Name: Protocolos para inoculação vaginal e coleta de amostra no Modelo Experimental de Rato Candida Vaginite (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprenda técnicas de inoculação vaginal e lavagem para quantificar carga fúngica de Candida em camundongos tratados com estrogênio. Este método permite coletar células vaginais e linfonodos para ensaios imunológicos e histológicos.

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Este trabalho foi financiado pelo R01 AI32556 (NIAID, National Institute of Health). Este trabalho também foi apoiado em parte pela Louisiana Vaccine Center e Louisiana do Sul Instituto de Pesquisas de Doenças Infecciosas patrocinado pelo Conselho de Regentes Louisiana.

1. Inoculação vaginal com Candida albicans <ol><li> Três dias antes da inoculação, enquanto prender o animal para expor o abdomen, injetar 100 ml de óleo de gergelim contendo 0,1-0,5 mg de β-estradiol por via subcutânea na parte inferior do abdômen. Antecedência a agulha cerca de 5 a 10 mm lateral à pele para minimizar a perda no local da injeção. A administração subcutânea de estrogênio no abdômen inferior é ideal neste modelo devido à proximidade com o trato genital. Doses eficazes podem variar de acordo com linhagens de camundongos, idades ou derivados de estrógeno. Em estudos anteriores usando CBA-J (H-2 κ), C3H/HeN (H-2 κ), C57BL / 6 (H-2 b), Balb / c (H-2 d), DBA / 2 (H- 2 d), SJL (H-2 s) ratos em 6-8 semanas de idade, 0,1 mL mg/100 foi encontrado eficaz evidenciado pelo espessamento da parede vaginal, diminuição do muco vaginal eaumento da descamação das células epiteliais. Camundongos tratados com estrógeno acima nesta concentração exibem a colonização vaginal consistentes com Candida. Para inoculação em camundongos, de outras cepas e idades, um estudo piloto é recomendado para garantir a eficácia do estrogênio nas condições modificadas e aumentar a dose de estrogênio, se necessário. A solução de estrogênio deve ser preparado de cada vez no dia da injeção. Para garantir a solubilidade total de estrogênio no óleo de gergelim, misturar a solução com um vortex e calor de forma intermitente a 37 ° C. Repetir a injecção semanal durante todo o período do estudo. </li><li> Para preparar o inóculo, adicione um loopful de C. albicans blastoconidia de uma preparação subcultura recentes Sabouraud-dextrose agar (SDA) em 10 ml de caldo de Phytone-peptona suplementado com glicose 0,1%. Incubar a cultura caldo de fase estacionária por 18 horas a 25 ° C em banho-maria a tremer. </li><li> Após a incubação, recolher ªe cultura caldo em um tubo cônico de 15 ml e centrifugar a 800 xg por 5 min. Lave o pellet duas vezes com PBS estéril. </li><li> Enumerar blastoconidia viável em um hemocitômetro por exclusão corante azul de tripano. Ajustar a concentração celular de 2,5 x 10 6 ml / (ou a uma concentração de inóculo desejado) em PBS estéril. </li><li> Para estabilizar o mouse, mantenha a base da cauda com dois dedos e levante o quadril para cima de modo que a abertura vaginal faces em sua direção (Figura 1A). O ideal é que o rato é colocado sobre uma superfície plana ralado (por exemplo, topo de gaiola) para que o mouse pode proporcionar resistência contra a restrição da cauda. </li><li> Pipetar 20 mL (ou um volume desejado para não exceder 20 l) da suspensão de inóculo, inserindo a ponta da pipeta cerca de 5 mm de profundidade para dentro do lúmen vaginal (Figura 1B). Concluir esta etapa mais rápida e suavemente possível para minimizar o sofrimento do mouse. </li></ol> 2. Lavagens vaginais <ol><li> Eutanásia seguinte (ou anestesia), ho velho rato para baixo pela base da cauda com dois dedos de modo que a abertura vaginal fica exposta. </li><li> A lavagem do lúmen vaginal através da introdução de 100 ul de PBS estéril com aspiração repetida e agitação com uma ponteira. A ponta da pipeta pode ficar entupido com as células. Se isso ocorrer, dispensar as células e continuar obstruindo lavaging com PBS restante na vagina. Recolher o lavado em um tubo de microcentrífuga. </li><li> Em alternativa, lavagem vaginal pode ser realizado em ratos anestesiados com anestesia inalatória de isoflurano. Para isso, expor os ratos para vaporizado isoflurano até que estejam completamente sedados (~ 30 seg.). Segure os ratos para baixo pela base da cauda e gentilmente lavagem do lúmen vaginal utilizando 50 mL de PBS estéril. Certifique-se evitar a agitação dura com uma ponteira para minimizar o trauma da vagina durante este procedimento. Camundongos sedado deve se recuperar da anestesia dentro de 30 segundos de exposição ao ar ambiente. Isofluranopode ser vaporizado utilizando um vaporizador de isoflurano e O 2 (preferencial) ou um sistema de queda norma fechada câmara de anestésico sem que o sistema vaporizador (requer acompanhamento de perto do animal, enquanto sedado para evitar problemas respiratórios). Lavagens vaginais em ratos anestesiados deve ser o método de escolha para amostras de lavagem longitudinal sobre os ratos mesmo. Lavaging consecutivas não influencia a avaliação da carga de fungos ao longo do tempo 41. </li><li> Para wet-mount preparações, a transferência de 10 ml do lavado numa lâmina de vidro e observar com ampliação de 1000x 400 por microscopia de luz. Além disso, as frações celulares do lavado pode ser manchado para examinar células e morfologias nuclear. Para as preparações de esfregaço, de transferência de 10 ml do lavado numa lâmina de vidro e gentilmente se espalhar usando a parede exterior de uma ponta da pipeta. Preservar as amostras de esfregaço com fixador CytoPrep e mancha pela técnica de Papanicolaou padrão (exame de Papanicolaou). Observe a 400 × ampliação por microscopia de luz. </li></ol> 3. Quantificação da carga fúngica vaginal <ol><li> Em uma placa de 96 poços de fundo redondo, transferir o lavado em um poço da linha superior e 180 mL de PBS estéril nas seguintes 5 poços dessa coluna (para baixo da placa). </li><li> Faça 01:10 diluições em série de lavado vaginal, transferindo a 20 mL do fluido para o bem próxima na coluna. Misturar bem por aspiração repetida antes de cada transferência. Diluições em série de até 12 amostras de lavagem (uma linha horizontal completa) podem ser realizadas simultaneamente, utilizando uma pipeta de 12 canais. </li><li> Começando com a menor diluição, transferir 10 ml da amostra em Sabouraud-dextrose agar (SDA). Chapeamento de até 36 amostras podem ser realizadas em uma placa usando SDA preparada em pratos de petri com grade quadrada e uma pipeta multicanal ajustável espaçamento. </li><li> Enumerar unidades formadoras de colônia (UFC), após incubação a 34 ° C fou 48 h. </li></ol> 4. Extração de tecido vaginal <ol><li> Seguindo o procedimento vaginal lavagem, coloque o mouse sacrificados em suas costas e saturar a área da virilha com etanol 70%. Usando um par de fórceps, levante o orifício urinário para cima de modo que a abertura vaginal fica exposta. </li><li> Inserir um par de fórceps curvado para dentro do lúmen vaginal e localizar o colo do útero. Mantendo uma pegada firme com o fórceps, extrair o colo do útero através da cavidade vaginal (Figura 2A-C). </li><li> Vagina da Excise na base da abertura vaginal e, em seguida, remover o colo da vagina com uma tesoura cirúrgica. Tenha em mente que o tecido vaginal é involuído (interior epitélio lado da vagina é exposta para fora). O tecido pode ser invertida lateralmente para manter a orientação original da vagina ou aberto em uma folha, fazendo uma incisão lateral. Excisadas tecidos vaginais pode ser usado para: 1) colagem após a extração de linfócitosnase digestão (~ 1 × 10 4 mouse /) 40, 2) das células epiteliais isolamento digestão dispase seguinte (~ 5 do mouse × 10 4 /) 28, 3) preparações congeladas ou parafina para análise histológica 25. </li></ol> 5. Excisão do nó de linfa lombar <ol><li> Seguindo o procedimento vaginal lavagem, coloque o mouse sacrificados em suas costas e saturar o abdômen com etanol 70%. Faça uma incisão lateral a partir da parte inferior do abdome para o tórax e expor os órgãos internos. Usando um par de fórceps em ambas as mãos, mover os intestinos para cima de modo que os vasos sanguíneos centrais tornam-se visíveis. </li><li> Localizar a veia cava inferior e aorta abdominal. Normalmente, um par de gânglios linfáticos lombares podem ser identificadas adjacentes à aorta abdominal, localizado a meio caminho entre a origem das artérias ilíacas comuns renal e 39. Estes gânglios linfáticos podem ser visualmente diferenciado de tecido adiposo pela textura elásticae são mais leves e mais opaca na cor em relação ao tecido gorduroso (Figura 3). Estes linfonodos são visivelmente maior nos animais infectados em comparação com animais não inoculadas. </li><li> Especiais de consumo os gânglios linfáticos, colocando micropinças sob o nó e, em seguida, puxar para cima com cuidado para separar tecido circundante. </li></ol> 6. Isolamento de células linfóides em uma única célula suspensões <ol><li> Transferência dos gânglios linfáticos em uma tela de arame de malha estéril (aproximadamente 3 x 3 cm 2 de tamanho) colocado dentro de um prato de vidro estéril petri contendo ~ 10 ml de solução de Hanks salina balanceada (HBSS) (Figura 4). </li><li> Com a placa de Petri ligeiramente inclinado, pressione os linfonodos contra a tela com uma cabeça de êmbolo da seringa. Certifique-se de quebrar todos os linfonodos para que o conteúdo celular de nós passar pela tela enquanto os componentes não-celulares dos gânglios (ou seja, membranas, estroma, tecido adiposo) permanecem na tela. </li><li> Usando o êmbolo e seringa mesmo, aspirado tele HBSS contendo células. Lavar a tela com HBSS ~ 5 ml e recolher o líquido restante em um tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugar a 800 xg por 10 min. Aspirar qualquer depósitos de gordura na parte superior do líquido com uma pipeta antes de descartar o líquido. Lave o pellet celular três vezes com HBSS. Ressuspender o sedimento em 1 ml de HBSS e enumerar células viáveis ​​por exclusão corante azul de tripano. </li></ol> 7. Resultados representativos: As frações celulares do lavado vaginal de&gt; 4 dias de camundongos inoculados tipicamente consistem de Candida, células epiteliais e infiltração celular (Figura 5). Por wet-mount microscopia, Candida podem ser identificados visualmente pela presença de hifas, bem como levedura (Figura 5A). Preparados esfregaços de lavado vaginal pode ser manchado pela técnica de Papanicolaou para examinar células epiteliais e leucócitos infiltrantes, das quais as principais células são neutrófilos identificado pelo tri-nuclelobos ar (Figura 5B). Neutrófilos muito poucos, se houver, são detectados em ratos não inoculadas (Figura 5C) 41. Um exemplo de carga fúngica vaginal é mostrado na Figura 6. Lavado vaginal coletadas em momentos específicos são cultivadas por CFU enumeração (Figura 6A). Colonização vaginal / infecção por Candida persiste por semanas em estrogênio tratados com camundongos inoculados (Figura 6B), enquanto Candida não consegue estabelecer a colonização vaginal não-tratadas com estrogênio camundongos inoculados (Figura 6C). Camundongos tratados com estrógeno não inoculadas permanecem negativos para Candida ao longo do tempo (dados não mostrados). Além disso, lavagens vaginais pode ser realizada uma única vez em ratos separados em cada momento ou longitudinalmente em camundongos mesmo sob anestesia. Os linfonodos lombares são os principais linfonodos de drenagem do trato genital e do site mais relevante para avaliar a resposta imune sistêmica a um desafio vaginal. Note que esses nódulos linfáticos podem tornar-se ampliado em camundongos inoculados, enquanto eles normalmente aparecem muito pequenas não inoculado em camundongos. Leucócitos recuperações celular normalmente variam de 8 × 10 do mouse 5 / não inoculadas a 5 × 10 do mouse 6 / inoculados. Além de gânglios linfáticos lombares, linfonodos inguinais, poplíteos e mesentérica também pode ser usado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig1.jpg"> Figura 1. Inoculação vaginal com Candida. A) Um rato restringido para inoculação. O rato é colocado em uma gaiola de arame e inserção realizada pela base da cauda, ​​ligeiramente para cima para levantar as pernas e expor a abertura vaginal. O quadril do mouse pode ser estabilizado com a mesma mão ao tentar resistir à contenção da cauda. B) Introdução do inóculo para o lúmen vaginal. A ponteira é gentilmente inserido cerca de 5 mm de profundidade para dentro do lúmen vaginal. O inóculo de suspensão é então depositado. Figura 2. Extração de tecido vaginal. AB Extraction) do colo do útero. O colo do útero está localizado com uma pinça curva e exposto para fora através da cavidade vaginal. Uma vez fora da cavidade vaginal, o colo do útero é ainda mais puxado para fora, para expor completamente a vagina. C) Extração da vagina. A vagina é retirado da vulva com uma tesoura. Uma vez desligada, remova o colo da vagina. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig3.jpg"> Figura 3. Identificação dos linfonodos lombares. A localização dos gânglios linfáticos lombares entre os órgãos circunvizinhos / vasos sanguíneos nas imediações da pelve é indicado. A aorta abdominal. B, bexiga urinária. C, artéria ilíaca comum. I, intestinos. L, o fígado. R, reto. S, baço. U, Útero. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig4.jpg"> Figura 4. Os linfonodos lombares colocado em uma tela de malha de arame. Os linfonodos são agrupados na tela colocada numa placa de Petri com HBSS. Os linfonodos são pressionados contra a tela com um êmbolo da seringa para obter células linfóides em uma única célula suspensões. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig5.jpg"> Figura 5. Frações celulares do lavado vaginal de camundongos inoculados. Preparações A) Wet-mount e B) colpocitológico vaginal amostras coletadas lavagem quatro dias após a inoculação e C) de ratos não inoculadas. Imagens são mostradas em 1000 × (A) ou 400 × (B, C) de ampliação. A inserção na B mostra a morfologia nuclear de neutrófilos vaginal em 1000 ×. Candida levedura (Y) e hifas (H), células epiteliais (CE) e neutrohils (N) são indicados. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig6.jpg"> Figura 6. Detectíon de carga fúngica vaginal. A) colônias Representante C. albicans cultivadas em uma placa de SDA. Amostras puras (N) lavagem de seis diferentes camundongos inoculados (linha superior) foram diluídas em série e cultivadas para a enumeração UFC. B) Quantificação da carga fúngica vaginal de estrogênio-tratados e C) não-estrogênio camundongos tratados. Ufc/100 mL do lavado de camundongos inoculados foi avaliada em pontos de tempo indicado.

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<li>Redondo-Lopez, V., Cook, R. N., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+Lactobacilli+in+the+control+and+maintenance+of+the+vaginal+bacterial+microflora%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Emerging role of Lactobacilli in the control and maintenance of the vaginal bacterial microflora.</a> Rev Infect Dis. 12 (5), 856-856 (1990).</li>
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<li>Taylor, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+virulence+of+Candida+albicans+isolates+causing+mucosal+infections+in+people+infected+with+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">In vivo virulence of Candida albicans isolates causing mucosal infections in people infected with the human immunodeficiency virus.</a> J. Infect. Dis. 182, 955-955 (2000).</li>
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<li>Wormley, F. L., Chaiban, J., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+and+lymphocyte+activation+marker+expression+during+experimental+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule and lymphocyte activation marker expression during experimental vaginal candidiasis.</a> J. Immunol. Methods. 69, 5072-5072 (2001).</li>
<li>Yano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell-derived+S100+calcium-binding+proteins+as+key+mediators+in+the+hallmark+acute+neutrophil+response+during+Candida+vaginitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis.</a> Infect. Immun. 78 (12), 5126-5126 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Um modelo experimental do rato de Candida vaginite foi estabelecida e usada historicamente para as últimas décadas para estudar a resposta do hospedeiro mucosa a Candida, bem como para testar terapias antifúngicas 3,4,11,13,16,17,19,21,24, 25,37. Os protocolos aqui apresentados incorporam métodos eficientes e menos trabalhoso, e parecem ser um dos sistemas de modelo mais otimizada de Candida vaginite descritas até o momento. Estas técnicas permitem a quantificação rápida da carga fú...

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Feminino camundongos CBA / J </td><td> Charles River Laboratories </td><td> 01C38 </td><td> 5-6 semanas de idade </td></tr><tr><td> Candida albicans (3153A) </td><td> Colecção Nacional de fungos patogênicos, UK </td><td> NCPF3153 </td><td></td></tr><tr><td> Óleo de gergelim </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3547 </td><td> Não precisa ser pré-esterilizadas antes do uso </td></tr><tr><td> Β-estradiol 17-valerato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E1631 </td><td> 0.1-0.5mg em óleo de gergelim </td></tr><tr><td> Phytone peptona </td><td> Becton Dickinson </td><td> 211906 </td><td> Suplemento com glicose 0,1% </td></tr><tr><td> Solução de azul de Trypan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td></td></tr><tr><td> Ágar Sabouraud dextrose </td><td> Becton Dickinson </td><td> 211584 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase tipo IV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5138 </td><td> 0,25% </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Invitrogen </td><td> 17105-041 </td><td> 1,7 U / ml </td></tr><tr><td> Malha de telas de arame </td><td> TWP </td><td> 060X060S0065W36T </td><td> No. 60 mesh, aço inoxidável </td></tr><tr><td> Solução de Hanks salina balanceada </td><td> Invitrogen </td><td> 24020-117 </td><td></td></tr><tr><td> CytoPrep fixador </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-570-10 </td><td> Preserva esfregaço </td></tr><tr><td> Papanicolaou mancha EA-65 </td><td> Merck Química </td><td> 7054X-85 </td><td></td></tr><tr><td> Papanicolaou mancha OG-6 </td><td> Merck Química </td><td> 7052X-85 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxilina de Harris Alum </td><td> Merck Química </td><td> 638A-85 </td><td></td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Baxter Healthcare </td><td> NDC 10019-773-60 </td><td> Usado com vaporizador de isoflurano ou em um sistema fechado queda anestésico câmara </td></tr></table>

protocolos para inoculação vaginal e coleta de amostra no modelo experimental de rato candida vaginite

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Vulvovaginal candidíase (VVC), causada por espécies de Candida, é uma infecção fúngica do trato genital feminino, que afeta aproximadamente 75% das mulheres saudáveis ​​durante seus anos reprodutivos 18,32-34. Os fatores predisponentes incluem uso de antibióticos, diabetes descontrolado e perturbação nos níveis de hormônios reprodutivos devido à gravidez, contraceptivos orais ou terapias de reposição hormonal 33,34. VVC recorrente (RVVC), definida como três ou mais episódios por ano, afeta a 5 separada a 8% das mulheres sem fatores predisponentes 33. Um modelo experimental de rato VVC foi estabelecida e utilizado para estudar a patogênese e resposta do hospedeiro mucosa a Candida 3,4,11,16,17,19,21,25,37. Este modelo também foi empregado para testar potenciais terapias antifúngicas in vivo 13,24. O modelo exige que os animais sejam mantidos em estado de pseudoestrus para optimal Candida colonização / infecção 6,14,23. Sob tais condições, animais inoculados terá carga fúngica vaginal detectável por semanas a meses. Estudos anteriores mostram um paralelo extremamente elevada entre o modelo animal e infecção humana em relação a propriedades imunológicas e fisiológicas 3,16,21. Diferenças, entretanto, incluem a falta de Candida como flora vaginal normal e um pH neutro vaginal nos ratos. Aqui, nós demonstramos uma série de métodos-chave no modelo de mouse que vaginite incluem inoculação vaginal, rápida coleta de amostras vaginal, avaliação da carga fúngica vaginal, e as preparações para a extração do tecido celular / isolamento. Isto é seguido por resultados representativos para constituintes do lavado vaginal, carga fúngica, e drenagem linfática produz leucócitos nó. Com o uso de anestésicos, as amostras de lavagem podem ser coletados em momentos diversos na mesma camundongos para avaliação longitudinal dainfecção / colonização. Além disso, este modelo não necessita de agentes imunossupressores para iniciar a infecção, permitindo estudos imunológicos em condições host definido. Finalmente, o modelo e cada técnica introduzida aqui poderia potencialmente dar origem a utilização das metodologias para examinar outras doenças infecciosas do trato genital feminino (bacterianas, parasitárias, virais) e respectivas defesas do hospedeiro local ou sistêmica.

Principais técnicas a serem utilizados na avaliação de<em&gt; Candida</em&gt; Vaginite em um modelo animal experimental são descritos. Os métodos permite uma recolha rápida de amostras vaginais e linfócitos de linfonodos drenantes lombar. Estas técnicas podem dar origem a modelos de ratos de outras doenças na parte inferior do trato genital feminino.

Protocolos para inoculação vaginal e coleta de amostra no Modelo Experimental de Rato Candida Vaginite

A candidíase vulvovaginal (CVV), causada por espécies de Candida, é uma infecção fúngica do trato genital feminino inferior que afeta aproximadamente 75% de...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar questões específicas relacionadas ao uso do modelo animal experimental de candidíase vaginal como meio para quantificar a carga fúngica vaginal, bem como utilizar células vaginais ou linfoides em ensaios específicos, como ensaios imunológicos e histológicos. Isso será alcançado primeiramente demonstrando a técnica de inoculação vaginal em camundongos tratados com estrogênio. Em seguida, após a eutanásia do camundongo, será realizada uma lavagem vaginal para recuperar o *Candida*.Em seguida, o tecido vaginal e/ou os linfonodos drenantes vaginais serão extraídos. O fluido de lavagem pode ser examinado microscopicamente para mostrar Candida associado a células epiteliais vaginais ou plaqueado em ágar para quantificar a carga fúngica vaginal. Um esfregaço da fração celular também pode ser usado para coloração de células epiteliais e células linfoides.Portanto, a principal vantagem de demonstrar esta técnica é permitir que os usuários do modelo animal de vaginite a realizem da forma mais eficiente e eficaz possível. As principais questões abordadas pela técnica estão na área da vaginite e da ecologia, respondendo perguntas fundamentais como as respostas imunes do hospedeiro, distribuição celular, eficácia de medicamentos, eficácia de imunoterapias, além dos efeitos da imunização e da própria demonstração da técnica. Hoje, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório, Junco Yano, infectará um camundongo com C. albicans três dias após a administração de uma injeção de beta-estradiol.Comece estabilizando o camundongo sobre uma superfície plana vermelha para que ele possa segurar-se. Em seguida, segure a base da cauda com dois dedos e levante o quadril para cima, de modo que a abertura vaginal fique voltada para você. Insira a ponteira da pipeta cerca de cinco milímetros de profundidade na luz vaginal e pipete até 20 microlitros da suspensão do inóculo.Realize esta etapa o mais rapidamente e suavemente possível para minimizar o estresse no camundongo. Após o período de incubação desejado, eutanazie o animal de acordo com o protocolo da sua instalação. Em seguida, com dois dedos, segure o camundongo voltado para baixo pela base da cauda, de modo que a abertura vaginal fique exposta com uma pipeta.Introduza 100 microlitros de PBS estéril na luz vaginal e, com aspirações e agitações repetidas, realize a lavagem. Se a ponta da pipeta ficar obstruída por células, despreze as células que estão causando a obstrução e continue a lavagem com o PBS restante. Colete o fluido de lavagem em um tubo de microcentrífuga.Após o procedimento de lavagem vaginal, posicione o camundongo em decúbito dorsal e umedecer a região inguinal com etanol 70%. Usando uma pinça, levante o orifício urinário para cima, de modo que a abertura vaginal fique exposta. Insira um par de pinças curvas na luz vaginal e localize o colo do útero, mantendo um bom aperto com as pinças.Extraia o colo do útero através da cavidade vaginal, excise a vagina na base da abertura vaginal e, em seguida, remova o colo do útero da vagina com tesoura cirúrgica. Como o tecido vaginal é involuído, inverta-o para manter a orientação original ou abra-o em forma de lâmina fazendo uma incisão lateral para a excisão do linfonodo lombar com o animal em decúbito dorsal. Sature o abdômen com etanol 70%.Realize uma incisão lateral começando do abdômen inferior até o tórax e exponha os órgãos internos usando uma pinça em cada mão. Desloque os intestinos para cima de modo que os vasos sanguíneos centrais fiquem visíveis. Localize a veia cava inferior e a aorta abdominal.Um par de linfonodos lombares pode ser identificado adjacente à aorta abdominal, localizado aproximadamente na metade da distância entre a origem das artérias renais e ilíacas comuns. Esses linfonodos podem ser diferenciados visualmente do tecido adiposo por sua textura elástica e apresentam cor mais clara e opaca em comparação com o tecido adiposo. Eles também são notavelmente maiores em animais infectados do que em animais não inoculados.Os animais tiveram os linfonodos removidos cirurgicamente ao posicionar pinças microcirúrgicas sob o linfonodo e, em seguida, puxar suavemente para cima, separando-os do tecido circundante. Após a remoção do tecido, transfira os linfonodos para uma tela estéril de arame colocada dentro de uma placa de Petri de vidro estéril contendo cerca de 10 mililitros de solução salina balanceada de Hank. Para isolar as células linfoides, consulte o protocolo escrito.As frações celulares do fluido de lavagem vaginal de camundongos inoculados pelo menos quatro dias antes geralmente consistem em células epiteliais de candida e infiltrados celulares, conforme mostrado aqui por microscopia a fresco. A Candida pode ser identificada pela presença de hifas e também de levedura. Aqui, esfregaços do fluido de lavagem vaginal são corados.Utilizando a técnica de esfregaço de Papanicolaou para examinar células epiteliais e leucócitos infiltrantes, cujas células principais são neutrófilos, identificáveis pelos lobos nucleares trilobados. Muito poucos neutrófilos, se houver, são detectados em camundongos não inoculados. Esta figura mostra um exemplo da carga fúngica vaginal.O fluido de lavagem vaginal é coletado em pontos temporais específicos e cultivado para a enumeração de UFC. Neste exemplo, o fluido foi coletado no quinto dia após a inoculação, diluído em série, plaqueado e incubado por 48 horas. As colônias são então contadas e a carga fúngica vaginal é calculada. A colonização ou infecção vaginal por Candida persiste por semanas em camundongos inoculados tratados com estrogênio.Embora a candida não consiga estabelecer colonização vaginal em camundongos inoculados não tratados com estrogênio, camundongos não inoculados tratados com estrogênio permanecem negativos para candida durante todo o período. Além disso, lavagens vaginais podem ser realizadas uma única vez em camundongos diferentes em cada ponto temporal ou longitudinalmente nos mesmos camundongos sob anestesia. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de restringir adequadamente os animais para evitar traumas na vagina, e reserve o tempo necessário para realizar a lavagem completamente, a fim de obter uma carga fúngica vaginal precisa ao extrair os tecidos vaginais.Utilize PBS estéril para evitar que eles sequem, e tenha cuidado para não danificar veias e artérias principais ao remover os linfonodos e, durante o processamento das células dos linfonodos, mantenha-os sobre gelo ou a quatro graus para preservar a viabilidade celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o modelo experimental de camundongo de candidíase vaginal para quantificar de forma reprodutível a carga fúngica vaginal e ressecar tecidos vaginais ou linfoides para ensaios imunológicos ou histológicos específicos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Morrill, S. R., et al. Modelos de colonização vaginal murina por bactérias cultivadas anaeróbicas. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra um protocolo para modelar a colonização vaginal em camundongos usando bactérias anaeróbicas resistentes a antibióticos. Começa com o tratamento hormonal para aumentar a suscetibilidade epitelial, seguido pela inoculação vaginal e co-inoculação em condições anaeróbicas. O procedimento termina com amostragem pós-inoculação e cultura para avaliar a...

Modelagem da colonização vaginal murina por bactérias anaeróbias

Fonte: O'Brien, V.P. et al. Infecção urinária recorrente de Escherichia coli desencadeada pela exposição à bexiga de Gardnerella vaginalis em camundongos. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra a preparação de um inóculo de Gardnerella vaginalis para estabelecer um modelo murino de infecção urinária recorrente.

Preparação do inóculo de Gardnerella vaginalis para modelar infecções urinárias recorrentes em camundongos

Fonte: Patras, K. A., Doran, K. S. Um modelo murino de colonização vaginal do grupo B por Streptococcus . J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a preparação e inoculação vaginal de uma fêmea de camundongo tratada com hormônios e com Streptococcus do Grupo B para modelar a infecção. Explica como cultivar e preparar as bactérias, administrar o inóculo no lúmen vaginal e garantir o sucesso da infecção.

Estabelecimento de um modelo camundongo para infecção vaginal do grupo B por Streptococcus

Este vídeo demonstra o estabelecimento da infecção uropatogênica por Escherichia coli em uma bexiga de camundongo fêmea por meio de instilação de cateter transuretral. As bactérias injetadas estabelecem com sucesso uma infecção do trato urinário dentro da bexiga, fornecendo uma plataforma valiosa para estudar doenças associadas à saúde relacionadas ao trato urinário.

Estabelecimento de um Modelo de Infecção do Trato Urinário em Camundongos Fêmeas

Este vídeo demonstra o desenvolvimento de um modelo de camundongo in vivo para estudar a formação de biofilme de Candida albicans no tecido subcutâneo. O experimento envolve a implantação de dispositivos infectados com Candida na região posterior do animal para o desenvolvimento de biofilme.

Candida albicans Formação de biofilme em um modelo de camundongo in vivo

Embora os modelos de infecção por Candida estejam disponíveis para estudar a resistência imunológica do hospedeiro, um modelo para estudar a imunopatologia mediada por células T no contexto da infecção por Candida está ausente. Aqui descrevemos um método para estabelecer a imunopatologia Th17 associada à infecção oral por Candida em camundongos imunodeficientes.

Th17 Inflamação Modelo de orofaringe Candidíase em imunodeficientes Mice

O objectivo deste protocolo é imitar grupo humano B Streptococcus (GBS) colonização vaginal num modelo murino. Este método pode ser utilizado para investigar as respostas imunes do hospedeiro e factores que contribuem para GBS bacterianas persistência vaginal, bem como para testar estratégias terapêuticas.

Um modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonização Vaginal

Aqui, apresentamos um método eficaz e eficiente para injeções de veias da cauda de roedores usando um dispositivo de aquecimento/contenção exclusivamente projetado. Ao simplificar o início dos processos de vasodilatação e contenção, este protocolo permite injeções intravenosas precisas e oportunas de grandes grupos de animais com o mínimo de angústia.

Um dispositivo de aquecimento/contenção contemporâneo para injeções eficientes de veia de cauda em um modelo de sepse fúngica murina

O protocolo apresenta um modelo de rato de colonização vaginal com bactérias vaginais humanas cultivadas anaerobicamente. Nós nos concentramos em Gardnerella vaginalis, enquanto incluímos sugestões para Prevotella bivia e Fusobacterium nucleatum. Este protocolo também pode ser usado como um guia para inoculações vaginais e recuperação viável de outras bactérias cultivadas anaerobicamente.

Modelos de colonização vaginal murina por bactérias cultivadas anaerobicamente

Estabelecemos um modelo murino de infecção relacionada ao cateter (IRC) associada a C.albicans, no qual o biofilme se forma no cateter, e a interação entre C.albicans e hospedeiro correlaciona-se bem com a IRC clínica. Esse modelo ajuda a selecionar terapias para IRC associada ao biofilme de C.albicans , estabelecendo uma base para a transformação clínica.

Modelo de Infecção por Candida albicans Relacionada a Cateter em Camundongos

O parto prematuro (parto &lt; 37 semanas) é um problema de saúde global urgente com opções de prevenção e tratamento abaixo do ideal. Apresentamos um modelo de camundongo de parto prematuro induzido por infecção bacteriana vaginal ascendente e descrevemos como analisar a morbidade e mortalidade neonatal resultante.

Modelagem de infecção vaginal ascendente, parto prematuro e morbidade neonatal em camundongos

Aprenda técnicas de inoculação vaginal e lavagem para quantificar carga fúngica de Candida em camundongos tratados com estrogênio. Este método permite coletar células vaginais e linfonodos para ensaios imunológicos e histológicos.

Protocolos para inoculação vaginal e coleta de amostra no Modelo Experimental de Rato Candida Vaginite

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