Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular: A alta taxa de transferência método quantitativo para estudo de interação proteína-proteína

O objetivo geral deste procedimento é mapear locais de interação ACAP LBC com PDE quatro D três. Medindo a intensidade média de fluorescência de biomolecular, fluorescência, complementação ou BC usando citometria de fluxo. Para fazer isso, as células são transfectadas com fragmentos ACAP LBC e PDE quatro D três fundidos à porção terminal N ou C da proteína repórter fluorescente.

A citometria de fluxo de Vênus é então realizada para avaliar a fluorescência se os fragmentos de proteína interagirem Vênus estiver completa e a fluorescência. Se os fragmentos de proteína não interagirem, nenhuma fluorescência será detectada. A análise de sangue ocidental complementar é realizada para determinar os níveis relativos de expressão proteica.

A força das interações proteína-proteína é então calculada normalizando a intensidade média de fluorescência YFP com os níveis de expressão proteica. Os dados resultantes indicam que a ligação da PDE 43 ao ACAP LBC é mediada por várias regiões dentro da PDE 43, principalmente por meio da região conservada a montante um ou UCR um. As principais vantagens desta técnica sobre o método existente, como co-imunoprecipitação e BP C usando microscópio ou que é relativamente simples, é sensível e facilita a triagem rápida de um grande número de células.

Embora esse método possa fornecer informações sobre as interações proteína-proteína, ele também pode ser usado para rastrear fatores que regulam as interações proteína-proteína para a descoberta de medicamentos. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque uma resposta linear B precisa ser determinada. Uma expressão de construto deve ser semelhante para que o resultado use diferentes fragmentos de proteína possam ser comparados entre si.

Nos experimentos descritos aqui, as células são transfectadas com fragmento terminal N do derivado YFP, Vênus fundido a ACAP LBC de comprimento total e o fragmento terminal C de Vênus fundido a um dos seguintes, PDE E 43 de comprimento total, a região conservada a montante um UCR um de PDE E 43 ou a região conservada a montante dois mais a região catalítica UCR R dois mais CAT de PDE 43 no dia anterior à transfecção em Seis. Bem, as placas de cultura de tecidos semeiam 1,2 vezes 10 elevado ao quinto HEC 2 9 3 células T por poço em dois mililitros de crescimento completo. Semente média, três poços controle mais três poços para cada um dos testes.

Cotran incuba a 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, prepare-se para a transfecção das construções de DNA plasmático BC e do vetor CFP, que é transfectado com construções BS C como marcador. Para cada condição, adicione a quantidade apropriada de DNA a 250 microlitros de meio livre de soro Optum M1.

Em um tubo estéril, um tubo é suficiente para transfectar três poços. Em seguida, adicione três microlitros de LT de trânsito, um reagente para cada micrograma à mistura de DNA diluído e pipete suavemente para misturar, incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação a 250 microlitros de mistura de transfecção gota a gota para as células, em seguida, incubar a 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius, 24 horas.

Fluorescência de verificação pós-transfecção sob um microscópio de epifluorescência, as células devem expressar fluorescência amarela para sinal BC e fluorescência CFP para relatar a eficiência da transfecção. Para preparar as células para a análise de citometria de fluxo, primeiro lave-as com dois mililitros de PBS gelado e, em seguida, separe as células adicionando 250 microlitros de tripsina a 0,05% incubar por dois a cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, usando um microscópio, verifique o descolamento celular.

Uma vez que as células tenham se desprendido, neutralize a tripsina com um mililitro de DMEM. Em seguida, transfira um mililitro de células para um tubo de microcentrífuga e, em seguida, transfira 0,25 mililitros de células para um segundo tubo de microcentrífuga. Gire os tubos a 500 queijos por cinco minutos.

A amostra de 250 microlitros será posteriormente processada para citometria de fluxo. Colocar a amostra de um mililitro de lado no gelo para análise de sangue ocidental, que deve ser realizada em paralelo após o centrifugação Resus. Suspenda as células em 250 microlitros de tampão de fax e coloque-as em células de gelo também podem ser fixadas em 1% de aldeído paraforme em PBS Se a análise de citometria de fluxo não for imediata aqui, a citometria de fluxo é realizada usando um ciano Beckman Coulter um DP equipado com lasers de estado sólido de 488 nanômetros 405 nanômetros e 642 nanômetros o software summit é usado para aquisição e análise após a calibração do citômetro de fluxo usando grânulos padrão, traçar dispersão para frente ou FSC versus dispersão lateral SSC em uma escala linear e marcha na população de células vivas.

Em seguida, plote SSC versus a largura de pulso de tensão e marcha na população de células vivas não agregadas. Em seguida, plote FSC em uma escala linear versus fluorescência CFP a 405 FL seis neste instrumento em uma escala logarítmica e marcha nas células vivas positivas para CFP não agregadas. Finalmente, plote o FSC em uma escala linear versus a fluorescência YFP a 488 nanômetros FL um neste instrumento em uma escala logarítmica para visualizar a intensidade do BC.

Em seguida, execute o Y-F-P-C-F-P duplo negativo sample e ajuste o F-S-C-S-S-C FL um e FL seis tubo fotomultiplicador ou PMT voltagem para definir o limite para cada sinal. Em seguida, execute amostras positivas únicas YFP e CFP para compensação offline futura. Certifique-se de adquirir pelo menos 10.000 eventos fechados.

Finalmente, colete dados para amostras experimentais após a coleta de dados. Configure o protocolo de análise de acordo com a aquisição com propagação com a porta um no gráfico de pontos FS CSC para células vivas. Porta dois no pulso FSC com gráfico de pontos da porta um para células vivas não agregadas e porta três no gráfico de pontos do FSC ccfp da porta dois para células vivas positivas para ccfp não agregadas.

Depois de compensar o sinal YFP e CCFP no gráfico de pontos Y fp CFP usando células positivas únicas YFP e CFP, determinamos as linhas de corte para células positivas CFP e YFP. Exporte a intensidade média de fluorescência YFP ou MFI de células positivas para CFP para se destacar para plotagem de dados e, em seguida, normalize no Excel Y-F-P-M-F-I para o nível de expressão de ACAP LBC PDE E 43 e controle de carga alfa tubulina conforme determinado por western blotting para determinar a faixa linear da intensidade média de fluorescência YFP. O CFP foi seccionado com VN ACAP L BBC e quantidades variáveis de VC PDE E 43 em células HEC 2 93 e a interação foi avaliada usando citometria de fluxo bif conforme descrito neste vídeo, este gráfico mostra a mudança relativa de dobra na expressão de VC PDE E 43 em função de VC PDE E 43 transfectado.

A intensidade média de fluorescência de Vênus em células positivas para CFP indicada pelos quadrados azuis correlacionou-se com a expressão de VCDE 43 e foi consistente com os níveis de expressão determinados pela análise de imagem de um western blot, que é indicado pelos triângulos vermelhos. Intensidade média de fluorescência CFP semelhante foi observada entre as amostras, conforme indicado pelos quadrados verdes, e foi usada como controle negativo para limitar as variações celulares. Esses resultados validam o uso da citometria de fluxo para quantificar a interação ACAB LB C PDE 43 medindo a intensidade média de fluorescência de BS e e, ao mesmo tempo, determinando a quantidade adequada de construções BIC usadas para triagem para mapear locais de ligação ACAP LBC dentro da PDE E 43 Análise BIC da interação ACAP LBC com PDE E 43 fl.

A região UCR um da PDE 43 e UCR dois e as regiões CAT da PDE 43 foram avaliadas usando este método, como visto aqui. A expressão de vn, ACAP, LBC e VC PDE 43, UCR dois mais CAT resulta em menor sinal de BC quando comparado a VC PDE 43, FL e VC PDE 43, UCR, uma expressão proteica semelhante foi observada em todas as amostras de fluxo e a fluorescência média foi normalizada para os níveis de expressão relativa de ACAP, LBC, PDE 43 e tubulina alfa. Portanto, o BCMF normalizado indica que não há diferença na intensidade de fluorescência entre ACAP LBC PDE 43 FL e ACAP LBC PDE 43 UCR R um, mas um sinal muito menor para ACAP LBC PDE 43 UCR dois mais interação CAT.

Esses resultados sugerem que existem várias regiões na PDE 43 que interagem com a ACAP LBC e que a PDE 43 UCR R one é a principal região de interação com a ACAP LBC. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estudar proteínas, interação de proteínas por análise de citometria de fluxo de BP C. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de determinar a quantidade correta de construção BP C usada para obter expressão proteica semelhante e resposta linear de BP C. Após este procedimento, outros métodos como peptídeo ou risco podem ser realizados para determinar quais aminoácidos dentro do PDE 40 D três são responsáveis.

Suas interações ACAP RBC.