PDMS Fabricação de dispositivos e modificação da superfície

Meu nome é Ken Kotz. Sou pós-doutorando no Bio MAs Resource Center, vinculado ao Massachusetts General Hospital. Meu projeto de pesquisa principal envolve o isolamento de neutrófilos utilizando um dispositivo de captura por afinidade imunológica com estruturas microfluídicas.

Utilizamos este dispositivo em cinco hospitais diferentes em todo o país para o isolamento de RNA destinado à análise genômica subsequente. Basicamente, o que se tem é um molde mestre de resistência fotossensível SU-8 sobre silício. Vamos despejar um elastômero bifásico A-P-D-M-S sobre esse molde mestre e o PDMS formará um molde.

Retiramos o molde mestre de seu invólucro e o colocamos em uma placa de Petri. O molde mestre é fixado com fita na parte inferior da placa de Petri. Na balança, pesamos uma mistura de PDMS, agente endurecedor e resina base.

A proporção é uma parte de endurecedor para dez partes de resina. Normalmente, para nossos dispositivos que foram recortados, pesamos de 20 a 30 gramas da resina e, respectivamente, de dois a três gramas do endurecedor. Após despejar o endurecedor e a resina no pequeno recipiente de polipropileno, utilizamos um garfo plástico comum para misturá-los.

Você deve garantir que a mistura seja feita vigorosamente e que o conteúdo seja dobrado sobre si mesmo para assegurar que o endurecedor seja uniformemente distribuído dentro da resina. Normalmente, monitoramos o quão bem os dois componentes foram misturados. Ao observar o número de bolhas de ar, procuramos obter uma distribuição uniforme de pequenas bolhas de ar por todo o elastômero.

Em seguida, despejamos o PDMS sobre o molde SU oito que está na placa de Petri. Colocamos o molde com o PDMS sobre ele em uma câmara de vácuo com frasco de sino e evacuamos a câmara para remover o ar que misturamos ao material. Normalmente, o processo de dessorção leva de 30 minutos a uma hora.

Após a desgaseificação, removemos os dispositivos da câmara de vácuo e os colocamos em um forno a 65–80 °C. O tempo mínimo de cura nessas temperaturas é de três a seis horas. Em nosso laboratório, normalmente deixamos os dispositivos no forno durante a noite.

Normalmente, utilizamos uma lâmina cirúrgica de aço número 11. Fazemos cortes retos para baixo, cerca de meio centímetro a partir da borda do molde de silício, e cortamos ao redor da borda do molde, formando um grande disco. Removemos cuidadosamente o molde de PDMS do molde original e colocamos a face com os detalhes voltada para cima em uma placa de Petri limpa.

Retiramos o molde liberado da placa de Petri e o colocamos sobre uma superfície de corte usando uma faca ou uma faca montada em um trilho linear. Seccionamos os dispositivos contidos no molde. Cada dispositivo seccionado é então devolvido à placa de Petri para processamento adicional.

Normalmente, para interligar nossos dispositivos com fluidos, faremos furos no dispositivo de PDMS. O dispositivo que utilizamos para fazer os furos é uma seringa padrão de três mil. Na ponta da seringa de três mil há uma agulha de aço inoxidável com ponta romba.

Dentro da agulha de aço inoxidável há um fio que se ajusta ao diâmetro interno da agulha. Esse fio está preso ao êmbolo da seringa. Puxando o êmbolo para trás e retratando a agulha, é possível perfurar um orifício ou inserir um tampão no PDMS. Vire o dispositivo de PDMS e ejetou-o empurrando o êmbolo.

O segredo para utilizar dispositivos de perfuração é manter o êmbolo o mais vertical possível e não girar o dispositivo de perfuração em hipótese alguma. Ao perfurar o PDMS, você levanta todo o dispositivo, todo o dispositivo de PDMS, com uma pinça, vira-o do avesso e ejeta o tampão pressionando o êmbolo para baixo. Você pega o tampão com uma pinça e o descarta.

Em seguida, você retrai novamente o êmbolo, vira o dispositivo de volta para baixo e retira o dispositivo de corte. Repita esse procedimento até que todos os furos tenham sido perfurados. Quanto ao processo de ligação, ligamos nossos dispositivos de PDMS a lâminas de vidro.

Para nossos dispositivos, vamos ligar de forma não reversível ou anexar covalentemente o PDMS a lâminas de vidro. O método utilizado para isso consiste em colocá-los em um cinerador de plasma e expô-los a um plasma de oxigênio reativo. Assim, os passos para realização desse procedimento são pegar o dispositivo de PDMS e colocá-lo na bandeja do cinerador de plasma.

Com os recursos do dispositivo virados para cima, você pode usar qualquer lâmina de microscópio de vidro padrão. Utilizamos uma lâmina de microscópio ligeiramente maior, com um tamanho e meio polegadas, para acomodar nosso dispositivo. Você pode usá-las diretamente da embalagem.

Preferimos tratá-los com uma solução de piranha. Isso remove quaisquer contaminantes orgânicos que possam estar presentes na superfície da lâmina de vidro. Após colocar o dispositivo e a lâmina de vidro sobre a bandeja do cinzas de plasma, deslize a bandeja para dentro do cinzas de plasma e exponha-a ao plasma de oxigênio reativo.

Após a conclusão do programa do cinza de plasma, abrimos a câmara e removemos a placa com nossos dispositivos para a bancada. Usando pinças, levantamos cuidadosamente o dispositivo de PDMS, tomando cuidado para não tocar as superfícies de ligação com os dedos. Invertemos o lado de ligação sobre o vidro, sobre a lâmina de vidro, e então verificamos se não há bolhas de ar entre o PDMS e a lâmina de vidro.

Colocamos o dispositivo de PDMS, agora ligado ao vidro, em uma placa aquecedora a 65-75 °C por 10 minutos para obter uma ligação química mais forte. Nesta etapa, vamos modificar quimicamente as superfícies do PDMS no vidro após a ligação realizada na sala limpa; restará uma superfície de PDMS com grupos OL reativos na superfície. Essa superfície reativa é hidrofílica e, eventualmente, difundirá para o interior do PDMS.

Portanto, a química da superfície é melhor realizada imediatamente após o tratamento com plasma; vamos utilizar uma solução a 5% de um metilmercaptopropril. É um três metilmercaptopropil, trimetoxi. É uma solução a 5% em volume, e basicamente o que fazemos é injetá-la na entrada e garantir que o dispositivo seja completamente preenchido, sem bolhas de ar.

Se houver bolhas de ar, você as remove com pinças. Isso, uma vez que você injetou o slan, deixe repousar por 15 a 30 minutos. À temperatura ambiente, normalmente injetamos um segundo volume do slan 10 minutos após o início da reação.

Após a reação do cilin por aproximadamente meia hora, enxaguaremos todos os dispositivos com três a quatro volumes do dispositivo de etanol puro. O excesso que for ejetado será removido com um lenço químico. Após a lavagem dos dispositivos, pegamos os dispositivos e os colocamos sobre uma placa aquecedora, ajustada para cem graus C, e basicamente permitiremos que o etanol presente neles evapore. Isso ajuda a limpar a superfície de silício.

Uma vez que o dispositivo esteja seco, ele pode ser armazenado em um dessecador por meses ou você pode pegar o dispositivo e prosseguir imediatamente para a próxima etapa. Após os dispositivos terem curado, eles ficam com um revestimento de silano em ambas as superfícies, de vidro e de PDMS. O silano é um silano do tipo aminocapto com grupo tiol, que reagirá com nosso agente de reticulação heterobifuncional, que é o GMBS.

É diluído em etanol puro. É reativo à água, portanto é necessário ter cuidado para não expô-lo a condições aquosas. Injetamos-no nos dispositivos e removemos quaisquer bolhas de ar com pinças, como estou fazendo aqui, para garantir que todas as superfícies estejam revestidas com esta molécula.

Cobrimos e deixamos reagir por meia hora. Após o GMBS ter reagido por meia hora, vamos lavar os dispositivos com água desionizada para remover quaisquer traços de etanol que estejam no dispositivo. E então vamos fazer passar neutravina, que é uma proteína ligadora de biotina.

O neu travain é então pré-diluído para uma concentração de 10 microgramas por mililitro. Se, acidentalmente, algum ar for injetado no dispositivo, será necessário reenxaguá-lo com etanol para remover efetivamente todo o ar, pois o etanol molha melhor as superfícies do dispositivo e permite eliminar quaisquer bolhas de ar que tenham sido acidentalmente introduzidas. E, uma vez que os dispositivos tenham sido enxaguados com água ionizada, normalmente preenchemos o dispositivo com dois a quatro volumes do dispositivo da solução diluída de neu travain neutro.

O travain Nutt reagirá com o GMBS, que é imobilizado na superfície por qualquer meio primário no travain Nutt. Esse processo pode ocorrer à temperatura ambiente por uma hora. Normalmente, coloco os dispositivos na câmara fria a quatro graus C durante a noite.

Antes de adicionar o anticorpo, no entanto, queremos remover qualquer Aden não ligado em solução. E fazemos isso passando uma solução de BSA a 1% diluída em PBS. Como esses chips serão usados para análise genômica a jusante, todas as soluções que utilizamos são livres de RNA.

Normalmente, o que fazemos é lavar o dispositivo com quatro a cinco volumes da solução de BSA a 1%. Em seguida, adicionamos nosso anticorpo. O anticorpo para este experimento é o CD 66 B e anticorpos específicos para granulócitos em sangue total.

Utilizamos uma concentração variando de 10 a 25 microgramas por mililitro e injetaremos o anticorpo. Injetaremos 200 microlitros de anticorpo em cada dispositivo. Realizaremos duas injeções de cem microlitros cada, uma em cada porta do dispositivo.

Normalmente, injetaremos cem microlitros em uma porta e aguardaremos 30 minutos para injetar mais cem microlitros adicionais na porta oposta.