Co de expressão de várias proteínas da fusão fluorescente quimérico de forma eficiente em plantas

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia molecular e celular das plantas, como, por exemplo, como podemos proteínas na célula. A principal vantagem desta técnica é a alta eficiência de co-expressar proteínas de fusão celular em um vetor de expressão. Demonstrando o procedimento estará Guitao Zhong, um estudante de pós-graduação de nosso laboratório.

Para começar, projete os primers para clonagem molecular de fragmentos de DNA conforme descrito no protocolo de texto. Amplificar fragmentos de DNA necessários para a construção dos de expressão de proteínas semi-independentes por reações de PCR padrão com seus primers correspondentes e polimerase de alta fidelidade. Estes incluem o promotor, repórter fluorescente, gene alvo e terminador.

Examine a qualidade dos produtos de PCR da primeira rodada procurando degradação e contaminação do DNA com eletroforese de DNA usando um gel de agarose a 1%. Quantificar os produtos de PCR com um espectrofotómetro. A relação entre as leituras a 260 e 280 nanômetros dos produtos de PCR deve estar entre 1,6 e 1,8.

Misturar os fragmentos de ADN concebidos para a mesma de expressão proteica num tubo PCR até obter um volume final de cinco microlitros. Sobre a combinação de DNS de diferentes dados de de expressão. Uma vez que igual reduz a eficiência da montagem do DNA, devido ao aumento do número de moléculas de DNA que precisam ser ligadas.

Agora, adicione 15 microlitros de mistura mestre 2x à mistura de DNA de 5 microlitros e incube a 50 graus Celsius por 60 minutos. Amplificar todo o de expressão proteica semi-independente por uma segunda rodada de PCR. Use 0,5 a um microlitro do produto da primeira reação de montagem isotérmica redonda como modelo nos primers mais externos.

Use uma unidade de polimerase de alta fidelidade em um volume de reação de 50 microlitros por 30 ciclos, seguido por uma extensão final a 68 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, linearize o vetor final da espinha dorsal de expressão da proteína POC 18 e o vetor CAMBIA 1300, adicionando quatro unidades de pequeno a um volume final de reação de 10 microlitros. Esses vetores são projetados para expressão transitória de proteínas e transformação genética.

Incube o digestor de restrição por uma a duas horas a 25 graus Celsius. Após a digestão, inative a enzima de restrição incubando a 65 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, misture moléculas de DNA equimolar de de expressão de proteínas e vetor final linearizado em um volume de reação final de cinco microlitros.

Finalmente, execute a segunda rodada de recombinação de DNA misturando a reação com 15 microlitros de tampão mestre 2x e incubando a 50 graus Celsius por 60 minutos. Para preparar as células em suspensão de BY-2 de tabaco para bombardeio, filtre 30 mililitros de células BY-2 cultivadas em 3 dias em um pedaço de papel de filtro autoclavado de 70 mililitros por meio de uma bomba de vácuo, ajustando a pressão de vácuo para 40 milibares. Enquanto isso, adicione várias gotas de meio cultural líquido de células BY-2 em uma placa de Petri.

Transfira o papel de filtro com as células BY-2 para a placa de Petri. Para preparar plantas juvenis de arabidopsis para bombardeio, prepare plantas de amostra de sete dias, conforme detalhado no protocolo de texto. Em seguida, transfira-os para um retângulo no centro de uma nova placa média MS de meia força para aumentar a eficiência do bombardeio.

Tome cuidado para evitar a sobreposição das plantas ao transferi-las e colocá-las no prato. Adicione várias gotas de meio líquido MS de meia força na superfície das plantas ou tecidos para preservar a umidade e evitar o ressecamento das plantas durante as etapas restantes. Para revestir as partículas de ouro com DNA de plasmídeo, primeiro vortex a solução de microcarreador de ouro completamente por três minutos.

Agora, adicione 25 microlitros de partículas de ouro a um novo tubo de 1,5 mililitro e vortex por 10 segundos. Adicione 10 microlitros de 25,46 miligramas por litro de espermidina e vórtice por 10 segundos. Em seguida, adicione cinco microlitros de um micrograma por microlitro de DNA de plasmídeo e vortex por três minutos.

Finalmente, adicione 25 microlitros de 277,5 miligramas por litro de solução de cloreto de cálcio e vortex por um minuto. Gire os microtransportadores de ouro usando uma centrífuga de bancada na velocidade máxima por cinco segundos. Após a centrifugação, canalize-o cuidadosamente para fora do sobrenadante sem perturbar o pellet.

Em seguida, lave o pellet com 200 microlitros de etanol absoluto e ressuspenda o pellet por vórtice por cinco a 10 segundos. Uma vez ganho, gire os microtransportadores de ouro na velocidade máxima por cinco segundos e remova o etanol. Ressuspenda as partículas de ouro em 18 microlitros de etanol absoluto.

Em seguida, aliquota seis microlitros de suspensão de partículas no meio de três microtransportadores e deixe-os secar ao ar. Para transferir o DNA para as células e plantas por meio do bombardeio de partículas, primeiro defina o sistema de entrega de partículas conforme detalhado no protocolo de texto. Em seguida, bombardeie as células ou plantas na placa de agromédio por três vezes em três posições diferentes.

Mantenha as células e plantas bombardeadas no escuro na câmara de crescimento da planta por seis a 72 horas antes da observação de sinais fluorescentes. Defina a câmara de crescimento da planta para 24 horas escuras e 22 graus Celsius. Transfira as plantas juvenis ou células em suspensão para uma lâmina de vidro convencional e coloque suavemente uma lâmina de cobertura na parte superior para obter imagens por microscopia de varredura a laser confocal padrão.

Usando as configurações listadas no protocolo de texto, excite proteínas marcadas com GFP a 485 nanômetros e detecte fluorescência a 525 nanômetros. Para proteínas marcadas com RFP, excite a 585 nanômetros e detecte a 608 nanômetros. Finalmente, calcule a taxa de colocação de sinais fluorescentes conforme descrito no protocolo de texto.

A co-expressão de arabidopsis VSR-2 e arabidopsis SCAMP4 em células BY-2 de tabaco foi alcançada por bombardeio de partículas e mostrou localizações corretas. RFP arabidopsis VSR-2 exibe um padrão pontilhado, que era distinto da localização da membrana plasmática de arabidopsis SCAMP4-GFP, com alguns pontos pontilhados citosólicos. Além disso, plantas transgênicas de arabidopsis que co-expressam arabidopsis SCAMP4-GFP e RFP arabidopsis VSR-2 foram geradas por meio de transformação mediada por agrobactérias.

As localizações subcelulares de co-expressão das duas proteínas quiméricas na raiz e nas células ciliadas da raiz são mostradas. Consistente com estudos anteriores, o tratamento da arabidopse transgênica causou compartimentos prevacuais marcados com RFP arabidopsis VSR-2, formando uma pequena estrutura em forma de anel. Enquanto o tratamento com pré-dobra A induziu arabidopse SCAMP GFP marcada com agregação de rede G transgold.

Como controle negativo, pouco sinal autofluorescente é observado nas células BY-2 do tabaco e nas células ciliadas da raiz e da raiz da arabidopse, aplicando-se as mesmas configurações de coleta de imagens. Este método pode fornecer informações sobre a localização subcelular das proteínas. Também pode ser aplicado ao estudo da proteína na direção.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular vegetal. Exportar convenientemente as localizações subcelulares e a interação espacial de proteínas na célula vegetal viva. Após este procedimento, outros métodos como transformação mediada por PET e cruzamento genético podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como co-expressar várias proteínas de fusão em plantas.

Não se esqueça de que trabalhar com bombardeio pode ser extremamente perigoso e precauções como protetores oculares devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.