Atividades de imagem Odor-Evocados no bulbo olfatório do rato usando reflectância óptica e Sinais de autofluorescência

O objetivo geral deste experimento é mapear as atividades evocadas por odor na superfície do bulbo olfatório de camundongos usando sinais ópticos intrínsecos e sinais autofluorescentes de flavoproteínas ou imagens FAS após anestesiar o camundongo e expor o crânio. O osso acima do bulbo olfatório é afinado. Um retalho ósseo é desenhado usando a ponta de uma lâmina de bisturi e, em seguida, removido, uma câmara é feita de cimento dentário e envolve a superfície exposta do bulbo olfatório.

É preenchido com aros e uma tampa de vidro é colocada em cima desta preparação. Os mapas olfativos são adquiridos sequencialmente no mesmo camundongo usando sinais ópticos intrínsecos e imagens FAS, A imagem de outras atividades evocadas no bulbo olfatório do camundongo usando refletância óptica e sinais autofluorescentes pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre o revestimento especial de ordens no bulbo olfatório. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como duas imagens de glicose doxi ou FMRI, é possibilitar o registro de atividades evocativas de ordem em uma resolução especial de uma única lista de glamour.

Geralmente, os indivíduos novos nesses métodos terão dificuldades no início de seu trabalho porque as habilidades cirúrgicas e instrumentais são lentas para adquirir. A demonstração visual desse método é fundamental para chamar a atenção para as etapas cruciais dos procedimentos cirúrgicos e de imagem. Aperte a pata traseira do mouse para confirmar a anestesia e remova o cabelo do couro cabeludo usando uma tesoura.

Limpe qualquer resíduo de pêlos da pele com compressas de gaze estéreis embebidas em água destilada. Coloque o mouse na estrutura estereotáxica de forma que o focinho fique no mesmo plano da parte de trás da cabeça. Para posicionar o bulbo olfatório horizontalmente, prenda firmemente as barras auriculares e nasais para evitar movimentos.

Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento durante a imagem e, em seguida, desinfete a área do couro cabeludo com Betadine usando uma tesoura estéril. Faça uma incisão na parte de trás da cabeça entre as orelhas, depois corte em ambos os lados em direção à base da orelha e na direção ântero-posterior em direção à testa ao longo das pálpebras. Termine de remover o couro cabeludo cortando a pele do focinho.

Usando a barra do nariz como guia. Posicione o animal sob um microscópio estéreo e use um cotonete embebido em solução salina para destacar suavemente o periósteo na parte superior do crânio. Use uma pinça para remover o tecido restante e raspe a superfície do crânio com um bisturi para garantir uma preparação limpa, a fim de manter a área do bulbo olfatório úmida durante todo o experimento.

Coloque um pedaço de gelatina absorvível, esponja embebida em água destilada no osso acima do bulbo olfatório localizado entre os olhos. Retire a esponja de gelatina e comece raspando suavemente o osso com uma lâmina de bisturi número 10. Mantenha um ângulo constante de 45 graus entre a lâmina e o osso e mova a lâmina das pálpebras para o lado sagital da área do bulbo.

Ter cuidado para não aplicar pressão vertical no osso ou arranhar o osso acima do seio venoso durante o processo de afinamento. Pare a cada cinco minutos e coloque uma esponja de gelatina hidratada sobre o osso para esfriar o preparo. Limpe o crânio com a esponja para remover osso, poeira e limpe a ponta do bisturi periodicamente para mantê-lo limpo e afiado.

Continue até que a camada óssea esponjosa ou trabécula esteja visível. Quando a vasculatura fina do bulbo olfatório estiver visível, pare de coçar o osso e use a ponta de um bisturi número 11 para desenhar uma área retangular e fechar o bulbo olfatório. Mantendo a janela dentro do limite dos seios venosos, continue a arranhar o osso dentro da área retangular.

Seja extremamente cauteloso com a profundidade da ponta do bisturi para evitar tocar na superfície da dura-máter. Para ter uma noção da espessura do osso restante, empurre-o suavemente com a ponta de uma pinça. Se o osso se dobrar sob pressão, passe para a próxima etapa.

Adicione uma gota de soro fisiológico e use a ponta do bisturi orientada horizontalmente para levantar o retalho ósseo. Remova cuidadosamente o retalho usando uma pinça para evitar arrancar o osso restante. Uma vez exposta a superfície do bulbo olfatório, verifique a ausência de sangramento ou vasos sanguíneos. Anastomose.

Limpe a área com uma esponja de gelatina embebida em solução salina. Para manter o bulbo olfatório úmido, aplique cimento dentário de poliacrilato usando uma seringa de calibre 29 para formar um poço no osso ao redor da janela craniana. Coloque uma gota de aros de baixo ponto de fusão sobre a dura-máter e coloque uma lamínula estéril sobre a janela craniana para obter imagens.

Coloque a estrutura estereotáxica sob o microscópio estéreo com a janela craniana centralizada no campo de view foco para trazer os capilares à vista. Mude para luz verde de 580 nanômetros e capture uma imagem de controle anatômico para verificar o estado da preparação durante a imagem. Em seguida, prossiga para capturar os testes de estimulação usando imagens de sinal óptico intrínseco sob iluminação de 630 nanômetros ou imagens de sinal autofluorescente de flavoproteína Sob iluminação de 480 nanômetros, uma sessão de imagem padrão inclui uma linha de base de cinco a 10 segundos em que apenas ar é fornecido, seguido pela estimulação do odor por três a 10 segundos, dependendo da concentração de odor escolhida.

E, finalmente, 70 a 82 segundos de entrega de ar são registrados para recuperação inicial. Aqui, a vasculatura do bulbo olfatório é visualizada através da janela craniana, seguida pelos resultados de um teste de estimulação usando o sinal h como odorante capturado usando imagens iOS e FAS. Usando imagens iOS, a atividade evocada por odor é mostrada como áreas escuras de áreas de absorção ativadas por AL são indicadas pelas setas brancas, e as áreas ativas podem ser vistas em tentativas únicas e múltiplas.

A mudança para a imagem FAS na mesma atividade evocada de OD de camundongo agora é mostrada como áreas brancas de emissão de autofluorescência indicadas pelas setas pretas e também pode ser vista em ensaios únicos e múltiplos em média. Observe que as zonas pretas de absorção vistas usando imagens iOS e as áreas brancas de emissão de autofluorescência vistas usando imagens FAS se sobrepõem. Essa correspondência espacial confirma que as duas técnicas permitem a visualização dos mesmos glomérulos olfatórios: Uma vez que a ordem mestre de imagem evocada por meio de sinais de refletância óptica e autofluorescência pode ser feita em uma hora para cirurgia e algumas horas para aquisição de imagem.

As principais desvantagens do uso desses métodos de imagem óptica são o fato de que eles não podem ser aplicados para visualizar mapas olfativos de uma forma, camundongos em movimento livre. E devido à penetração limitada de fótons nos tecidos biológicos, eles não dão acesso aos glomérulos olfatórios ventrais após seu desenvolvimento no final dos anos noventa, registrando sinais intrínsecos no sistema olfatório. Talvez uma maneira de os pesquisadores no campo da imagem óptica explorarem as características do revestimento especial de od.

Na imagem de autofluorescência de flavoproteína de bulbo olfatório é uma técnica promissora para fornecer novos insights sobre o revestimento especial de DO usando sinais ópticos endógenos.