Complementação de fluorescência bimolecular

Este experimento visa definir se duas proteínas interagem nas células e delinear aspectos dos locais dessa interação. As primeiras células são transfectadas com construções de expressão que codificam as duas proteínas de interesse, uma das quais é fundida ao terminal final de uma proteína fluorescente fragmentada e a outra fundida ao terminal C complementar da proteína fluorescente fragmentada. Depois de permitir que as células transfectadas desenvolvam sinal fluorescente em cultura, os complexos proteicos são visualizados por imagem e immuno blotting.

Em seguida, as imagens coletadas são exportadas para um software de imagem, como a Imagem J Para quantificar a intensidade média de fluorescência por célula em um experimento controlado, os resultados do BIFC podem demonstrar interações proteína-proteína e a localização desses complexos, como os três domínios SH da proteína do andaime que se cruzam e o domínio pró-rico de PI três KC dois beta. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como colocalização, imunoprecipitação e traste, é que o BFC permite a localização espacializada de interações transitórias mais fracas na célula. E esse método não requer imagens extensas de pós-processamento, como visto com fret.

Este método pode abordar questões-chave na área de transdução de sinal, como as proteínas X e Y interagem e, em caso afirmativo, quais são os compartimentos específicos nos quais esses complexos estão localizados na célula? Geralmente, os recém-chegados a esse método terão dificuldades porque não escolheram a configuração adequada para expressar sua biópsia. Proteínas de interesse marcadas Comece selecionando um dos múltiplos fluoróforos para as proteínas de fusão BIFC.

Considere que as extremidades terminais amino e carboxi de Vênus são capazes de formar um complexo a 37 graus Celsius, enquanto os fragmentos Y-F-P-B-I-F-C requerem uma pré-incubação a 30 graus Celsius. Projete vetores de expressão para adição de tags às proteínas de interesse, considerando como a ligação dos fragmentos BIFC pode afetar a função das proteínas de interesse. Por exemplo, a família RAs, GTP a's são lipídios modificados no terminal carboxi e não podem ser marcados nesta extremidade sem interromper esta modificação.

Sempre realize experimentos piloto para determinar as condições de transfecção. Monitore também as células por microscopia de fluorescência para identificar um momento ideal para o desenvolvimento do sinal. Em seguida, execute a análise da flor ocidental para confirmar a expressão igual das construções.

É importante ressaltar a coloração imunológica para o HA ou etiqueta de bandeira para verificar se a adição dos fragmentos BIFC não altera a localização celular das proteínas de interesse para cada placa de amostra. 1,3 vezes 10 das cinco células causadoras cada uma em uma placa de matéria de fundo de vidro e dois poços de uma placa de seis poços e permitem que as células se assentem durante a noite em uma incubadora de 37 graus Celsius no dia seguinte. Prepare DNAs para transfecção por lipectomia ou outro método preferido.

Primeiro, diluir o DNA em 250 microlitros de DMEM livre de soro como controle de transfecção. Adicione CFP em um 50, a quantidade total de seus DNAs BIFC. Agora dilua o lábio em 250 microlitros de DMEM livre de soro usando 10 microlitros de lábio por um micrograma de DNA.

Misture o DNA e as diluições labiais e incube em temperatura ambiente por 20 minutos. Enxágue as células duas vezes com DMEM sem soro quente. Adicione dois mililitros de DMEM livre de soro a cada placa de fundo de vidro ou poço de um prato de seis poços.

Em seguida, divida cada mistura de transfecção igualmente entre um prato de fundo de vidro e dois poços de seis. A placa de poço incuba as células a 37 graus Celsius por cinco horas. Por fim, remova o meio de transfecção e substitua por um meio DMEM completo mais 10% FBS.

Incubar as células pelo tempo determinado em experimentos piloto para obter os níveis de expressão necessários das proteínas de interesse. Examine as células transfectadas sob um microscópio epifluorescente para garantir que o controle positivo seja fluorescente. Enxágue as células três vezes com PBS para imagens de células vivas.

Coloque as células em meios sem matrizes indicadoras. Para imagens de células fixas. Adicione 2% de formaldeído e coloque no gelo por 10 minutos.

Em seguida, enxágue as células três vezes com PBS agora coberto com um mililitro de PBS e armazene no escuro a quatro graus Celsius, imediatamente ligue as células no prato de seis poços. Para análises de Western blot, é importante que todas as células sejam preparadas ao mesmo tempo para que as células de lys sejam representativas das células de imagem. Realize um western blot para garantir que as proteínas de marcação sejam expressas em níveis equivalentes.

Ao fazer imagens de células com um microscópio confocal, é importante manter as configurações constantes durante todo o experimento para que a fluorescência seja comparável entre as amostras. Certifique-se de criar imagens de células individuais onde os pixels não estão saturados. Como o CFP foi incluído como controle de transfecção, selecione apenas células positivas para CFP para análise dos sinais BIFC.

Quantifique a fluorescência usando software de imagem, como o Image J.Abra arquivos de imagem no Image J.Go para analisar as medições definidas. Marque as caixas de área e valor médio de cinza na caixa de medidas. Observe que, neste exemplo, as imagens venosas foram pseudocoloridas em verde e imagens CFP, pseudocoloridas em vermelho.

Usando a ferramenta de seleção à mão livre, desenhe um contorno ao redor da borda de toda a célula no canal CFP, deixando esse contorno no lugar. Mude para o canal YFP. Vá para analisar, meça o valor médio de cinza refletindo a intensidade média de fluorescência por célula para cada imagem.

Desenhe um círculo no canal YFP em uma área que não contenha uma célula. Faça uma medição para esta área como pano de fundo. Subtraia o plano de fundo de cada imagem.

Finalmente, para calcular a intensidade média de fluorescência para uma população de células, calcule a média do valor médio menos o fundo de todas as células fotografadas em uma amostra. Idealmente, quantifique 60 células em três experimentos. A proteína de andaime multidomínio que se cruza regula a sobrevivência neuronal através da regulação de uma nova classe dois, PI três quinase, PI três KC, dois beta que se cruzam SH, três domínios interagem com a região amino terminal rica em prolina de PI, três KC, duas transfecções beta de VN marcadas com VC, PI marcadas com três KC, dois beta resultam em um sinal fluorescente no canal YFP, que é verde pseudocolorido indicando formação complexa.

CFP pseudo colorido aqui em vermelho é usado como um controle para marcar mutações de células transfectadas no domínio rico em prolina de PI três KC dois beta, que interrompem a co-precipitação de interseção e PI três KC dois beta diminuem o sinal BIFC. Essa diferença no sinal BIFC não se deve a diferenças na expressão do tipo selvagem e das proteínas PA PI três K Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em três dias se feita corretamente. Ao realizar este procedimento, você precisa se lembrar de executar os controles adequados e verificar a expressão da proteína para garantir que as diferenças no sinal de BC sejam devidas a diferenças na formação de complexos e não devido à expressão seguindo este procedimento.

Outras técnicas, como plasma de superfície em residentes, podem ser realizadas para responder a perguntas como: quais são as diferentes afinidades desses complexos entre si?