Detecção de interações proteína na planta através de um gateway de Complementação de fluorescência Compatível Bimolecular (BiFC) Sistema

Para testar a interação entre duas proteínas, os dois genes de interesse precisam ser clonados em nosso BF e vetores usando a técnica de desejo de gateway. Essas construções são transformadas em aerium GV 3 1 0 1. As culturas bacterianas GV 3 1 0 1 contendo para construir serão misturadas e co-infiltradas nas folhas.

Se as duas proteínas candidatas interagirem entre si, o sinal YFP pode ser observado usando o resultado focal México. O principal objetivo da técnica BFC é testar a interação entre duas proteínas. Em vavo, criamos uma série de dois vetores híbridos BFC e IS compatíveis com gateway que fornecem aos pesquisadores ferramentas fáceis de usar para realizar dois ensaios híbridos BFC e ISTO.

Neste vídeo, vamos demonstrar a facilidade de usar nosso sistema BFC. Para testar a proteína, as interações proteicas de maneira inexistente transcendem o sistema de expressão. Primeiro você precisa Prepare a cultura bacteriana GV 3 1 0 1.

Você precisa escolher uma única colônia do seu prato e inocular em cinco machos do meio YEB com antibióticos apropriados. Então você precisa agitar essas culturas durante a noite a 28 graus. A velocidade é de 200 corridas por minuto.

As culturas bacterianas devem estar prontas na manhã seguinte. Certifique-se de que a bactéria D cresceu. Retire as culturas da incubadora e transfira um macho de cada cultura para um tubo de centrífuga estéril de 1,5 macho.

Coloque os tubos da centrífuga em uma centrífuga de mesa. Gire as bactérias a 1000 G por 10 minutos em temperatura ambiente, descarte o snet. Em seguida, observe o penate adicionando uma refeição de meio de infiltração e a reavaliação por Petting algumas vezes.

Repita a etapa de lavagem por mais duas vezes. Isso é importante porque ajuda a remover o vestígio de antibióticos no meio bacteriano, que fazem com que você plante focas após a infiltração. Após a lavagem final, resus suspende o palete em 0,5 meio de infiltração macho mede 600 dessas suspensões de bactérias usando um espectrofotômetro usando meio de infiltração como controle de banco.

Após a medição do OD, você precisa ajustar o OD usando o meio de infiltração. O OD final deve estar entre um e 1,2. Você deve preparar todas as suspensões bacterianas antes de prosseguir para a próxima etapa.

Transfira a mesma quantidade de suspensões bacterianas correspondentes às suas duas proteínas candidatas e misture-as em um novo tubo macho de 1,5 A mistura de bactérias negativas agora está relacionada ao infiltrado. Prepare todas as combinações e não se esqueça de incluir um controle negativo. Você deve usar o código de cinco a seis semanas e as plantas da melhor maneira para infiltração.

Você pode remover as plantas da sala de crescimento e colocá-las em Nós noite por uma hora antes da infiltração para abrir o ataque da tempestade. Isso ajudará no processo de infiltração. Elabore cerca de 100 microlitros de bactérias suspensas por Resus.

Misture perto de uma seringa macho de ponta escorregadia sem a agulha. Coloque a ponta da seringa contra a parte inferior da folha. Apoie a parte superior do joelho com o dedo.

Geralmente pressione o êmbolo. Você deve ser capaz de ver o líquido se difundindo através da folha, mas sente os espaços de ar mais finos após a infiltração, permitindo que o aero infiltrado com uma caneta de marca. Caso contrário, após dois dias, você não será capaz de identificar o infiltrado A.Se você precisar se infiltrar com uma mistura bacteriana diferente, certifique-se de borrifar sua luva com 50% de etanol ou trocar suas luvas G entre as infiltrações.

Tente deixar um espaço de costela de um metro entre as infiltrações para evitar contaminação cruzada. Os sinais PFA devem ser monitorados a cada 24 horas desde a infiltração até cinco dias. Você pode usar duas mangas de capa de tamanhos diferentes para segurar a amostra.

Primeiro, coloque uma gota de mini água em uma manga de cobertura de entalhe. Em seguida, corte um pequeno pedaço de tecido de faca dentro da zona infiltrada. Tente evitar náuseas Veia na amostra.

Coloque o lenço de papel da faca cortada na água na corrediça Abaixo do conjunto, cubra-o com uma luva de corrente menor e pressione suavemente. Agora a amostra pode ser observada no escopo do México. Aqui usamos este NACA T CSS P dois confocal México para visualizar o sinal BIFC.

Até mesmo o perfume regular do México pode ser usado. O Confocal fornece melhores imagens e detecta sinais fracos. Você pode usar o parâmetro YFP para detectar os sinais VFC neste sistema NCAs P dois.

Você pode simplesmente clicar duas vezes nesta predefinição YFP aqui, que ativará automaticamente a excitação e definirá a faixa de detecção de emissão. Se você estiver usando um sistema diferente, consulte o manual para definir corretamente os parâmetros. Esperamos que, depois de assistir a este vídeo, você seja capaz de conduzir o BFCE para testar as interações proteína-proteína usando o sistema de expressão unbe MI Transcend.

Você também pode aplicar este procedimento a plantas de tabaco e AY. Nossos vetores BFC também contêm uma tag HA e flag, respectivamente, para que você também possa executar co IP para validar as interações, se necessário.