Protocolos para inoculação vaginal e coleta de amostra no Modelo Experimental de Rato Candida Vaginite
December 8th, 2011
Principais técnicas a serem utilizados na avaliação de Candida Vaginite em um modelo animal experimental são descritos. Os métodos permite uma recolha rápida de amostras vaginais e linfócitos de linfonodos drenantes lombar. Estas técnicas podem dar origem a modelos de ratos de outras doenças na parte inferior do trato genital feminino.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar questões processuais específicas associadas ao uso do modelo animal experimental de candidíase vaginal como meio de quantificar a carga fúngica vaginal e também usar células vaginais ou linfóides em ensaios específicos, como ensaios imunológicos e histológicos. Isso será conseguido demonstrando primeiro a técnica de inoculação vaginal em camundongos tratados com estrogênio. Em seguida, após a eutanásia do camundongo, será realizada uma lavagem vaginal para recuperar a cândida.
Em seguida, o tecido vaginal e/ou os linfonodos de drenagem vaginal serão extraídos. O fluido de lavagem pode ser visualizado microscopicamente para mostrar candidíase associada a células epiteliais vaginais ou plaqueado em ágar para quantificar a carga fúngica vaginal. Um esfregaço da fração celular também pode ser usado para corar células epiteliais e células linfoides.
Portanto, a principal vantagem de demonstrar essa técnica é para que as usuárias do modelo animal de vaginite possam fazê-lo de forma mais eficiente e eficaz. E as principais questões que estão sendo respondidas por meio da técnica estão no campo da vaginite e ecologia e respondem a perguntas-chave, como respostas imunes do hospedeiro, distribuição celular, eficácia dos medicamentos, eficácia imunoterapêutica e também efeitos da imunização e demonstração da técnica. Hoje será um estudante de pós-graduação em meu laboratório, Junco Yano, Para infectar um camundongo com C albicans três dias após a administração de uma injeção de beta estradiol.
Comece estabilizando o mouse em uma superfície plana gRED para que ele se segure. Em seguida, segure a base da cauda com dois dedos e levante o quadril para cima, de modo que a abertura vaginal fique voltada para você. Insira a ponta da pipeta com cerca de cinco milímetros de profundidade no lúmen vaginal e pipete até 20 microlitros da suspensão de inóculo.
Conclua esta etapa o mais rápido e suavemente possível para minimizar o sofrimento no mouse. Após o período de incubação desejado, eutanasiar o animal de acordo com o protocolo de sua instalação. Em seguida, com dois dedos, segure o mouse para baixo pela base da cauda para que a abertura vaginal fique exposta com uma pipeta.
Introduza 100 microlitros de PBS estéril no lúmen vaginal e, com aspiração e agitação repetidas, faça a lavagem. Se a ponta da pipeta ficar entupida com células, dispense as células obstruídas e continue devastando com o PBS restante. Colete o fluido de lavagem em um tubo de microcentrífuga.
Após o procedimento de lavagem vaginal, deite o rato de costas e sature a região da virilha com etanol a 70%. Usando uma pinça, levante o orifício urinário para cima para que a abertura vaginal fique exposta. Insira um par de pinças curvas no lúmen vaginal e localize o colo do útero, mantendo um aperto firme com a pinça.
Extraia o colo do útero através da cavidade vaginal, excise a vagina na base da abertura vaginal e, em seguida, remova o colo do útero da vagina com uma tesoura cirúrgica. Como o tecido vaginal é involuído, inverta-o para manter a orientação original ou abra-o em uma folha fazendo uma incisão lateral para excisão do nódulo lombar com o animal de costas. Sature o abdômen com 70% de etanol.
Faça uma incisão lateral começando da parte inferior do abdômen até o tórax e exponha os órgãos internos usando uma pinça em ambas as mãos. Mova os intestinos para cima para que os vasos sanguíneos centrais se tornem visíveis. Localize a veia cva inferior e a aorta abdominal.
Um par de linfonodos lombares pode ser identificado adjacente à aorta abdominal, localizado a meio caminho entre a origem das artérias renal e ilíaca comum. Esses linfonodos podem ser visualmente distinguidos do tecido adiposo por sua textura elástica e são mais claros e de cor mais opaca em comparação com o tecido adiposo. Eles também são visivelmente maiores em animais infectados em comparação com os não inoculados.
Os animais extirparam os gânglios linfáticos colocando microfórceps sob o nódulo e, em seguida, puxando-os suavemente para separá-los do tecido circundante. Após a excisão do tecido, transfira os gânglios linfáticos para uma tela de arame estéril colocada dentro de uma placa de Petri de vidro estéril contendo cerca de 10 mililitros de solução salina balanceada de Hank. Para isolar células linfóides, consulte o protocolo escrito.
As frações celulares do fluido de lavagem vaginal de camundongos inoculados pelo menos quatro dias antes geralmente consistem em células epiteliais de candida e infiltrados celulares, conforme mostrado aqui por microscopia de montagem úmida. A Candida pode ser identificada pela presença de PHA e levedura. Aqui, as preparações de esfregaço do fluido de lavagem vaginal são coradas.
Utilizando a técnica de Papanicolaou para examinar células epiteliais e leucócitos infiltrantes dos quais as células principais são neutrófilos, como pode ser identificado pelos lobos tracleares. Muito poucos neutrófilos, se houver, são detectados em camundongos não inoculados. Esta figura mostra um exemplo de carga fúngica vaginal.
O fluido de lavagem vaginal é coletado em pontos de tempo específicos e cultivado para enumeração de UFC. Neste exemplo, o fluido foi coletado no quinto dia após a inoculação, em série, diluído e incubado por 48 horas. As colônias são então contadas e a carga fúngica vaginal calculada A colonização vaginal ou infecção por candida persiste por semanas em camundongos inoculados tratados com estrogênio.
Embora a candidíase não estabeleça a colonização vaginal em camundongos inoculados não tratados com estrogênio, os camundongos não inoculados tratados com estrogênio permanecem negativos para cândida durante todo o tempo. Além disso, as lavagens vaginais podem ser realizadas uma vez em camundongos separados em cada ponto de tempo ou longitudinalmente nos mesmos camundongos sob anestesia. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de conter os animais com segurança para evitar traumas na vagina e, por favor, reserve o tempo necessário para lavar completamente para obter uma carga fúngica vaginal precisa ao extrair tecidos vaginais.
Use ainda PBS para evitar que eles desidratem e tome cuidado para não danificar as principais veias e artérias ao remover os gânglios linfáticos e durante o processamento das células dos gânglios linfáticos, mantenha-os no gelo ou a quatro graus para manter a viabilidade celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como empregar o modelo experimental de camundongo de vaginite por candida para quantificar de forma reprodutível a carga fúngica vaginal e extirpar tecidos vaginais ou linfóides para ensaios imunológicos ou histológicos específicos.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Visão Geral
Este artigo descreve técnicas-chave para avaliar a vaginite por Candida usando um modelo animal experimental. Os métodos facilitam a coleta rápida de espécimes vaginais e linfócitos dos linfonodos lombares drenantes, potencialmente levando a modelos de camundongos para outras doenças no trato genital inferior feminino.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Microbiologia
- Imunologia
Fundamentos
- A vaginite por Candida é uma condição comum que afeta o trato genital feminino.
- Compreender a resposta imune é crucial para o desenvolvimento de tratamentos.
- Modelos experimentais ajudam no estudo dos mecanismos da doença.
- A candidíase vaginal pode ser quantificada usando ensaios específicos.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar técnicas processuais para estudar a candidíase vaginal.
- Quantificar a carga fúngica vaginal em um modelo experimental.
- Utilizar células vaginais e linfoides em ensaios imunológicos.
Métodos Utilizados
- Técnica de inoculação vaginal em camundongos tratados com estrogênio.
- Lavagem vaginal para recuperar Candida após a eutanásia do camundongo.
- Extração de tecido vaginal e linfonodos drenantes.
- Exame microscópico e semeadura do fluido de lavagem em ágar.
Principais Resultados
- Recuperação bem-sucedida de Candida a partir da lavagem vaginal.
- Quantificação da carga fúngica usando semeadura em ágar.
- Identificação de células epiteliais e linfoides através de coloração.
- Demonstração da viabilidade do modelo para estudos futuros.
Conclusões
- As técnicas descritas fornecem um método robusto para estudar a candidíase vaginal.
- Este modelo pode ser adaptado para outras doenças no trato genital inferior feminino.
- Pesquisas futuras podem se basear nesses achados para explorar respostas imunológicas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
The experimental mouse model of Candida vaginitis provides a robust platform for quantifying vaginal fungal burden and evaluating host immune responses in a controlled, disease-relevant system. This model enables reproducible assessment of infection dynamics and immunological endpoints, supporting early discovery and mechanistic de-risking for antifungal and immunotherapeutic candidates. Its translational alignment with human infection properties enhances predictive confidence for preclinical portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of host-pathogen interactions and immune response mechanisms in a physiologically relevant context.
- Supports functional target validation by quantifying infection and immune cell infiltration without immunosuppression confounders.
- Facilitates mechanistic de-risking for antifungal and immunomodulatory strategies.
Screening & Assay Development
- Provides standardized protocols for inoculation, sample collection, and fungal burden quantification.
- Delivers reproducible, quantitative outputs such as CFU enumeration and immune cell profiling.
- Enables longitudinal sampling from the same animal, supporting robust assay development and screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with human infection immunology, enhancing translational relevance for candidate evaluation.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling immunological and histological endpoint analysis.
- Permits risk-adjusted advancement of antifungal and immunotherapeutic leads based on quantitative infection and immune readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, target validation, and quantitative assessment of infection and immune responses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven studies of host-pathogen interactions and immune mechanisms.
- Screening: Provides validated, reproducible assays for fungal burden and immune cell quantification.
- Analytics: Generates quantitative outputs (CFU counts, cell profiles) for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Offers continuity for immunological and infection endpoints relevant to human disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating diverse infectious and immunological hypotheses in the lower female genital tract.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in antifungal and immunological research.
- Operational Value: Standardizes infection and sampling protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust preclinical data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic candidates targeting mucosal infections.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, infection models, and immunological assays.
- Needs access to instrumentation for sample collection, microscopy, and quantitative plating.
- Demands cross-team standardization of protocols for reproducibility across studies.
- Adaptable to other infectious disease models of the lower female genital tract with protocol modifications.
- Careful handling and sample processing are critical to maintain cell viability and data integrity.
