Name: Metas de identificação de microRNAs humanos com o Sistema de ensaio de luciferase lightswitch usando 3UTR repórter-Constrói e um microRNA em células aderentes Mimic (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Aprenda a validar alvos de microRNAs humanos usando o sistema LightSwitch com construtos repórter 3'UTR e mimics em células aderentes. Este método funcional mede o knockdown da sinalização de luciferase para confirmar interações miRNA-UTR em células vivas.

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Introdução MicroRNAs surgiram como importantes reguladores da expressão de genes que modulam a atividade de muitos processos biológicos importantes. Com mais de 700 miRNAs humanos identificados até agora 1, não é surpreendente que as mutações e regulação inadequada de miRNAs têm sido associados a uma variedade de desordens fisiológicas, tais como câncer e doenças cardíacas 2,3. Estudos recentes têm mostrado que a maioria dos miRNA reguladoras locais de ligação são encontrados em 3'UTRs 4,5, e alguns pesquisadores estimam que há centenas de alvos por miRNA na célula 6. Dada a importância biológica dos miRNAs, o grande número de miRNAs que existem e do grande número de alvos para cada um deles, é fundamental que os pesquisadores são capazes de identificar com segurança as metas endógena de miRNAs, preferencialmente em plataformas passíveis de high-throughput estudos. Enquanto utiliza ferramentas computacionais como miRBase, TargetScan e PicTar 1,6,7 é uma maneira poderosa para gerar listas de alvos para qualquer mRNA putativo miRNA, as previsões ainda não são precisas o suficiente para ser invocada, por si só 8. Portanto, os pesquisadores também aproveitar uma série de abordagens experimentais para identificar alvos de novo ou para validar as metas previstas. Muitas equipes têm contado com alto rendimento medidas de níveis de steady-state mRNA ou da proteína para identificar genes de expressão que muda quando a atividade miRNA é perturbado 4,9,10. Tais mudanças são, sem dúvida, biologicamente significativos e representam um primeiro passo importante, no entanto medir mudanças na expressão geral não faz distinção entre os efeitos direto de um miRNA em uma transcrição e indiretos ou a jusante efeitos de sinalização. Outras ferramentas poderosas que fornecem evidência direta de miRNA-mRNA interações são cromatina-imunoprecipitação (CHIP) estratégias que as proteínas cross-link Argonaute (e, portanto, o complexo RISC) para miRNAs e mRNAs, apesar de identificar os parceiros interagindo não indicar imediatamente os efeitos funcionais de tal evento uma ligação 5,11. Assim, 3'UTR repórter-ensaios que fornecer provas funcionais para efeito de miRNA sobre uma UTR particular, se tornaram um componente importante de um estudo minucioso miRNA. Esses dados baseados em células de ensaio em conjunto com as previsões alvo computacional ou expressão e de dados de proteômica fornece fortes evidências de que um 3'UTR particular é regulada diretamente pelos miRNA de interesse. Em um ensaio 3'UTR-repórter, a 3'UTR de um gene de interesse é fundida ao final de um gene repórter luciferase. Se o 3'UTR é um alvo de um miRNA, a estabilidade transcrição repórter e / ou a sua eficiência tradução vai mudar com a variação na concentração de miRNA funcional. Portanto, ao contrário transcrição somente ensaios com base, ensaios repórter ajudar a identificar os efeitos de ambos os mRNA estado estacionário e os níveis de proteína. Sistemas de repórter também pode ser usado para estudar os efeitos funcionais do mutagenizing um site putativo miRNA obrigatório em um 3'UTR para confirmar que é realmente necessário para o interaction8. E, embora estudos de grande escala utilizando matrizes de expressão, técnicas de proteômica e ChIP Argonaute fornecer valiosas do genoma de dados para um pequeno número de condições experimentais, ensaios baseados em células repórter são os mais propícios para a ampliação para o estudo de miRNA-3 ' interações UTR em centenas ou milhares de condições que possam ser necessários para high-throughput screening de moléculas pequenas ou outra biblioteca baseada efetores. Muitos cientistas têm tecnologia aplicada ensaio repórter para o estudo de miRNA 3'UTR interações. No entanto, com a idéia de que cada miRNAs muitas centenas alvo de transcrições diferentes, tem sido difícil para os pesquisadores a utilizar esta poderosa abordagem em uma escala de alto rendimento, porque a clonagem, validação, otimização e passos para a criação de milhares de diferentes 3'UTR- vetores repórter são muitas vezes um custo proibitivo. Em um esforço para fazer de pequeno e grande escala 3'UTR repórter estudos acessível a qualquer pesquisador, criamos uma coleção de todo o genoma de 3'UTRs humana pré-clonados no altamente otimizado sistema de análise lightswitch luciferase. O sistema também inclui repórter vetores de controlo validados, um conjunto de mais de 700 construções sintéticas miRNA-alvo repórter para uso como controles positivos, e uma série de protocolos experimentais padronizados. Usando o protocolo a seguir, você pode perguntar se uma 3'UTR humana particular é um alvo do seu miRNA de interesse. Os passos críticos neste fluxo de trabalho são de design experimental, transfecção de construções de repórter e imita miRNA, ensaios repórter luciferase, e análise de dados. Para o projeto experimental, é importante selecionar cuidadosamente uma linha celular transfectable, constrói repórter experimental e controle, e imita miRNA e não-alvo controla. Comuns altamente transfectable adhlinhagens de células erent como HT1080, HepG2, HCT-116, Hela, 293, e outros muitas vezes trabalham bem com esse protocolo. Notas importantes sobre design experimental O Sistema lightswitch ensaio de luciferase é um sistema totalmente otimizado repórter que inclui construções GoClone utilizando o gene RenSP luciferase e Reagentes Assay lightswitch luciferase. Use todos os componentes do Sistema lightswitch como recomendado para obter os resultados do ensaio ótimo repórter. Co-transfecção de qualquer oligos / plasmídeos com construções repórter Painéis GoClone reduz geral sinais luciferase de forma não-específicas. Portanto, é importante realizar as combinações de transfecção seguinte: único repórter repórter, + não-alvo miRNA controle, e repórter + miRNA específico. Nosso vetor empty_3UTR (promotor forte, não UTR) fornece um nível muito alto de sinal luciferase e serve como um controle positivo para a eficiência de transfecção e um sintético miRNA vector repórter alvo pode servir como um controle positivo para imitar a atividade. Além disso, recomendamos o uso do GoClone controles limpeza 3'UTR e controles aleatórios para separar com precisão seqüência específica contra efeitos não-específicos. Estudar o seu protocolo e sempre que possível tornar mestre mistura para diminuir a variabilidade em seus dados devido a erro de pipetagem ou evaporação. Este protocolo utiliza reagentes de transfecção DharmaFect Duo (Dharmacon). 1 dia DICA IMPORTANTE: Escolha a sua linha de celulares com sabedoria. Para melhores resultados, use uma linha de células que é conhecido por ser transfectable. Temos também descobriu que a resposta mensurável de um repórter UTR 3 'a um miRNA imitar é atenuada em linhagens de células com altos níveis endógenos de que miRNA particular. Se você não sabe o quanto miRNA sua linha de celulares expressa, tente alvo SGG do microRNA sintético que mede indiretamente a abundância de um miRNA em particular em uma célula, bem como informá-lo quanto à faixa dinâmica de seu ensaio. 1. Células de semente para produzir confluência ≥ 80% no momento da transfecção. <ol><li> Células de semente em uma placa de 96 poços TC branco no volume total 100μl. </li><li> Nas sementes, em paralelo o número adequado de células em um prato claro de 96 poços para avaliar a confluência. </li></ol> DICA IMPORTANTE 1: Confluence é fundamental para atingir bons resultados em um experimento de imitar. Para knockdown ideal, as células devem ser 100% confluente no momento da transfecção. DICA IMPORTANTE 2: Usar células passagem baixo para melhores resultados. Células que foram várias passagens muitas vezes tendem a produzir dados transfecção ruidosos. Dia 2 Prepare constrói GoClonereporter miRNAs e, em seguida, transfecção nas células confluentes. 2. Prepare Constrói <ol><li> Descongelar constrói GoClone (DNA plasmídeo) em temperatura ambiente. Misture bem. </li><li> Centrífuga para remover a condensação da tampa. </li></ol> 3. Prepare RNAs Micro <ol><li> MicroRNAs Thaw (imita específicas e não-alvo controles) em temperatura ambiente e centrifugar para remover a condensação das tampas. </li><li> Diluída para uma concentração de trabalho de 2 M em água livre de RNase. </li></ol> Além de um miRNA experimental imitar sempre incluir um controle de miRNA não-alvo. Co-transfecting um plasmídeo e um pequeno RNA oligo leva a um menor sinal de que o plasmídeo transfecting sozinho. Incluir um ou mais controlos positivos. Considere usar uma das centenas de vetores sintéticos miRNA-alvo repórter no catálogo da SGG. Incluir um ou mais controles negativos ou não-específicas. SGG tem uma gama de controles, incluindo UTRs 3 'de genes housekeeping, fragmentos aleatórios e / ou o controle (sem inserir UTR) vazio. O uso de um ou mais desses controles ao lado de uma construção experimental permitirá que você normalize para todos os efeitos não-específicos atribuíveis à superexpressão de sua miRNA específico ou o controle não-alvo. 4. Prepare Transfections <ol><li> Para cada transfecção combinar os seguintes reagentes para um único ensaio: </li></ol> Mistura 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Repórter GoClone individuais: </td><td> 3,33 mL </td></tr><tr><td> microRNA: </td><td> Varia * </td></tr><tr><td> Sem soro de mídia: </td><td> a 10 mL </td></tr></tbody></table> * Concentração efetiva miRNA pode variar de 10 nM-100 nM. Consulte o fabricante miRNA para a concentração adequada. DICA IMPORTANTE: Não adicione muito imitar. Uma gama razoável para imitar concentrações é 10-50 nM na reação final 100uL. Realizar pelo menos três réplicastransfections te para cada tratamento / combinação UTR e incluem volume adicional para permitir a pipetagem erro. Por exemplo, multiplicar o volume de reação única de 3,5 para obter mix transfecção suficiente para três poços transfecção replicar incluindo extra para pipetagem de erro ou a evaporação. Para cada repórter, configurar repetições para o seguinte: o repórter só repórter, + não-direcionamento e controle de miRNA repórter + miRNA específico. Configurar transfections para o microRNA visando ao mesmo tempo, como os de um controle não-alvo. <ol start="2"><li> Compõem o DUO DharmaFECT mistura (Dharmacon) como segue para cada transfecção: </li></ol> Mistura de 2 <table border="1"><tbody><tr><td> DharmaFect Duo: </td><td> 0,15 mL </td></tr><tr><td> Soro de mídia livre: </td><td> 9,85 mL </td></tr></tbody></table> A quantidade de DharmaFECT Duo a ser adicionada pode ser linha celular dependente. Os montantes acima indicados são apropriados para HT1080 células. Consulte a documentação do fabricante para determinar a quantidade adequada para a sua linha de celular. Dica: Faça uma mistura de transfecção grandes multiplicando os volumes acima pelo número de repórteres, o número de repetições e do número de miRNAs a ser testado. Ao calcular a quantidade de mistura de transfecção de preparar, não se esqueça de incluir uma pequena quantidade extra para contabilizar os erros de pipetagem e evaporação. <ol start="3"><li> Deixe a mistura Duo DharmaFECT para incubar em temperatura ambiente por 5 minutos. </li><li> Após 5 minutos, adicionar 10μL da mistura Duo DharmaFECT (Mistura 2) a cada tubo preparada de 10uL plasmídeo e / ou miRNA (Mistura 1). Cada tubo deve então conter um volume de 20μL por transfecção replicar. </li><li> Incubar cada mistura por 20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Após 20 minutos, adicionar 80 mL do pré-aquecido (37 ° C), livre de antibióticos, a mídia completa por repetição a cada tubo para um total de 100μL por transfecção replicar. Um bloco de poços profundos pode ser usado para a preparação de muitas repetições e amostras simultaneamente. Misturar a solução pipetando cima e para baixo. </li><li> Remova a placa semeada da incubadora. Verificar que as células são pelo menos 80% confluentes. </li><li> Cuidadosamente pipeta fora da mídia de cada poço. </li><li> Adicionar 100μL da mistura de transfecção (20uL DNA / reagente mix + 80uL media) a cada poço. </li><li> Colocar a placa na incubadora durante a noite. </li></ol> Não excesso de incubar. Mais imita irá produzir resultados significativos em bona fide alvos dentro de 24 horas. O nível de repressão mensuráveis ​​em 48 horas pode ser maior, mas assim que o bem a variabilidade bem. Mimic experimentos são mais fáceis do que as experiências inibidor. Enquanto a maioria imita significativamente reprimir os verdadeiros alvos dentro de 24 horas, significativas de repressão atribuíveis ao inibidor pode demorar 48 horas para ser mensuráveis ​​e será quase sempre menos pronunciada do que o efeito da mímica. Dia 3 Nota: ensaios de luciferase podem ser realizados imediatamente, ou as placas podem ser congeladas a -80 ° C (congelamento geralmente aumenta a lise celular e sinal luciferase). Congelar e descongelar as suas células antes assaying para melhores resultados. LEMBRE-SE para deixar descongelar células congeladas à temperatura ambiente antes de adicionar lightswitch Reagente de Ensaio. 5. Atividade medida luciferase com lightswitch AssayReagents <ol><li> Retire a placa da incubadora e trazer à temperatura ambiente. </li><li> Prepare os reagentes do ensaio lightswitch (para kit LS010, protocolos de tamanhos kit outras podem ser encontradas on-line): <ol><li> Substrato reconstituir 100X adicionando 100μL de substrato de solvente para tubo de ensaio de substrato liofilizado. Proteger da luz e minimizar o tempo em temperatura ambiente. Substrato 100X podem ser armazenadas a-20C por 2-3 semanas. Para melhores resultados, use substrato acaba de ser reconstituído. </li><li> Preparar a solução de Ensaio pelo descongelamento frasco 10ml de Tampão de Ensaio em sala de banho de água de temperatura e adicionar 100μL de substrato 100X reconstituído antes da utilização. Misture bem. </li></ol></li><li> Use uma pipeta multi-canal para adicionar 100μL da solução de Ensaio lightswitch (buffer + substrato) diretamente para cada poço de amostra (contendo 100uL células + media) em uma placa branca de 96 poços. Se as células foram cultivadas em outra placa ou formato de frasco, as amostras de transferência para uma placa branca de 96 poços em volume total 100μL (mídia ou PBS). </li><li> Placa de cobertura, proteger da luz, e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. Assaying Se mais de uma chapa, cambaleiam adição da solução de ensaio, para que cada placa incuba por 30 minutos antes da leitura. </li><li> Leia cada poço por 2 segundos em uma placa luminometer (SpectraMax L ou equivalente). </li><li> Calcular o knockdown, calculando relação sinal luciferase para cada construção de miRNA específicas sobre o controle não-alvo (luminescência = miRNA específico / não-alvo de controle). Use os dados do serviço de limpeza, aleatório, e constrói vazia para controlar para não-UTR efeitos do tratamento específico. </li></ol> Resultados representante 3'UTR alvos na presença de um miRNA visando mostrar knockdown luciferase. O knockdown da 3'UTR-luciferase atividade repórter por deixá-7a foi medida em células HT1080 por co-transfecting 100ng de cada repórter construir com 20nm controle imitam ou não de metas de let-7, incubando durante 24 horas, depois de ler o repórter luminescentes sinal usando os reagentes do ensaio lightswitch luciferase. <img src="/files/ftp_upload/3343/3343fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Punção e ARID3B 3'UTRs humanos são alvos do microRNA let-7. Sinais dos repórteres 3'UTR humanos para a punção e genes ARID3B são significativamente derrubado na presença do microRNA let-7 imitar enquanto os sinais de limpeza e seqüência aleatória UTRs não são.

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</ol>

Os autores são funcionários da Genomics Switchgear que fazem as ferramentas e os reagentes que aparecem neste artigo. Produção deste artigo foi patrocinado pela Genomics manobra.

Nós criamos uma coleção de todo o genoma de pré-humano clonado 3&#39;UTR-repórter constrói a permitir estudos de miRNA 3&#39;UTR interações em células vivas. Aqui nós temos mostrado um método reprodutível e de alto rendimento para mimetiza co-transfecting miRNA com 3&#39;UTR-repórteres usando um sistema de repórter luciferase. Este método baseia-se pesquisadores usando uma linhagem de células altamente transfectable e perturbando a atividade de miRNA com uma técnica super-expressão. Pesquisadores que usam linhagens de células mal-transfectable pode considerar o uso de nosso companheiro coleção 3&#39;UTR repórter-lentiviral criado em conjunto com Sigma (Missão 3&#39;UTR Lenti GoClones). Tratar as células com miRNA imita resultados em um experimento superexpressão do tipo, e com qualquer desses estudos, os pesquisadores devem ter em conta que este pode ou não representar reais condições fisiológicas. Para responder às preocupações superexpressão, os pesquisadores podem usar inibidores da miRNA além imita o estudo da interacção com dois tipos diferentes de perturbação 12-14. Uma vez que as metas miRNA prováveis ​​são identificados, os pesquisadores podem querer induz mutações os sites putativo miRNA vinculação para determinar se os sites são necessárias para a interação funcional. Eles podem também querer escalar até centenas de diferentes testes UTRs alvo potencial (Boutz). Além disso, se os pesquisadores estão interessados ​​se a miRNA está afetando a estabilidade transcrição ou tradução de eficiência, os dados repórter luciferase pode ser comparado às medidas de níveis de steady-state transcrição. Qualquer alteração no sinal de luciferase que não está associada a uma mudança proporcional nos níveis de transcrição irá apontar para um efeito sobre a eficiência da tradução. Finalmente, os pesquisadores podem usar vetores repórter criar uma curva dose-resposta para comparar a sensibilidade relativa de UTRs diferentes para mudanças na concentração de miRNA 14.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Vendedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Placas de tecido branco Cultura (de 96 poços fundo sólido) </td><td> VWR </td><td> 82050-736 </td></tr><tr><td> Placas de tecido claro Cultura (96 poços) com tampa </td><td> VWR </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> Lightswitch Reagente ensaio de luciferase </td><td> Painéis </td><td> LS010 </td></tr><tr><td> DharmaFECT Reagente Transfection Duo (0.75mL) </td><td> Dharmacon </td><td> T-2010-02 </td></tr><tr><td> Folha de fita de vedação Placa </td><td> E &amp; K Scientific </td><td> T592100 </td></tr><tr><td> A fita de vedação respirável Placa </td><td> E &amp; K Scientific </td><td> T896100-S </td></tr><tr><td> Luminômetro placa </td><td> Os dispositivos moleculares </td><td> SpectraMax L </td></tr></tbody></table>

metas de identificação de micrornas humanos com o sistema de ensaio de luciferase lightswitch usando 3&#39;utr repórter-constrói e um microrna em células aderentes mimic

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) são importantes reguladores da expressão gênica e desempenhar um papel em muitos processos biológicos. Mais de 700 miRNAs humanos foram identificados até o momento com cada um tendo até centenas de mRNAs alvo único. Ferramentas computacionais, ensaios de expressão e proteômica, e cromatina-imunoprecipitação técnicas baseadas em fornecer pistas importantes para a identificação de mRNAs que são alvos diretos de um miRNA particular. Além disso, 3&#39;UTR repórter-ensaios se tornaram um componente importante de estudos completa miRNA-alvo, pois fornecem evidências funcionais a favor e quantificar os efeitos de determinados miRNA 3&#39;UTR interações em um sistema baseado em células. Permitir aos investigadores mais para alavancar 3&#39;UTR repórter-ensaios e apoiar o scale-up desses ensaios para high-throughput níveis, criamos uma coleção de todo o genoma de repórteres 3&#39;UTR humana luciferase na luciferase lightswitch altamente otimizado Sistema de ensaio. O sistema também inclui sintéticos miRNA constrói alvo repórter para uso como controles positivos, várias construções repórter endógena 3&#39;UTR, e uma série de protocolos padronizados experimental. Aqui nós descrevemos um método para co-transfecção de cada 3&#39;UTR-repórter constrói junto com um miRNA imitar que seja eficiente, reprodutível e passível de análise de alto rendimento.

MicroRNAs (miRNAs) são importantes reguladores da expressão gênica e foram mostrados a desempenhar um papel em inúmeros processos biológicos. Para entender melhor miRNA-UTR interações, criamos uma coleção de todo o genoma de três repórteres UTR luciferase emparelhado com um novo gene luciferase e reagentes de ensaio, o sistema de interruptor.

Metas de identificação de microRNAs humanos com o Sistema de ensaio de luciferase lightswitch usando 3&#39;UTR repórter-Constrói e um microRNA em células aderentes Mimic

Os microRNAs (miRNAs) são reguladores importantes da expressão gênica e desempenham um papel em muitos processos biológicos. Mais de 700 miRNAs humanos foram...

O objetivo geral deste procedimento é co-transfectar construtos repórter com um mimético de microRNA para validar alvos preditos de microRNA em sequências humanas de três primas Ts. Isso é realizado primeiramente elaborando um delineamento experimental, incluindo a escolha de uma linhagem celular e a seleção de miméticos de microRNA juntamente com construtos repórter experimentais e controle de três primas UTR Go Clone. As células aderentes são então semeadas aproximadamente 24 horas antes da transfeção. O próximo passo do procedimento é co-transfectar cada construto repórter experimental ou controle de três primas UTR Go Clone com um mimético de microRNA ou um controle não direcionado, seguido por uma incubação de 24 a 48 horas. Como etapa final, o reagente do ensaio de luciferase Light Switch é adicionado diretamente às células e ao cultivo, e o sinal luminiscente é lido em um luminômetro de placa.Resultados finais podem ser obtidos demonstrando quais UTRs 3' humanos são alvos de um determinado microRNA, por meio da medição da redução do sinal de luciferase com tecnologia de ensaio de repórter. Este método pode auxiliar na resposta de questões fundamentais para pesquisadores de microRNA, pois fornece um ensaio funcional para validar interações previstas entre microRNA e regiões UTR 3' em células vivas. O planejamento experimental começa com a seleção de uma linhagem celular altamente transfectável e adequada, já que ensaios baseados em mimetizadores de microRNA funcionam melhor em linhagens celulares com baixos níveis endógenos de expressão do microRNA.Em seguida, selecione o par de mimetizador de microRNA e controle não direcionado; incluir um controle não direcionado é essencial, pois a cotransfecção de um plasmídeo e um oligonucleotídeo de RNA pequeno resulta em um sinal menor do que a transfeção do plasmídeo isoladamente. Depois, selecione os construtos do repórter pré-clonados do tipo UTR 3' Go Clone da coleção em todo o genoma da Switchgear. Acesse o catálogo on-line e clique no botão de busca de UTR.Após inserir a lista de nomes de genes, símbolos gênicos ou números de acesso, o resultado da busca fornecerá informações sobre o vetor e a sequência, juntamente com o status do inventário. Agora, selecione as construções do repórter controle. Escolha construções controle com regiões ur tridimensionais, improváveis de serem alvo do microRNA escolhido, como urs de genes de manutenção ou fragmentos aleatórios, para controlar os efeitos não específicos da superexpressão de microRNA na saúde celular geral ou no sinal do ensaio.Considere também o uso de um repórter sintético de alvo de microRNA como controle positivo da atividade do mimetizador em células aderentes de baixa passagem no primeiro dia, para que estejam 80 a 100% confluentes na transfeção realizada 24 horas depois. O uso de células altamente confluentes é essencial para obter bons resultados. Semeie as células em uma placa de cultura de tecidos branca de 96 poços, em um volume total de 100 microlitros.Em paralelo. Verifique o número apropriado de células em uma placa clara para uma confluência súbita no dia 2, 24 horas após a semeadura celular. Prepare-se para o descongelamento antes da transfeção.Clone os construtos do repórter e os micro RNAs à temperatura ambiente. Após descongelamento, misture bem e dilua os micro RNAs até uma concentração de trabalho de dois micromolares em água livre de RNAses. O DNA plasmidial é fornecido na concentração de 30 nanogramas por microlitro e não requer diluição adicional. Para preparar a mistura de transfeção, considere que cada combinação de DNA-RNA deve ser transfectada em triplicata; o volume deve ser ajustado conforme o número de ensaios a serem realizados.Crie a mistura do reagente de transfeção combinando 9,85 microlitros de meio sem soro e 0,15 microlitro de DharmaFECT DUO por transfeção. Deixe a mistura incubando à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, prepare a mistura de DNA-RNA para cada ensaio combinando 3,33 microlitros do construto repórter GoClone com quantidade suficiente de mimetizador de microRNA para atingir a concentração final desejada.Complete o volume até 10 microlitros com meio sem soro. Em seguida, combine 10 microlitros da mistura do reagente de transfeção com 10 microlitros de cada mistura de D-N-A-R-N-A e misture bem. O volume final é de 20 microlitros para cada ensaio.Cubra bem e incube por 20 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, adicione 80 microlitros de meio completo sem antibiótico pré-aquecido. O volume total será de 100 microlitros por poço individual no ensaio, resultando em concentrações finais de mimetizadores entre 10 e 15 nanomolares.Como etapa final, remova cuidadosamente o meio de cada poço das células semeadas e substitua por 100 microlitros da mistura final de transfeção apropriada. Retorne a placa ao incubador e incube por 24 a 48 horas. A maior parte da mistura produzirá resultados significativos dentro de 24 horas.Um período de incubação de 48 horas resultará em maior variação entre poços no sinal. No dia 3, 24 horas após a transfeção, realize ensaios de luciferase utilizando os reagentes do ensaio de luciferase Light Switch; as células podem ser analisadas imediatamente ou congeladas a -80 graus Celsius e analisadas posteriormente. A inclusão do ciclo de congelamento e descongelamento resultará em maior lise celular e sinal do repórter mais alto. Traga a placa de células transfectadas à temperatura ambiente.Em seguida, prepare a solução do ensaio de luciferase com interruptor de luz de acordo com as instruções do kit e despeje em um reservatório estéril. Utilize um pipetador multicanal para adicionar 100 microlitros da solução do ensaio de interruptor de luz diretamente a cada amostra. Poço na placa branca de 96 poços, cubra a placa, proteja da luz e incube por 30 minutos à temperatura ambiente após a incubação.Leia cada poço durante dois segundos em um luminômetro de placa; a redução da atividade do repórter de luciferase do UTR três prime por LE sete A foi medida em células HT 10 80 por co-transfecção de cada construto repórter com um mimetizador de let sete A ou controle não direcionado. Para analisar os resultados, considere o sinal do controle não direcionado como 100% para cada construto.Calcule a porcentagem de silenciamento dividindo o sinal do mimetizador específico de microRNA pelo sinal do controle não direcionado. Qualquer mimetizador de microRNA pode ter efeitos não específicos sobre a viabilidade celular geral ou sobre o sinal do ensaio; corrija esses efeitos não específicos. Compare o silenciamento observado com um alvo experimental de UTR com o silenciamento observado com um controle de manutenção ou controle aleatório T, conforme mostrado aqui.O PONC e o arid três B humano três prime urs são alvos dos sinais de microRNA let sete A. Os sinais provenientes de repórteres humanos três prime UTR para os genes PUNC e arid três B são significativamente reduzidos na presença do análogo de microRNA let sete A, enquanto os sinais de URS de sequência aleatória e de genes de referência não são. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar com sucesso uma co-transfecção de análogos de microRNA e construtos repórteres de três prime UTR em células vivas e como ler o sinal no luminômetro para medir a inibição do sinal.

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