa.

Retiramos o molde liberado da placa de Petri e o colocamos em uma superfície de corte usando uma faca ou uma faca montada em um trilho linear. Seccionamos os dispositivos contidos no molde. Cada dispositivo de seção é então colocado de volta na placa de Petri para processamento posterior.

Normalmente, para fazer a interface de nossos dispositivos com fluidos, faremos furos no dispositivo PDMS. O dispositivo que usamos para fazer furos é uma seringa padrão de três moinhos. Na ponta da seringa de três moinhos está uma agulha de aço inoxidável de ponta romba.

Dentro da agulha de aço inoxidável há um fio que se encaixa no diâmetro interno da agulha. Esse fio está preso ao êmbolo da seringa Ao puxar o êmbolo para trás e retrair a agulha, você pode fazer um furo ou perfurar um plugue no PDMS. Vire o dispositivo PDMS e ejete-o empurrando o êmbolo.

O segredo dos dispositivos de perfuração é manter o êmbolo o mais vertical possível e não girar o dispositivo de perfuração. Quando você perfura o PDMS, você levanta todo o dispositivo, todo o dispositivo PDMS com uma pinça, vira-o e ejeta o plugue pressionando o êmbolo. Você pega o plugue com uma pinça e o descarta.

Em seguida, você retrai o êmbolo novamente, vira o dispositivo de volta para baixo e puxa o dispositivo de corte. Você repete isso até ter todos os seus furos perfurados. Portanto, para o processo de colagem, unimos nossos dispositivos PDMS a lâminas de vidro.

Para nossos dispositivos, vamos unir ou conectar covalentemente o PDMS de forma não reversível a lâminas de vidro. A maneira como isso é feito é colocando-os em a, colocando-os em um plasma Asher e expondo-os a um plasma de oxigênio reativo. Portanto, as etapas para fazer isso são pegar o dispositivo PDMS e colocá-lo na bandeja do Asher de plasma.

Com os recursos do dispositivo voltados para cima, você pode usar qualquer lâmina de microscópio de vidro padrão. Usamos uma lâmina de microscópio ligeiramente ampliada de uma polegada e meia para caber em nosso dispositivo. Você pode usá-los direto da embalagem.

Preferimos tratá-los em uma solução de piranha. Isso limpa quaisquer contaminantes orgânicos que possam estar na superfície da lâmina de vidro. Depois de colocar o dispositivo e a lâmina de vidro em cima da bandeja para o plasma Asher, você desliza a bandeja para dentro do plasma Asher e a expõe ao plasma de oxigênio reativo.

Após a conclusão do programa do plasma Asher, abrimos a câmara e removemos a placa com nossos dispositivos para a bancada. Usando uma pinça, levantamos cuidadosamente o dispositivo PDMS, tomando cuidado para não tocar nas superfícies de colagem com os dedos. Viramos o lado de ligação no vidro, na lâmina de vidro e, em seguida, nos certificamos de que não há bolhas de ar entre o PDMS e a lâmina de vidro.

Colocamos o dispositivo PDMS agora colado ao vidro em um, em uma placa quente por 65 a 75 graus C por 10 minutos para obter uma melhor ligação química. Então, nesta parte, nesta seção, vamos modificar quimicamente as superfícies do PDMS no vidro após a colagem na sala limpa, ficamos com uma superfície A superfície PMS que tem grupos OL reativos na superfície. Precisamos que essa superfície reativa seja hidrofílica e eventualmente se difunda na maior parte do PMS.

Portanto, a química da superfície é melhor realizada imediatamente após o tratamento com plasma, vamos usar uma solução de 5% de um capto me. É um três me capto, propil, trimeth oxy. É uma solução de 5% por volume e, basicamente, o que fazemos é injetá-la na entrada e garantir que você encha completamente o dispositivo sem bolhas de ar.

Se houver bolhas de ar, empurre-as para fora com uma pinça. Isso, uma vez que você injetou o slan, você o deixou descansar por 15 a 30 minutos. À temperatura ambiente, você normalmente injeta um segundo volume da slan 10 minutos após a reação.

Então, depois que a cilina reagir por aproximadamente meia hora, vamos lavar todos os dispositivos com três a quatro volumes de etanol puro. O excesso que ejetamos será apenas limpo com um lenço químico Após o enxágue dos dispositivos, pegamos os dispositivos e os colocamos em uma placa quente, que é ajustada para cem graus C, e basicamente permitimos que o etanol que está lá evapore. Isso ajuda a ajoelhar a superfície de silagem.

Depois que o dispositivo estiver seco, ele pode ser armazenado em um local desidratado por meses ou pode, você pode pegar o dispositivo e prosseguir imediatamente para a próxima etapa. Depois que os dispositivos curaram, eles curaram com um revestimento senoidal agora no vidro e na superfície do PDMS. O seno é um capto seno com o grupo tiol, que reagirá com nosso reticulador heterobifuncional, que é o GMBS.

É diluído em etanol puro. É reativo à água, por isso é preciso tomar cuidado para não expô-lo a condições aquosas. Nós o injetamos nos dispositivos e removemos todas as bolhas de ar com uma pinça, como estou fazendo aqui, para garantir que todas as superfícies estejam casadas com essa molécula.

Nós o cobrimos e o deixamos reagir por meia hora. Depois que o GMBS reagir por meia hora, vamos lavar os dispositivos com água desionizada para remover quaisquer vestígios de etanol que estejam no dispositivo. E então vamos fluir através do neu travain, que é a proteína de ligação à biotina.

O neu travain é então pré-diluído a uma concentração de 10 microgramas por mil. Se, se algum ar for injetado acidentalmente no dispositivo, o dispositivo precisará ser lavado novamente com etanol para remover efetivamente todos os úmidos de etanol de ar, o dispositivo terá uma melhor superfície e permitirá que você remova quaisquer bolhas de ar que foram acidentalmente introduzidas no dispositivo. E uma vez que os dispositivos tenham sido lavados com a água ionizada, normalmente enchemos o dispositivo com dois a quatro volumes de dispositivo da solução diluída de evidência neutra T travain.

O trabalho de Nutt reagirá com o GMBS, que é imobilizado para a superfície por qualquer meio primário no trabalho de Nutt. Este processo pode ocorrer em temperatura ambiente por uma hora. Normalmente, coloco os dispositivos na câmara fria a quatro graus C durante a noite.

Antes de adicionarmos o anticorpo, no entanto, queremos eliminar qualquer, qualquer Aden, que não esteja ligado em solução. E fazemos isso fluindo através da solução de 1% de BSA diluída em PBS. Como esses chips serão usados para análise genômica a jusante, todas as soluções que usamos são livres de RNA.

Normalmente, o que fazemos é lavar o dispositivo com quatro a cinco volumes da solução de 1% BSA. E depois disso, adicionamos nosso anticorpo. O anticorpo para este experimento é o CD 66 B e anticorpos específicos para granulócitos no sangue total.

Usamos uma concentração de 10 a 25 microgramas por mil e injetamos o anticorpo. Vamos injetar 200 microlitros de anticorpos em cada dispositivo. Faremos duas injeções de cem microlitros, uma em cada porta do dispositivo.

Normalmente, injetamos cem microlitros em uma porta, esperamos 30 minutos e injetamos mais cem microlitros na porta oposta.