Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular: A alta taxa de transferência método quantitativo para estudo de interação proteína-proteína

O objetivo geral deste procedimento é mapear os sítios de interação entre ACAP LBC e PDE4D3. Isso é feito mediante a medição da intensidade média de fluorescência de biomoléculas, complementação por fluorescência ou BC utilizando citometria de fluxo. Para tanto, as células são transfectadas com fragmentos de ACAP LBC e PDE4D3 fundidos à porção N-terminal ou C-terminal da proteína marcadora fluorescente.

A citometria de fluxo Venus é então realizada para avaliar a fluorescência caso os fragmentos proteicos interajam, completando Venus e gerando fluorescência. Se os fragmentos proteicos não interagirem, nenhuma fluorescência é detectada. Uma análise complementar de sangue pelo método Western é realizada para determinar os níveis relativos de expressão proteica.

A intensidade das interações entre proteínas é então calculada normalizando a intensidade média de fluorescência de YFP com os níveis de expressão proteica. Os dados resultantes indicam que a ligação de PDE 43 à ACAP LBC é mediada por múltiplas regiões dentro de PDE 43, principalmente através da região conservada upstream um ou UCR um. As principais vantagens desta técnica em relação a métodos existentes como co-imunoprecipitação e BP C usando microscópio são que ela é relativamente simples, sensível e facilita a triagem rápida de um grande número de células.

Embora este método possa fornecer informações sobre interações entre proteínas, ele também pode ser utilizado para triar fatores que regulam essas interações no contexto de descoberta de fármacos. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque é necessário determinar uma resposta B linear. A expressão do construto deve ser semelhante para que os resultados obtidos com diferentes fragmentos proteicos possam ser comparados entre si.

Nos experimentos descritos aqui, as células são cotransfectadas com o fragmento N-terminal do derivado YFP, Venus fundido à ACAP LBC de comprimento completo e o fragmento C-terminal de Venus fundido a um dos seguintes: PDE E 43 de comprimento completo, a região conservada upstream um (UCR um) da PDE E 43 ou a região conservada upstream dois mais região catalítica (UCR R dois mais CAT) da PDE 43. No dia anterior à transfeção, em placas de cultura de tecidos de seis poços, semeie 1,2 × 10⁵ células HEC 293T por poço em dois mililitros de meio de crescimento completo. Semeie três poços controle mais três poços para cada um dos testes.

Incubar Cotran a 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, preparar a transfeção dos construtos de DNA plasmático BC e do vetor CFP, que é cotransfectado juntamente com os construtos BS C como marcador. Para cada condição, adicionar a quantidade apropriada de DNA a 250 microlitros de meio sem soro Optum M1.

Em um tubo estéril, um tubo é suficiente para transfectar três poços. Em seguida, adicione três microlitros do reagente Transit-LT1 por micrograma à mistura de DNA diluída e pipete suavemente para homogeneizar. Incube durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, adicione gota a gota 250 microlitros da mistura de transfeção às células e, então, incube a 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 24 horas.

Após a transfeção, verifique a fluorescência sob um microscópio de fluorescência epiluminescente; as células devem expressar fluorescência amarela para o sinal de BC e fluorescência CFP para relatar a eficiência de transfeção. Para preparar as células para análise citométrica de fluxo, lave-as primeiro com dois mililitros de PBS frio, então desprenda as células adicionando 250 microlitros de tripsina 0,05% e incube por dois a cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, utilize um microscópio para verificar o desprendimento celular.

Uma vez que as células tenham se destacado, neutralize a tripsina com um mililitro de DMEM. Em seguida, transfira um mililitro de células para um tubo microcentrífugo, depois transfira 0,25 mililitros de células para um segundo tubo microcentrífugo. Centrifugue os tubos a 500 cheeses por cinco minutos.

A amostra de 250 microlitros será processada posteriormente para citometria de fluxo. Reserve a amostra de um mililitro em gelo para análise sanguínea ocidental, que deve ser realizada em paralelo após o spin Resus. Suspenda as células em 250 microlitros de tampão fax e coloque-as em gelo. As células também podem ser fixadas em paraformaldeído 1% em PBS se a análise por citometria de fluxo não for imediata. A citometria de fluxo é realizada usando um Beckman Coulter Cyan ADP equipado com lasers de estado sólido de 488 nanômetros, 405 nanômetros e 642 nanômetros. O software Summit é utilizado para aquisição e análise, após calibração do citômetro de fluxo com microesferas-padrão. Plote a dispersão para frente (FSC) versus a dispersão lateral (SSC) em escala linear e delimite a população de células viáveis.

Em seguida, plote SSC versus a largura do pulso de tensão e o padrão de locomoção na população de células vivas não agregadas. Depois, plote FSC em escala linear versus a fluorescência de CFP no canal FL6 de 405 nm neste instrumento em escala logarítmica e selecione as células vivas positivas para CFP não agregadas. Por fim, plote FSC em escala linear versus a fluorescência de YFP no canal FL1 de 488 nanômetros neste instrumento em escala logarítmica para visualizar a intensidade de BC.

Em seguida, execute a amostra dupla negativa Y-F-P-C-F-P e ajuste o tubo fotomultiplicador ou tensão PMT do F-S-C-S-S-C FL um e FL seis para definir o limiar de cada sinal. Em seguida, execute as amostras simples positivas de YFP e CFP para compensação futura offline. Certifique-se de adquirir pelo menos 10.000 eventos dentro da região selecionada.

Por fim, colete os dados para as amostras experimentais após a coleta de dados. Configure o protocolo de análise conforme a aquisição, propagando o gate um no gráfico de dispersão de FS CSC para células viáveis. Gate dois no pulso de FSC com gráfico de dispersão do gate um para células viáveis não agregadas e gate três no gráfico de dispersão de ccfp FSC do gate dois para células viáveis positivas para ccfp não agregadas.

Após compensar o sinal de YFP e CCFP no gráfico de dispersão Yfp CFP utilizando células simplesmente positivas para YFP e CFP, determinamos as linhas de corte para células positivas para CFP e YFP. Exportamos a intensidade média de fluorescência ou IMF de YFP das células positivas para CFP para o Excel, para plotagem dos dados; em seguida, normalizamos a IMF de YFP ao nível de expressão de ACAP LBC PDE E 43 e ao controle de carga alfa-tubulina, determinado por western blot, a fim de estabelecer a faixa linear da intensidade média de fluorescência de YFP. CFP foi cotransfectado com VN ACAP L BBC e quantidades variáveis de VC PDE E 43 em células HEC 293, e a interação foi avaliada por citometria de fluxo bifluorescente conforme descrito neste vídeo; este gráfico mostra a variação relativa na expressão de VC PDE E 43 em função da quantidade de VC PDE E 43 transfectada.

A intensidade média de fluorescência de Venus em células positivas para CFP, indicada pelos quadrados azuis, correlacionou-se com a expressão de VCDE 43 e foi consistente com os níveis de expressão determinados pela análise de imagem de um western blot, o qual é indicado pelos triângulos vermelhos. Intensidade média de fluorescência semelhante de CFP foi observada entre as amostras, conforme indicado pelos quadrados verdes, e foi utilizada como controle negativo para limitar variações celulares. Esses resultados validam o uso da citometria de fluxo para quantificar a interação ACAB LB C PDE 43 por meio da medição da intensidade média de fluorescência de BS e, ao mesmo tempo, determinar a quantidade adequada de construtos BIC utilizados para triagem no mapeamento dos sítios de ligação de ACAP LBC dentro de PDE E 43. Análise BIC da interação ACAP LBC com PDE E 43 de comprimento completo (fl).

A região UCR um da PDE 43 e as regiões UCR dois e CAT da PDE 43 foram avaliadas usando este método, conforme mostrado aqui. A expressão de vn ACAP LBC e VC PDE 43 UCR dois mais CAT resulta em um sinal BC mais baixo quando comparado ao VC PDE 43 FL e ao VC PDE 43 UCR um; expressão proteica semelhante foi observada em todas as amostras de fluxo e a fluorescência média foi normalizada em relação aos níveis relativos de expressão de ACAP LBC PDE 43 e alfa-tubulina. Portanto, o B-C-M-F-I normalizado indica que não há diferença na intensidade de fluorescência entre ACAP LBC PDE 43 FL e ACAP LBC PDE 43 UCR um, mas um sinal muito mais baixo para a interação ACAP LBC PDE 43 UCR dois mais CAT.

Esses resultados sugerem que existem múltiplas regiões na PDE 43 que interagem com o LBC da ACAP e que a região UCR R da PDE 43 é a região principal de interação com o LBC da ACAP. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar interações entre proteínas por meio de citometria de fluxo com análise do BP C. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de determinar a quantidade correta do construto BP C utilizada para obter expressão proteica semelhante e resposta linear do BP C. Após este procedimento, outros métodos, como peptídeos ou risco, podem ser realizados para determinar quais aminoácidos dentro da PDE 40 D três são responsáveis por.

Suas interações ACAP-RBC.