Detecção de interações proteína na planta através de um gateway de Complementação de fluorescência Compatível Bimolecular (BiFC) Sistema
16 de setembro de 2011
Nós desenvolvemos uma técnica para testar interações proteína-proteína na planta. A proteína fluorescente amarela (YFP) é dividido em dois fragmentos não-sobrepostas. Cada fragmento é clonado em-frame de um gene de interesse através do sistema Gateway, permitindo a expressão de proteínas de fusão. Reconstituição do sinal YFP só ocorre quando as proteínas interagem inquérito.
Para testar a interação entre duas proteínas, os dois genes de interesse precisam ser clonados em nosso BF e vetores usando a técnica de desejo de gateway. Essas construções são transformadas em aerium GV 3 1 0 1. As culturas bacterianas GV 3 1 0 1 contendo para construir serão misturadas e co-infiltradas nas folhas.
Se as duas proteínas candidatas interagirem entre si, o sinal YFP pode ser observado usando o resultado focal México. O principal objetivo da técnica BFC é testar a interação entre duas proteínas. Em vavo, criamos uma série de dois vetores híbridos BFC e IS compatíveis com gateway que fornecem aos pesquisadores ferramentas fáceis de usar para realizar dois ensaios híbridos BFC e ISTO.
Neste vídeo, vamos demonstrar a facilidade de usar nosso sistema BFC. Para testar a proteína, as interações proteicas de maneira inexistente transcendem o sistema de expressão. Primeiro você precisa Prepare a cultura bacteriana GV 3 1 0 1.
Você precisa escolher uma única colônia do seu prato e inocular em cinco machos do meio YEB com antibióticos apropriados. Então você precisa agitar essas culturas durante a noite a 28 graus. A velocidade é de 200 corridas por minuto.
As culturas bacterianas devem estar prontas na manhã seguinte. Certifique-se de que a bactéria D cresceu. Retire as culturas da incubadora e transfira um macho de cada cultura para um tubo de centrífuga estéril de 1,5 macho.
Coloque os tubos da centrífuga em uma centrífuga de mesa. Gire as bactérias a 1000 G por 10 minutos em temperatura ambiente, descarte o snet. Em seguida, observe o penate adicionando uma refeição de meio de infiltração e a reavaliação por Petting algumas vezes.
Repita a etapa de lavagem por mais duas vezes. Isso é importante porque ajuda a remover o vestígio de antibióticos no meio bacteriano, que fazem com que você plante focas após a infiltração. Após a lavagem final, resus suspende o palete em 0,5 meio de infiltração macho mede 600 dessas suspensões de bactérias usando um espectrofotômetro usando meio de infiltração como controle de banco.
Após a medição do OD, você precisa ajustar o OD usando o meio de infiltração. O OD final deve estar entre um e 1,2. Você deve preparar todas as suspensões bacterianas antes de prosseguir para a próxima etapa.
Transfira a mesma quantidade de suspensões bacterianas correspondentes às suas duas proteínas candidatas e misture-as em um novo tubo macho de 1,5 A mistura de bactérias negativas agora está relacionada ao infiltrado. Prepare todas as combinações e não se esqueça de incluir um controle negativo. Você deve usar o código de cinco a seis semanas e as plantas da melhor maneira para infiltração.
Você pode remover as plantas da sala de crescimento e colocá-las em Nós noite por uma hora antes da infiltração para abrir o ataque da tempestade. Isso ajudará no processo de infiltração. Elabore cerca de 100 microlitros de bactérias suspensas por Resus.
Misture perto de uma seringa macho de ponta escorregadia sem a agulha. Coloque a ponta da seringa contra a parte inferior da folha. Apoie a parte superior do joelho com o dedo.
Geralmente pressione o êmbolo. Você deve ser capaz de ver o líquido se difundindo através da folha, mas sente os espaços de ar mais finos após a infiltração, permitindo que o aero infiltrado com uma caneta de marca. Caso contrário, após dois dias, você não será capaz de identificar o infiltrado A.Se você precisar se infiltrar com uma mistura bacteriana diferente, certifique-se de borrifar sua luva com 50% de etanol ou trocar suas luvas G entre as infiltrações.
Tente deixar um espaço de costela de um metro entre as infiltrações para evitar contaminação cruzada. Os sinais PFA devem ser monitorados a cada 24 horas desde a infiltração até cinco dias. Você pode usar duas mangas de capa de tamanhos diferentes para segurar a amostra.
Primeiro, coloque uma gota de mini água em uma manga de cobertura de entalhe. Em seguida, corte um pequeno pedaço de tecido de faca dentro da zona infiltrada. Tente evitar náuseas Veia na amostra.
Coloque o lenço de papel da faca cortada na água na corrediça Abaixo do conjunto, cubra-o com uma luva de corrente menor e pressione suavemente. Agora a amostra pode ser observada no escopo do México. Aqui usamos este NACA T CSS P dois confocal México para visualizar o sinal BIFC.
Até mesmo o perfume regular do México pode ser usado. O Confocal fornece melhores imagens e detecta sinais fracos. Você pode usar o parâmetro YFP para detectar os sinais VFC neste sistema NCAs P dois.
Você pode simplesmente clicar duas vezes nesta predefinição YFP aqui, que ativará automaticamente a excitação e definirá a faixa de detecção de emissão. Se você estiver usando um sistema diferente, consulte o manual para definir corretamente os parâmetros. Esperamos que, depois de assistir a este vídeo, você seja capaz de conduzir o BFCE para testar as interações proteína-proteína usando o sistema de expressão unbe MI Transcend.
Você também pode aplicar este procedimento a plantas de tabaco e AY. Nossos vetores BFC também contêm uma tag HA e flag, respectivamente, para que você também possa executar co IP para validar as interações, se necessário.
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Visão Geral
Este estudo apresenta uma nova técnica para testar interações proteína-proteína em plantas usando uma abordagem de proteína fluorescente amarela dividida (YFP). Ao clonar fragmentos de YFP em-quadro com genes de interesse, os pesquisadores podem observar a reconstituição de YFP, indicando interações proteicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia vegetal
- Interações de proteínas
- Técnicas de proteína fluorescente
Fundamento
- Compreender as interações proteicas é crucial para elucidar processos biológicos.
- Métodos tradicionais podem não ser adequados para sistemas vegetais.
- A técnica de YFP dividida permite a visualização em tempo real das interações.
- A clonagem Gateway facilita a construção de proteínas de fusão.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método eficiente para estudar interações proteicas em plantas.
- Fornecer aos pesquisadores ferramentas para conduzir ensaios two-hybrid BFC e ISTO.
- Aprimoramento da compreensão das funções proteicas na biologia vegetal.
Métodos Utilizados
- Clonagem de fragmentos de YFP em vetores compatíveis com Gateway.
- Transformação de construtos em Agrobacterium GV3101.
- Co-infiltração de culturas bacterianas em folhas de plantas.
- Observação do sinal YFP usando microscopia para confirmar interações.
Principais Resultados
- Reconstitução bem-sucedida do sinal YFP indica interações proteicas.
- Demonstração da eficácia da técnica BFC em sistemas vegetais.
- Fornecimento de ferramentas amigáveis para pesquisadores.
- Validação do método através de várias pares de proteínas.
Conclusões
- A técnica de YFP dividida é uma ferramenta valiosa para estudar interações proteicas em plantas.
- Este método pode facilitar mais pesquisas na biologia vegetal.
- Aplicações futuras podem incluir a exploração de redes proteicas complexas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Protein-protein interaction analysis in plant systems supports target validation and mechanistic de-risking in agrochemical and biologics discovery. The Gateway-compatible BiFC system enables reproducible, in vivo interaction screening with quantitative fluorescence readouts, improving predictive confidence in early-stage target assessment. This approach reduces reliance on indirect assays and supports cross-functional collaboration between plant biology and translational research teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of protein interactions in planta.
- Operational Value: Provides a Gateway-compatible platform for rapid cloning and testing of target pairs without re-sequencing.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by confirming interactions in a native-like cellular context.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized biological systems suitable for downstream compound or modulator screening.
- Quantitative Output: YFP fluorescence intensity provides a measurable readout for interaction strength and dose-response modeling.
- Scalability: Compatible with high-throughput agroinfiltration workflows in Nicotiana benthamiana.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of plant-derived target pathways with potential translational biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery findings with preclinical validation through consistent interaction data.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables prioritization of targets based on confirmed interaction networks.
Pipeline & Workflow Integration
The BiFC system fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and assay development prior to lead identification efforts in plant-based therapeutic discovery.
- Discovery Biology: Supports target validation and pathway clarification through direct interaction detection.
- Screening: Enables preparation of reproducible, quantitative interaction assays for compound screening campaigns.
- Analytics: YFP signal measurement provides quantifiable data for comparing interaction conditions and genetic perturbations.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery by confirming interactions in disease-relevant plant models.
- Enterprise Reuse: Gateway compatibility allows vector reuse across multiple projects and expression systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, visual evidence of protein interactions in living cells.
- Operational Value: Standardizes interaction testing through Gateway cloning and agroinfiltration protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing confidence in target engagement early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization based on validated interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, agroinfiltration, and fluorescence microscopy.
- Depends on Agrobacterium-mediated transformation infrastructure and confocal or widefield microscopy capabilities.
- Necessitates standardization across teams for consistent OD adjustment, infiltration timing, and signal quantification.
- Adaptation to other plant species may require optimization of infiltration conditions and promoter selection.
- Signal quantification may be affected by autofluorescence or subcellular localization, requiring appropriate controls.
