Protocolos para inoculação vaginal e coleta de amostra no Modelo Experimental de Rato Candida Vaginite

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar questões específicas relacionadas ao uso do modelo animal experimental de candidíase vaginal como meio para quantificar a carga fúngica vaginal, bem como utilizar células vaginais ou linfoides em ensaios específicos, como ensaios imunológicos e histológicos. Isso será alcançado primeiramente demonstrando a técnica de inoculação vaginal em camundongos tratados com estrogênio. Em seguida, após a eutanásia do camundongo, será realizada uma lavagem vaginal para recuperar o *Candida*.

Em seguida, o tecido vaginal e/ou os linfonodos drenantes vaginais serão extraídos. O fluido de lavagem pode ser examinado microscopicamente para mostrar Candida associado a células epiteliais vaginais ou plaqueado em ágar para quantificar a carga fúngica vaginal. Um esfregaço da fração celular também pode ser usado para coloração de células epiteliais e células linfoides.

Portanto, a principal vantagem de demonstrar esta técnica é permitir que os usuários do modelo animal de vaginite a realizem da forma mais eficiente e eficaz possível. As principais questões abordadas pela técnica estão na área da vaginite e da ecologia, respondendo perguntas fundamentais como as respostas imunes do hospedeiro, distribuição celular, eficácia de medicamentos, eficácia de imunoterapias, além dos efeitos da imunização e da própria demonstração da técnica. Hoje, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório, Junco Yano, infectará um camundongo com C. albicans três dias após a administração de uma injeção de beta-estradiol.

Comece estabilizando o camundongo sobre uma superfície plana vermelha para que ele possa segurar-se. Em seguida, segure a base da cauda com dois dedos e levante o quadril para cima, de modo que a abertura vaginal fique voltada para você. Insira a ponteira da pipeta cerca de cinco milímetros de profundidade na luz vaginal e pipete até 20 microlitros da suspensão do inóculo.

Realize esta etapa o mais rapidamente e suavemente possível para minimizar o estresse no camundongo. Após o período de incubação desejado, eutanazie o animal de acordo com o protocolo da sua instalação. Em seguida, com dois dedos, segure o camundongo voltado para baixo pela base da cauda, de modo que a abertura vaginal fique exposta com uma pipeta.

Introduza 100 microlitros de PBS estéril na luz vaginal e, com aspirações e agitações repetidas, realize a lavagem. Se a ponta da pipeta ficar obstruída por células, despreze as células que estão causando a obstrução e continue a lavagem com o PBS restante. Colete o fluido de lavagem em um tubo de microcentrífuga.

Após o procedimento de lavagem vaginal, posicione o camundongo em decúbito dorsal e umedecer a região inguinal com etanol 70%. Usando uma pinça, levante o orifício urinário para cima, de modo que a abertura vaginal fique exposta. Insira um par de pinças curvas na luz vaginal e localize o colo do útero, mantendo um bom aperto com as pinças.

Extraia o colo do útero através da cavidade vaginal, excise a vagina na base da abertura vaginal e, em seguida, remova o colo do útero da vagina com tesoura cirúrgica. Como o tecido vaginal é involuído, inverta-o para manter a orientação original ou abra-o em forma de lâmina fazendo uma incisão lateral para a excisão do linfonodo lombar com o animal em decúbito dorsal. Sature o abdômen com etanol 70%.

Realize uma incisão lateral começando do abdômen inferior até o tórax e exponha os órgãos internos usando uma pinça em cada mão. Desloque os intestinos para cima de modo que os vasos sanguíneos centrais fiquem visíveis. Localize a veia cava inferior e a aorta abdominal.

Um par de linfonodos lombares pode ser identificado adjacente à aorta abdominal, localizado aproximadamente na metade da distância entre a origem das artérias renais e ilíacas comuns. Esses linfonodos podem ser diferenciados visualmente do tecido adiposo por sua textura elástica e apresentam cor mais clara e opaca em comparação com o tecido adiposo. Eles também são notavelmente maiores em animais infectados do que em animais não inoculados.

Os animais tiveram os linfonodos removidos cirurgicamente ao posicionar pinças microcirúrgicas sob o linfonodo e, em seguida, puxar suavemente para cima, separando-os do tecido circundante. Após a remoção do tecido, transfira os linfonodos para uma tela estéril de arame colocada dentro de uma placa de Petri de vidro estéril contendo cerca de 10 mililitros de solução salina balanceada de Hank. Para isolar as células linfoides, consulte o protocolo escrito.

As frações celulares do fluido de lavagem vaginal de camundongos inoculados pelo menos quatro dias antes geralmente consistem em células epiteliais de candida e infiltrados celulares, conforme mostrado aqui por microscopia a fresco. A Candida pode ser identificada pela presença de hifas e também de levedura. Aqui, esfregaços do fluido de lavagem vaginal são corados.

Utilizando a técnica de esfregaço de Papanicolaou para examinar células epiteliais e leucócitos infiltrantes, cujas células principais são neutrófilos, identificáveis pelos lobos nucleares trilobados. Muito poucos neutrófilos, se houver, são detectados em camundongos não inoculados. Esta figura mostra um exemplo da carga fúngica vaginal.

O fluido de lavagem vaginal é coletado em pontos temporais específicos e cultivado para a enumeração de UFC. Neste exemplo, o fluido foi coletado no quinto dia após a inoculação, diluído em série, plaqueado e incubado por 48 horas. As colônias são então contadas e a carga fúngica vaginal é calculada. A colonização ou infecção vaginal por Candida persiste por semanas em camundongos inoculados tratados com estrogênio.

Embora a candida não consiga estabelecer colonização vaginal em camundongos inoculados não tratados com estrogênio, camundongos não inoculados tratados com estrogênio permanecem negativos para candida durante todo o período. Além disso, lavagens vaginais podem ser realizadas uma única vez em camundongos diferentes em cada ponto temporal ou longitudinalmente nos mesmos camundongos sob anestesia. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de restringir adequadamente os animais para evitar traumas na vagina, e reserve o tempo necessário para realizar a lavagem completamente, a fim de obter uma carga fúngica vaginal precisa ao extrair os tecidos vaginais.

Utilize PBS estéril para evitar que eles sequem, e tenha cuidado para não danificar veias e artérias principais ao remover os linfonodos e, durante o processamento das células dos linfonodos, mantenha-os sobre gelo ou a quatro graus para preservar a viabilidade celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o modelo experimental de camundongo de candidíase vaginal para quantificar de forma reprodutível a carga fúngica vaginal e ressecar tecidos vaginais ou linfoides para ensaios imunológicos ou histológicos específicos.