Metas de identificação de microRNAs humanos com o Sistema de ensaio de luciferase lightswitch usando 3'UTR repórter-Constrói e um microRNA em células aderentes Mimic

O objetivo geral deste procedimento é co-transfectar construtos repórter com um mimético de microRNA para validar alvos preditos de microRNA em sequências humanas de três primas Ts. Isso é realizado primeiramente elaborando um delineamento experimental, incluindo a escolha de uma linhagem celular e a seleção de miméticos de microRNA juntamente com construtos repórter experimentais e controle de três primas UTR Go Clone. As células aderentes são então semeadas aproximadamente 24 horas antes da transfeção. O próximo passo do procedimento é co-transfectar cada construto repórter experimental ou controle de três primas UTR Go Clone com um mimético de microRNA ou um controle não direcionado, seguido por uma incubação de 24 a 48 horas. Como etapa final, o reagente do ensaio de luciferase Light Switch é adicionado diretamente às células e ao cultivo, e o sinal luminiscente é lido em um luminômetro de placa.

Resultados finais podem ser obtidos demonstrando quais UTRs 3' humanos são alvos de um determinado microRNA, por meio da medição da redução do sinal de luciferase com tecnologia de ensaio de repórter. Este método pode auxiliar na resposta de questões fundamentais para pesquisadores de microRNA, pois fornece um ensaio funcional para validar interações previstas entre microRNA e regiões UTR 3' em células vivas. O planejamento experimental começa com a seleção de uma linhagem celular altamente transfectável e adequada, já que ensaios baseados em mimetizadores de microRNA funcionam melhor em linhagens celulares com baixos níveis endógenos de expressão do microRNA.

Em seguida, selecione o par de mimetizador de microRNA e controle não direcionado; incluir um controle não direcionado é essencial, pois a cotransfecção de um plasmídeo e um oligonucleotídeo de RNA pequeno resulta em um sinal menor do que a transfeção do plasmídeo isoladamente. Depois, selecione os construtos do repórter pré-clonados do tipo UTR 3' Go Clone da coleção em todo o genoma da Switchgear. Acesse o catálogo on-line e clique no botão de busca de UTR.

Após inserir a lista de nomes de genes, símbolos gênicos ou números de acesso, o resultado da busca fornecerá informações sobre o vetor e a sequência, juntamente com o status do inventário. Agora, selecione as construções do repórter controle. Escolha construções controle com regiões ur tridimensionais, improváveis de serem alvo do microRNA escolhido, como urs de genes de manutenção ou fragmentos aleatórios, para controlar os efeitos não específicos da superexpressão de microRNA na saúde celular geral ou no sinal do ensaio.

Considere também o uso de um repórter sintético de alvo de microRNA como controle positivo da atividade do mimetizador em células aderentes de baixa passagem no primeiro dia, para que estejam 80 a 100% confluentes na transfeção realizada 24 horas depois. O uso de células altamente confluentes é essencial para obter bons resultados. Semeie as células em uma placa de cultura de tecidos branca de 96 poços, em um volume total de 100 microlitros.

Em paralelo. Verifique o número apropriado de células em uma placa clara para uma confluência súbita no dia 2, 24 horas após a semeadura celular. Prepare-se para o descongelamento antes da transfeção.

Clone os construtos do repórter e os micro RNAs à temperatura ambiente. Após descongelamento, misture bem e dilua os micro RNAs até uma concentração de trabalho de dois micromolares em água livre de RNAses. O DNA plasmidial é fornecido na concentração de 30 nanogramas por microlitro e não requer diluição adicional. Para preparar a mistura de transfeção, considere que cada combinação de DNA-RNA deve ser transfectada em triplicata; o volume deve ser ajustado conforme o número de ensaios a serem realizados.

Crie a mistura do reagente de transfeção combinando 9,85 microlitros de meio sem soro e 0,15 microlitro de DharmaFECT DUO por transfeção. Deixe a mistura incubando à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, prepare a mistura de DNA-RNA para cada ensaio combinando 3,33 microlitros do construto repórter GoClone com quantidade suficiente de mimetizador de microRNA para atingir a concentração final desejada.

Complete o volume até 10 microlitros com meio sem soro. Em seguida, combine 10 microlitros da mistura do reagente de transfeção com 10 microlitros de cada mistura de D-N-A-R-N-A e misture bem. O volume final é de 20 microlitros para cada ensaio.

Cubra bem e incube por 20 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, adicione 80 microlitros de meio completo sem antibiótico pré-aquecido. O volume total será de 100 microlitros por poço individual no ensaio, resultando em concentrações finais de mimetizadores entre 10 e 15 nanomolares.

Como etapa final, remova cuidadosamente o meio de cada poço das células semeadas e substitua por 100 microlitros da mistura final de transfeção apropriada. Retorne a placa ao incubador e incube por 24 a 48 horas. A maior parte da mistura produzirá resultados significativos dentro de 24 horas.

Um período de incubação de 48 horas resultará em maior variação entre poços no sinal. No dia 3, 24 horas após a transfeção, realize ensaios de luciferase utilizando os reagentes do ensaio de luciferase Light Switch; as células podem ser analisadas imediatamente ou congeladas a -80 graus Celsius e analisadas posteriormente. A inclusão do ciclo de congelamento e descongelamento resultará em maior lise celular e sinal do repórter mais alto. Traga a placa de células transfectadas à temperatura ambiente.

Em seguida, prepare a solução do ensaio de luciferase com interruptor de luz de acordo com as instruções do kit e despeje em um reservatório estéril. Utilize um pipetador multicanal para adicionar 100 microlitros da solução do ensaio de interruptor de luz diretamente a cada amostra. Poço na placa branca de 96 poços, cubra a placa, proteja da luz e incube por 30 minutos à temperatura ambiente após a incubação.

Leia cada poço durante dois segundos em um luminômetro de placa; a redução da atividade do repórter de luciferase do UTR três prime por LE sete A foi medida em células HT 10 80 por co-transfecção de cada construto repórter com um mimetizador de let sete A ou controle não direcionado. Para analisar os resultados, considere o sinal do controle não direcionado como 100% para cada construto.

Calcule a porcentagem de silenciamento dividindo o sinal do mimetizador específico de microRNA pelo sinal do controle não direcionado. Qualquer mimetizador de microRNA pode ter efeitos não específicos sobre a viabilidade celular geral ou sobre o sinal do ensaio; corrija esses efeitos não específicos. Compare o silenciamento observado com um alvo experimental de UTR com o silenciamento observado com um controle de manutenção ou controle aleatório T, conforme mostrado aqui.

O PONC e o arid três B humano três prime urs são alvos dos sinais de microRNA let sete A. Os sinais provenientes de repórteres humanos três prime UTR para os genes PUNC e arid três B são significativamente reduzidos na presença do análogo de microRNA let sete A, enquanto os sinais de URS de sequência aleatória e de genes de referência não são. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar com sucesso uma co-transfecção de análogos de microRNA e construtos repórteres de três prime UTR em células vivas e como ler o sinal no luminômetro para medir a inibição do sinal.