Captura de célula usando um dispositivo micro

Os dispositivos, conforme os preparamos, são embalados em kits de 10 ou 20 e, quando chegam, são enviados frios em uma caixa e o kit contém todos os componentes necessários para funcionar. O experimento no kit é, é um pacote com todas as seringas e tampões, que podem permanecer em temperatura ambiente. Há também uma cópia do protocolo que vamos seguir neste experimento.

Há também uma caixa refrigerada, que contém os dispositivos reais e todos os buffers de funcionamento que precisam ser refrigerados. Normalmente, os kits são embalados em grupos de 10 ou 20. Quando não estiverem em uso, os kits devem ser refrigerados.

Cada seringa e cada componente do kit é cuidadosamente rotulado e os rótulos correspondem à tabela do protocolo que seguimos. Portanto, não há ambiguidade quanto a qual seringa ou componente do kit deve ser usado nas etapas individuais. Depois de desembalar os dispositivos e colocá-los em um gabinete de segurança biológica, realizaremos o procedimento de isolar os neutrófilos e lisá-los para aplicações genômicas a jusante, porque seremos, porque a economia de vida que obtivermos será usada para isolar ou, ou extrairemos o RNA do lisado celular.

Por isso, queremos ter certeza de que nossa área está limpa, não apenas no sentido estéril, mas também limpa de quaisquer RNAs que estejam presentes normalmente no ambiente. Portanto, é muito importante limpar toda a sua área e seus dispositivos com a solução que destrói os RNAs. Então, normalmente, limpamos todas as nossas ferramentas e nossas superfícies de trabalho com RNA SAP ou RNAs, que você pode obter de vários fabricantes.

O dispositivo veio embalado em uma bolsa de vedação térmica. Cada dispositivo é selado e com código de barras neste código de barras. Você deve, você deve anotar este código de barras se estiver trabalhando com amostras clínicas.

Assim, o dispositivo é aberto, a tampa é retirada e colocada no dispositivo coletor de retenção da bomba. A amostra de sangue que usamos é uma amostra de sangue total. Vamos fluí-lo através da seringa BD padrão de um mil, e isso é rotulado como seringa um.

Normalmente, o que é feito é que a seringa é removida da embalagem e a tampa é cuidadosamente retirada do tubo de sangue. E o que você faz é soltar 700 microlitros ou 0,7 mils de sangue e injetar metade disso ou 350 microlitros em um tubo de 1,5 mil. Obrigado. Dessa forma, seu sangue pode ser transmitido para processamento posterior.

Seu tubo de sangue pode ser transmitido e, no entanto, você ainda tem mais sangue sobrando em caso de falha do dispositivo. Então, agora o que vamos fazer é carregar a seringa que contém sangue nela, nesta agulha, que está conectada a um pedaço de tubo com este dispositivo. Queremos ser muito, com, com o dispositivo de isolamento microfluídico.

Queremos ter muito cuidado para não introduzir bolhas de ar no dispositivo ou no dispositivo ou o dispositivo funcionará mal. Então, normalmente, o que fazemos é pegar a seringa e empurrar o êmbolo para baixo e adicionar o líquido à superfície superior do dispositivo, certificando-nos de que está totalmente preso antes de ejetarmos todo o líquido. Paramos e removemos cuidadosamente o corpo da seringa da agulha e basicamente enchemos a ponta da agulha ou, ou o, o conector de isca da agulha com o tampão restante que está nesta seringa.

Nós descartamos isso. Em seguida, vamos pegar nossa seringa com sangue e inseri-la neste hub de isca. Ter cuidado para não derramar sangue e ter cuidado para não introduzir bolhas de ar.

Ache melhor usar um kemo segurando o corpo da seringa e o tubo para o caso de derramamento de sangue. Uma vez, uma vez que a seringa é conectada ao invólucro do tubo ou à agulha, damos alguns toques fortes para remover quaisquer bolhas de ar, que possam estar no conector. Esta seringa é então carregada na bomba da seringa e, em seguida, é presa com o parafuso de travamento.

A bomba de seringa está ligada e já está predefinida para nossas condições de fluxo. Vamos fluir esse sangue através do dispositivo a 30 microlitros por minuto. Assim que o corpo da seringa for carregado na bomba da seringa, vamos pressionar o botão no braço do êmbolo móvel e deslizá-lo para baixo até que ele toque a parte superior do êmbolo e comece a empurrar o fluido para fora pela ponta dele.

É uma agulha de aço inoxidável com ponta romba. Assim que soubermos que o sistema está preparado, vamos pressionar executar. Para iniciar o fluxo de sangue, você pressiona parar para pará-lo e, em seguida, pega um tubo de centrífuga limpo de 1,5 mil ou tubo de fendor e vamos desconectar com cuidado.

Desconecte apenas um, desconecte a tubulação de uma porta do dispositivo. Assim que este tubo for desconectado, vamos inseri-lo no tubo fendor de 1.5 mil. Vamos pressionar run para iniciar o fluxo sanguíneo novamente.

E quando vemos uma gota de sangue se formar, paramos a bomba e a inserimos na entrada que acabamos de abrir no dispositivo. Vamos pressionar correr para iniciar o fluxo de sangue e vamos definir um cronômetro para cinco minutos. Queremos ter certeza de que o sangue preenche igualmente todas as câmaras e que não há bolhas de ar óbvias no dispositivo.

Se houver bolhas de ar bloqueando o fluxo para qualquer uma das câmaras, você pode pegar uma pinça e passá-la ao longo dos pequenos canais, que levam às câmaras de captura ou aos pequenos canais que saem das câmaras de captura. Este dispositivo está enchendo bem, então, após cinco minutos, você pressiona parar na bomba da seringa para interromper o fluxo de sangue, afrouxa a braçadeira da seringa e a retira do suporte da bomba da seringa. Em seguida, vamos usar a seringa número três, que é carregada com PBS livre de nuclease Vamos usar, basicamente vamos, novamente, garantir que a superfície do dispositivo esteja presa para evitar bolhas de ar, vamos bater na seringa para fazer alguma, certifique-se de que todas as bolhas de ar estejam na parte superior do corpo da seringa.

Afrouxe o braço da bomba de seringa e insira a seringa de três moinhos na bomba. Aperte-o para baixo e empurre o êmbolo para baixo até que ele entre em contato com o êmbolo da seringa. Clicamos em correr e esperamos que o líquido prepare o dispositivo e esperamos que um veja uma gota na ponta da agulha de aço inoxidável.

Quando você vê uma gota se formando, você para a bomba. Vamos tirar o sangue, a ponta de aço inoxidável que tem o sangue. Vamos inserir o buffer de lavagem e pressionar executar.

E vamos deixar isso funcionar por cinco minutos. E você deve limpar e limpar qualquer pequena quantidade de sangue, que pode estar na entrada ou na saída para Após cinco minutos de execução do tampão de lavagem através do dispositivo, o dispositivo deve ser completamente limpo de qualquer sangue e você pode ver que, basicamente, não haverá sangue vermelho no dispositivo, o dispositivo ficará claro. Então, o que vamos fazer é depois dos cinco minutos, vamos impedir que o buffer de lavagem funcione.

E, novamente, vamos tirar a seringa da bomba de seringa. Vamos tampar o tubo de microcentrífuga de 1,5 mil, bem na tubulação de saída flexível. E vamos levantar cuidadosamente o tubo, o tubo da microcentrífuga, puxando o tubo de resíduos para fora do dispositivo.

Vamos jogar isso fora em um recipiente de risco biológico. No kit está uma nova tubulação de saída, que na verdade é feita de Teflon. Tem novamente, uma ponta de aço inoxidável.

Vamos substituir a tubulação de saída antiga por esta nova tubulação de saída. Vamos pegar esse tubo de saída e tentar dobrá-lo em torno de uma espécie de forma de U ou V. E também com o kit está uma coluna trituradora kaya, que corta o DNA e basicamente homogeneíza a vida celular.

Então, vamos abrir a tampa roxa da coluna do triturador e colocar o tubo de saída na coluna do destruidor Kay. Vamos tirar da seringa número dois do kit, que diz, para RLT, vamos usá-la. É uma seringa BD padrão de um mil para seringa com ponta romba de calibre 22, aço inoxidável.

Vamos usar isso para injetar 350 microlitros de RLT padrão da kyogen no dispositivo. Como o dispositivo tem um volume morto de cerca de 50 microlitros, o que queremos fazer é injetar o RLT, mas atrás do RLT, queremos injetar um tampão de ar para liberar esse volume morto do dispositivo na coluna do triturador de chi. Então, a maneira como faremos isso é pegar nossa seringa, puxar, extrair 350 microlitros de ar e, em seguida, seguir por 350 microlitros ou 0,35 mils de RLT e o RLT agora está no fundo da seringa.

Resista à tentação de virar a seringa e injetar o ar. O ar está lá para garantir que coloquemos todo o RLT em nossa coluna trituradora Kay. Vamos retirar a tubulação do tampão de lavagem.

Vamos inserir nossa seringa com o RLT e injetar lentamente o RLT no dispositivo por um período de cerca de 30 segundos, certificando-se de que a tubulação de saída esteja ejetando seus resíduos na coluna do triturador de chi. Assim que o ar começa a ser injetado no dispositivo, você empurra o plumer para baixo e espera que todo o fluido seja liberado na coluna Kay Shredder. Nós ca a coluna trituradora kay e nós giramos em uma fuga de microcentro com uma balança de 15.000 RPM ou RPM máximo em um fusível de microcentro de bancada por dois minutos.

Então, depois de girar a coluna por dois minutos, vamos tirar a amostra dela, que agora está em RLT e vamos colocá-la em um dos frascos criogênicos de tampa roxa fornecidos. Se você estiver trabalhando com uma amostra clínica, experimente esses frascos criogênicos, você o rotulará no início do experimento. Aqui está o lisado no frasco criogênico.

Este frasco criogênico é imediatamente colocado em um freezer AC C de 80 graus negativos e armazenado para envio ou extração posterior de RNA. Portanto, este é um protocolo alternativo para isolamento de neutrófilos. Em vez de lisar as células com tampão RLT, vamos corá-las com uma coloração histológica padrão.

Uma mancha. Então, tiramos o dispositivo selado do saco e o desembrulhamos novamente, anotamos o número do lote no dispositivo e colocamos a placa de Petri. No suporte da placa de Petri.

Vamos pegar a seringa de um milhão de sua seringa número um, vamos carregá-la com 700 microlitros de sangue e injetar metade de 350 microlitros em um tubo DPH final. Vamos deixar isso de lado. Pegue a seringa quatro, que tem o tubo que usaremos para selecionar, injetar o sangue no dispositivo.

Vou segurar a base da agulha da ponta do tubo de maneira química. Retire o corpo da seringa e encha a isca. O adaptador armazenaria em buffer e descartaria essa seringa.

Inseriremos o sangue contendo seringa na agulha usando o lenço químico para coletar qualquer transbordamento. Vamos bater na seringa para remover quaisquer bolhas de ar na conexão entre a agulha e o corpo da seringa. Vamos carregar a seringa na bomba da seringa, vamos preparar o tubo empurrando para baixo o braço móvel da bomba da seringa.

Vamos desconectar a tubulação de uma das saídas do dispositivo, o dispositivo de captura, e colocá-la em um tubo de 1.5 mil. E então começaremos a fluir sangue pressionando a bomba da seringa. Vamos esperar que uma gota de sangue se forme na ponta de aço inoxidável.

Assim que a gota se formar, você pressiona, para, remove o sangue, insere-o no dispositivo e pressiona executar. Agora definimos um cronômetro para cinco minutos. Ok, depois de fluir pelo dispositivo por cinco minutos, pressione parar na bomba da seringa e solte a seringa.

E vamos substituir essa seringa pela seringa de três mil contendo nosso tampão de lavagem, que é apenas um XPBS. Novamente, queremos ter certeza de que a parte superior do dispositivo está presa e, em seguida, removeremos a ponta da agulha contendo sangue ou mais corrida. Comece a preparar o dispositivo.

Vamos formar gotículas, inseri-las no dispositivo e pressionar o gotejamento de qualquer sangue na entrada ou na tubulação de saída e deixaremos isso fluir por cinco minutos após a etapa de lavagem. Novamente, vamos parar a bomba da seringa e remover a seringa do suporte da bomba. Para fazer a sustentação padrão do GIM, primeiro vamos consertar as células e desidratá-las usando 100% de metanol.

Então, temos uma seringa, uma seringa de três mil pré-carregada com metanol. Novamente, vamos preparar a seringa, certificar-se de que o metanol está fluindo, parar a bomba da seringa, inseri-la no dispositivo e pressionar executar. Vamos fixá-los nesta solução de metanol por dois a quatro minutos.

Então, depois de dois a quatro minutos de fixação e metanol, paramos a bomba, liberamos a seringa com metanol e aqui vamos carregar uma seringa, seringa de três mil contendo eem sustain padrão eem sustain de Sigma diluído de um a cinco em água deionizada. Depois de diluir, carregamos na seringa e, no final da seringa, colocamos um filtro de 0,8 mícron para filtrar quaisquer partículas que entrarão, o que acabaria entupindo o dispositivo. A mancha por cinco a 10 minutos.

E então vamos enxaguar com a água de Deion i. Então, depois de cinco a 10 minutos de coloração, vamos parar a bomba da seringa e trocar a seringa pelo tampão de coloração pela seringa que contém água deionizada, basicamente vamos lavar até vermos que a cor azul do SAI foi lavada do dispositivo. Uma vez que o excesso de gim sustain tenha sido enxaguado do dispositivo, paramos a solução de lavagem.

E então o que vamos fazer é remover a seringa de água da entrada. Em seguida, vamos pegar a tubulação de saída do dispositivo. Vamos segurar esse tubo no final com nossas pinças.

Este é um tubo tigon flexível e vamos inseri-lo de volta na entrada do dispositivo. Isso sela o dispositivo e mantém as células hidratadas e sua morfologia intacta. Agora, meu colega de trabalho, Dr. John Hong Chang, mostrará um protocolo alternativo para isolamento de quatro linfócitos positivos para DC, seguido de coloração imunofluorescente diretamente dentro do dispositivo microfluídico.

Então, meu nome é Shong Hong e hoje vou demonstrar a você que a coloração de células em um dispositivo microfluídico nesta fase já pode mostrar como usar um dispositivo de isolamento de imunoafinidade micro flic para isolar especificamente células sanguíneas de sangue total sem precedentes. Para seu propósito, ele quer cortar as células e obter proteína e conteúdo de DNA dessas células isoladas. Bem, para o propósito da minha pesquisa, estou interessado em obter as células e, em seguida, obter a contagem de células, por exemplo, para obter a contagem de células CD quatro do sangue total e usá-la como um indicador para fins de diagnóstico.

Portanto, o dispositivo usado é muito semelhante ao dispositivo de Ken. É feito de câmara reta PDMSA externa. A geometria é ligeiramente diferente, portanto, os parâmetros de operação são ligeiramente diferentes, enquanto em, em geral, o procedimento geral de operação é muito semelhante.

Então, vou pular todas as etapas de captura e enxágue de células e pular diretamente para a etapa de coloração de células nos procedimentos de contagem de células. Então aqui eu tenho um dispositivo que já é metade das células capturadas do sangue total e o dispositivo já está enxaguado com PBS. Então, as células de saída já foram lavadas do dispositivo e eu preparei com antecedência uma mistura de anticorpos que é usada especificamente para rotular as células isoladas no dispositivo.

Portanto, a concentração de anticorpos que usamos aqui foi otimizada para corar as células com intensidade fluorescente muito alta sob microscópio fluorescente. Portanto, o procedimento é bastante simples. Carregamos a seringa cheia com a solução de anticorpos na bomba da seringa e, em seguida, certificamo-nos de que a taxa de fluxo esteja ajustada para os parâmetros corretos de que precisamos.

E então vamos ligar a bomba de seringa, observar o final da tubulação, garantir que a solução já saia para que não haja mais bolhas na tubulação. E então podemos conectar a tubulação ao dispositivo microfluídico que capturamos as células. Então, agora o anticorpo está fluindo para o dispositivo para corar as células que isolamos no, no dispositivo, a taxa de fluxo aqui, estou usando cinco microlitros por minuto, mas dependendo da geometria do dispositivo, pode haver diferentes parâmetros de fluxo que você deseja usar para seu propósito.

E vamos dobrar o fluxo da solução de anticorpos por cinco minutos, o que é suficiente para um volume suficiente para substituir toda a solução dentro do canal micropho. Então, após a injeção de anticorpos, interromperemos o fluxo. Então, flutuamos no anticorpo a cinco microlitros por minuto por cinco minutos para substituir toda a solução dentro do microcanal.

Em seguida, paramos o fluxo e deixamos o dispositivo incubar e em temperatura ambiente por 30 minutos. Portanto, isso deve ser feito no escuro para que o anticorpo não seja extinto enquanto as células, os anticorpos fluorescentes podem ser extintos enquanto as células são incubadas com um anticorpo de coloração. Portanto, após a coloração por geralmente de 15 minutos a 30 minutos, apenas desconectaremos o tubo do dispositivo e substituiremos a seringa de anticorpos por uma seringa tampão para lavar o anticorpo não ligado do dispositivo.

Portanto, a solução de lavagem aqui contém 1% BSA na solução PBS. O BSA é usado para bloquear a não ligação de anticorpos na superfície e faremos a mesma coisa. Então, primeiro ajustamos a taxa de fluxo na bomba de seringa para ter certeza de que é a taxa de fluxo correta que queríamos e, em seguida, iniciamos a bomba de seringa e nos certificamos de que realmente há líquido saindo da tubulação antes de conectá-la ao dispositivo.

O objetivo de fazer isso é que não haja nenhuma bolha restante como sobras na tubulação. Então, quando injetamos, nenhuma bolha entra em nosso dispositivo. Então, basta conectar a tubulação ao dispositivo e deixá-la fluir por mais cinco minutos para substituir toda a lavagem, todo o anticorpo não ligado do dispositivo.

Após a etapa de lavagem, fixaremos as células com 1% de PFA. O objetivo de fazer isso é que o dispositivo possa ser armazenado por algumas semanas até algumas semanas se a imagem puder ser realizada imediatamente. Portanto, o procedimento é bastante simples.

É semelhante ao que fizemos antes. Carregamos a seringa na bomba, ajustamos a vazão para a que queríamos e, em seguida, ligamos a bomba da seringa e conectamos a tubulação ao nosso dispositivo para injetar a solução paraforme IDE, que é o fixador em nosso dispositivo para fixar as células. Mais uma vez, deixamos fluir por cerca de cinco minutos.

Portanto, o PFA substitui todo o buffer do dispositivo para corrigir todas as células do dispositivo. Então, após a etapa de fixação do PFA, basta retirar a seringa PFA e agora o dispositivo está pronto para a geração de imagens. Em alguns casos, as pessoas querem ter uma coloração do núcleo para mostrar a sobreposição com a coloração do marcador da superfície celular.

Então, para esse fim, fará a coloração do núcleo usando DPI no final. Então, basta carregar a seringa DPI ao ligar a bomba da seringa e fluir DPI para o nosso dispositivo. Então, agora o núcleo será corado nessas células para mostrar a localização das células.

E isso, a imagem de coloração DPI pode mais tarde ser sobreposta com a coloração do marcador de superfície para mostrar onde estão as células. Portanto, no final da coloração DPI, precisamos lavar novamente o DPI P da banda L com solução tampão. Então, novamente, estamos usando PBS contendo 1% BSA para lavar o dpi de saída.

E a operação é semelhante ao que fizemos antes. Basta conectar a seringa de buffer em nosso dispositivo e deixaremos o buffer fluir para o dispositivo para lavar o dap não ligado. Então esse é todo o procedimento de coloração de células no dispositivo de microfluido.

E depois de todos os procedimentos de coloração, os dispositivos estão prontos para a geração de imagens. E como fizemos a fixação do PFA, os dispositivos também podem ser armazenados por algumas semanas. Se a imagem não puder ser realizada imediatamente.