Metas de identificação de microRNAs humanos com o Sistema de ensaio de luciferase lightswitch usando 3'UTR repórter-Constrói e um microRNA em células aderentes Mimic

O objetivo geral deste procedimento é cotransfectar construções repórter com um micro RNA imitador para validar alvos de micro RNA previstos em três Ts primos humanos. O próximo passo do procedimento é cotransfectar cada construção experimental ou controle de três repórteres de clone UTR go primário com um micro RNA imitador ou não-alvo e controle, seguido por uma incubação de 24 a 48 horas. Como etapa final, o reagente de ensaio de luciferase do interruptor de luz é adicionado diretamente às células e à cultura e o sinal de cheiro Lumin é lido em um luminômetro de placa.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram quais três urs principais humanos são alvos de um determinado micro RNA por meio da medição do knockdown do sinal de luciferase com tecnologia de ensaio repórter. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave para pesquisadores de micro RNA porque fornece um ensaio funcional para validar as três principais interações de alvos UTR de micro RNA previstas em células vivas. O projeto experimental começa com a seleção de uma linha celular de alta aderência apropriada e altamente transfectada Os ensaios baseados em micro RNA funcionam melhor em linhas celulares com baixos níveis de expressão endógena do micro RNA.

Em seguida, selecione o par de controle micro RNA e não-alvo, incluindo um controle não-alvo é crítico, pois a transsecção de um plasmídeo e um pequeno oligo de RNA leva a um sinal mais baixo do que a transsecção do plasmídeo sozinha. Em seguida, selecione o pré-clone de três construções principais do repórter UTR Go Clone da coleção de todo o genoma do switchgears. Vá para o catálogo online e clique no botão de pesquisa UTR.

Depois de inserir a lista de nomes de genes, símbolos de genes ou números de acesso, o resultado da pesquisa fornecerá informações de vetor e sequência junto com o status do inventário. Agora selecione as construções do repórter de controle. Escolha construções de controle com três primos ur, improváveis de serem alvo do micro RNA escolhido, como limpeza, urs ou fragmentos aleatórios para controlar os efeitos não específicos da superexpressão de micro RNA na saúde geral da célula ou no sinal do ensaio.

Considere também o uso de um repórter de alvo de micro RNA sintético como um controle positivo para imitar a atividade nas células de baixa adesão de passagem de sementes no primeiro dia, para que sejam 80 a 100% confluentes para transfecção 24 horas depois. A utilização de células altamente confluentes é fundamental para obter bons resultados. Semeie as células em uma placa branca de cultura de tecidos de 96 poços em 100 microlitros de volume total.

Em paralelo. Veja o número apropriado de células em uma placa transparente para uma confluência repentina No dia 2 24 horas após o assentamento da célula. Prepare-se para o descongelamento da transfecção.

Vá clonar construções repórter e micro RNAs à temperatura ambiente. Uma vez descongelados, bem misturados, diluir os micro RNAs a uma concentração de trabalho de dois micromolares em RNAs, o DNA plasmático de goone de água livre é entregue a 30 nanogramas por microlitro e não requer diluição adicional. Para preparar a mistura de transfecção, considere que cada combinação D-N-A-R-N-A deve ser transfectada em triplicado volume deve ser dimensionado para levar em conta o número de ensaios que estão sendo realizados.

Crie a mistura de reagentes de transfecção combinando 9,85 microlitros de meio livre de soro e 0,15 microlitros de DUO de efeito Dharma por transfecção. Deixe a mistura incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, crie a mistura D-N-A-R-N-A para cada ensaio, combinando 3,33 microlitros da construção repórter do clone go com micro RNA suficiente para atingir a concentração final desejada.

Traga o volume para 10 microlitros com meio livre de soro. Em seguida, combine 10 microlitros da mistura de reagentes de transfecção com 10 microlitros de cada mistura D-N-A-R-N-A e misture bem. Há um volume final de 20 microlitros para cada ensaio.

Cubra bem e incube por 20 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, adicione 80 microlitros de pré-aquecido sem antibióticos. Meios completos para um volume total de 100 microlitros por poço individual são ensaios, resultando em concentrações finais entre 10 e 15 nanomolares.

Como etapa final, remova cuidadosamente o meio de cada poço de células semeadas e substitua por 100 microlitros da mistura de transfecção final apropriada. Retorne a placa para a incubadora e incube por 24 a 48 horas. A maior parte da mistura produzirá resultados significativos em 24 horas.

Um período de incubação de 48 horas resultará em maior variação de sinal de poço a poço No dia 3, 24 horas após a transfecção, conduza ensaios de luciferase usando interruptor de luz, as células de reagentes de ensaio de luciferase podem ser analisadas imediatamente ou congeladas a menos 80 graus Celsius e analisadas posteriormente. Adicionar o ciclo de congelamento e descongelamento resultará em lise celular aprimorada e sinal repórter mais alto. Leve a placa de células transfectadas à temperatura ambiente.

Em seguida, prepare a solução de ensaio de luciferase do interruptor de luz de acordo com as instruções do kit e despeje em um reservatório estéril. Use um pipetador multicanal para adicionar 100 microlitros de solução de ensaio de interruptor de luz diretamente a cada amostra. Bem, na placa branca de 96 poços, cubra a placa, proteja da luz e incube por 30 minutos em temperatura ambiente após a incubação.

Leia cada poço por dois segundos em uma placa Luminômetro o knockdown de três principais UTR Luciferase repórter atividade por LE sete A foi medido em HT 10 80 células por berço. Cruzando cada construção repórter com um controle de imitação ou não-alvo let seven A para analisar os resultados. Considere o sinal do controle não-alvo como 100% para cada construção.

Calcule o knockdown percentual dividindo o sinal do micro RNA específico imitado pelo sinal de controle não-alvo. Qualquer micro mimetização de RNA pode ter efeitos não específicos na viabilidade celular geral ou no sinal do ensaio para corrigir quaisquer efeitos não específicos. Compare o knockdown observado com um alvo UTR experimental com o knockdown observado com manutenção ou controle aleatório T, conforme mostrado aqui.

O PONC e os três áridos três humanos B são alvos dos sinais de micro RNA let seven A de três repórteres UTR principais humanos para o PUNC e os três genes B áridos são significativamente derrubados na presença do mimetizador de micro RNA let seven A. Enquanto os sinais para limpeza e sequência aleatória URS não são. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar um berço bem-sucedido, transfecção de imitadores de microRNA e três construções de repórter UTR principais em células vivas e ler o sinal no luminômetro para medir o bloqueio do sinal.