Name: Complementação de fluorescência bimolecular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprenda a usar complementação de fluorescência bimolecular para estudar interações proteicas e sua localização subcelular em células vivas. Esta técnica permite visualizar onde e se duas proteínas interagem, reconstituindo um sinal fluorescente apenas na formação do complexo.

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O ITSN, PI3K C2β, e vetores de controle usado neste protocolo estão disponíveis mediante solicitação aos autores, para fins não comerciais apenas. Os autores gostariam de agradecer o Dr. Chang-Deng Hu gentilmente para aconselhamento e dos reagentes utilizados no estabelecimento do protocolo BiFC no laboratório O&#39;Bryan. KAW foi apoiada por fundos do Jerome Lejeune Foundation. Trabalho no laboratório O&#39;Bryan é suportado por concessões do (HL090651) NIH, DOD (PR080428), a Fundação St. Baldrick, e da Fundação Jérôme Lejeune.

A. BiFC Calibração <ol><li> Escolha um fluoróforo. Existem vários fluoróforos, tais como YFP e Vênus, que funcionam bem como parceiros BiFC fusão (Tabela 1). Termina amino-e carboxi-terminal de Vênus são capazes de formar um complexo a 37 ° C, enquanto os fragmentos YFP BiFC requerem um pré-incubação a 30 ° C, a fim de facilitar a formação de fluoróforo 2. Esta incubação a baixa temperatura podem alterar alguns processos celulares e devem ser levados em conta ao escolher fragmentos. Vetores para a fusão Venus carboxi-terminal de proteínas estão disponíveis a partir Addgene ( <a href="http://www.addgene.org/pgvec1">http://www.addgene.org/pgvec1</a> ; seepBiFC-VN173 e pBiFC-VC155), juntamente com construções adicionais para uso como controles, por exemplo, <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a> e pBiFC-bFosVC155 2. Vetores adicionais, incluindo vetores amino-terminal Venus (PFLAG-VN173 e PHA-VC155), estão disponíveis no seguinte site: <a href="http://people.pnhs.purdue.edu/%7Ehu1/">http://people.pnhs.purdue.edu/ HU1 ~ /</a> . </li><li> Tag a proteína de interesse. BiFC Os fragmentos são fundidos para as extremidades amino ou carboxi-terminal das proteínas candidato. Algumas proteínas podem não permitir a marcação em cada extremidade, devido à interrupção da função da proteína. Por exemplo, muitos membros da superfamília Ras de GTPases são lipídios modificados no anexo carboxi-terminal impossibilitando dos fragmentos BiFC naquela final. Assim, é importante ter alguma idéia de como o apego dos fragmentos BiFC pode afetar a função das proteínas de interesse. Se não está claro como a marcação de uma proteína vai afetar a sua função combinações múltiplas devem ser testados. Além do fragmento BiFC, um linker peptídeo pode ser incluído para aumentar a flexibilidade entre o fluoróforo fragmentado e as proteínas candidato. Embora os sites de clonagem múltipla (MCS) nos vetores BiFC codificar pequenos trechos de aminoácido que pode fornecer flexibilidade suficiente, o RSIAT, KQKVMNH e linkers RPACKIPNDLKQKVMNH tem sido utilizado com sucesso em experimentos BiFC 3,9 </li><li> Determinar as condições de transfecção. Mutantes Antes de testar vários, um poucos experimentos de controle deve ser realizado. As duas primeiras combinações BiFC que deve ser julgado duas proteínas do tipo selvagem que são conhecidos por interagir e uma do tipo selvagem e mutante que não interagem. Usando essas duas combinações, diferentes quantidades de DNA e os tempos de transfecção devem ser testados para determinar as condições óptimas para a detecção de um sinal para as proteínas BiFC candidato. Sugerimos testes 0.25ug, 0.5ug, 1.0ug de cada construto BiFC para um único poço de um prato bem 6. O dia depois que as células transfecção monitor por microscopia de fluorescência para determinar o tempo ideal para o desenvolvimento do sinal. O <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a> e pBiFC-bFosVC155 duas construções são úteis controles positivos para BiFC e estão disponíveis a partir Addgene (veja acima). Além disso, Western blot devem ser realizados para confirmar a expressão igual das construções. Condições devem ser escolhidos de forma que um sinal fluorescente é observada entre as duas proteínas do tipo selvagem, mas pouco ou nenhum sinal é observado entre o tipo selvagem e proteínas mutantes. Finalmente, o melhor é manter a expressão da proteína o mais baixo possível para evitar qualquer interações não-específicas. </li><li> Determinar se a adição dos fragmentos BiFC altera a localização das proteínas de interesse. Cada construir BiFC contém quer um HA ou tag epítopo FLAG. Immunostain transefected células tanto para HA ou tag epítopo bandeira, assim como também a proteína endógena (se possível) para determinar se o tag BiFC afeta a localização das proteínas de interesse. </li></ol> B. Galvanização e transfecção de células <ol><li> Células COS (1.3x10 5) são banhados em cada uma placa de vidro de fundo Matek e dois poços de uma placa de 6 poços por amostra. Permitem que as células para resolver durante a noite a 37 ° C. Tipos de células alternativas que são mais relevantes para as proteínas de interesse candidato também pode ser usado. </li><li> Prepare DNAs de transfecção. Nós normalmente utilizam Lipofectamine (Invitrogen) para transfections COS. No entanto, outros reagentes podem ser mais apropriados para a linha de células de interesse. Uma vez que a mistura de transfecção será dividido entre um prato fundo de vidro e dois poços de uma placa de 6 poços, use a quantidade adequada de DNA para dar conta dessa divisão. Diluir DNA em 250uL de soro livre (SF) DMEM. Adicionar PCP em 05/01 a quantidade do total DNAs BiFC como um controle de transfecção. Para a quantificação BiFC, apenas as células que são positivos para o CFP serão analisadas para a presença de um sinal BiFC. Note-se que os espectros PCP vai coincidir com alguns dos pares BiFC na Tabela 1, portanto um controle alternativo de transfecçãotalvez necessário. Diluir Lipofectamine em 250uL SF DMEM (10uL Lipofectamine/1ug de DNA). Misturar o DNA e as diluições Lipofectamine. Incubar à temperatura ambiente por 20min. Nota: O Lipofectamine: relação de DNA pode variar dependendo do tipo de célula. Use o método apropriado para a transfecção linhagem de células de interesse. </li><li> Enxágüe com água morna células 2x SF DMEM. Adicionar 2 ml de SF DMEM para cada prato fundo de vidro ou bem de um prato 6-bem. </li><li> Dividir cada mistura de transfecção uniformemente entre um prato fundo de vidro e dois poços de um prato 6-bem. </li><li> Incubar as células a 37 ° C por 5 horas. </li><li> Remova a mídia de transfecção e substituir com a mídia completo (DMEM +10% SFB). </li><li> Células incubar durante a 37 ° C. O comprimento de transfecção seguintes incubação varia de acordo com os níveis de expressão das proteínas de interesse. Incubação prolongada pode resultar em não-específicas de interação de modo que este passo terá de ser determinada empiricamente. </li></ol> C. Preparação das células para criação de imagens <ol><li> Células são inicialmente examinados sob um microscópio de epifluorescência para garantir que o controlo positivo é fluorescente. Se não, pode ser necessário para permitir que as células tempo adicional a 37 ° C até que sinal é observado. </li><li> Enxágüe células 3x com PBS (pH 7,4). Para as células no prato fundo de vidro adicionar paraformaldeído 2% (pH 7,4). Corrigir as células por 10 min no gelo. Enxágüe células 3x com PBS (pH 7,4). Células armazenar a 4 ° C coberto com 1mL de PBS (pH 7,4). Células não tem que ser corrigido para imagens, mas uma vez que os fragmentos BiFC reforma um fluoróforo intacta é a análise evitando assim irreversível de interações dinâmicas 3. Além disso, mantenha em mente que as células unfixed continuará a desenvolver sinal. Lisar as células do prato 6-bem e preparar lisados ​​para Western blot. É importante que todas as células são preparadas ao mesmo tempo para que as células lisadas são representativos das células imagens. </li></ol> Células D. Imagem <ol><li> A intensidade de fluorescência será calculado por célula. Certifique-se de células de imagem individual. </li><li> PCP foi incluído como um controle tranfection e somente PCP células positivas são selecionados para análise de sinais BiFC. Nós fazemos a suposição de que se a célula é transfectadas com PCP, é também transfectadas com as construções BiFC. Essa abordagem garante que as células com imagens que não têm um sinal BiFC são negativos, devido à falta de uma interação entre as proteínas de interesse e não devido à ausência de um ou ambos os construtos de expressão BiFC naquela célula. </li><li> Nós usamos uma Zeiss LSM 510 microscópio confocal para imagens de células. Ao usar este microscópio é importante para manter o zoom, pinhole, ganho de detector, amplificador offset, tamanho do quadro, velocidade de digitalização, média de verificação, e laser de potência consistente. Ao usar qualquer sistema de imagem é importante para manter as configurações constante para que a fluorescência é comparável entre as amostras. Além disso, ao quantificar a fluorescência é importante que pixels não são saturadas. </li></ol> E. Quantificação de fluorescência <ol><li> Fluorescência pode ser quantificada usando qualquer software de imagem. Nós utilizamos ImageJ que está livremente disponível a partir do NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Abrir arquivos de imagem no ImageJ. Ir para Medições AnalyzeSet. Marque as caixas de Área e Valor médio cinza na caixa de Medições. </li><li> Usando a ferramenta 'Seleção mão livre ", desenhe um contorno ao redor da borda da célula inteira no canal PCP. </li><li> Deixando este esquema no lugar, mudar para o canal YFP. Ir para AnalyzeMeasure. O Valor Médio Gray é a soma dos valores de cinza de todos os pixels na seleção, dividido pelo número de pixels (ou seja, a intensidade média de fluorescência por área da célula). </li><li> Para cada imagem desenhar um círculo no canal YFP em uma área que não contém uma célula. Tomar uma medida para esta área como pano de fundo. Subtrair o fundo de cada imagem. </li><li> Valor a média menos o cinza de fundo para todas as células fotografada em uma amostra. Esta será a intensidade média de fluorescência para uma população de células. Gostaríamos de sugerir cerca de 60 células ao longo de três experimentos ser quantificado. </li></ol> Resultados F. Representante: Nosso laboratório centra-se na proteína andaime multi-domínio, intersectin (ITSN) que interage com proteínas numerosos para regular múltiplas vias bioquímicas e de sinalização 10,11,12,13,14. ITSN contém dois homologia Eps15 (EH) domínios, uma região enrolada em espiral, e cinco homologia Src 3 (SH3) domínios. Quanto mais tempo isoforma de ITSN também contém homologia Dbl (DH) e homologia pleckstrin (PH) domínios que atuam em conjunto como um fator de troca de nucleotídeos guanina para Cdc42 15. Esta estrutura modular promove proteína: interações de proteínas e faz ITSN um candidato ideal para experimentos BiFC. A localização subcelular de ITSN pode alterar os seus parceiros de ligação e, portanto, alterar as rotas regulamentada pelo ITSN (unpublished de dados). Recentemente, nosso laboratório demonstrou que ITSN regula a sobrevivência neuronal através da regulamentação de um romance de classe II PI3K, PI3K-C2β 11. O domínio amino-terminal Pro-rica de PI3K-C2β contém dois sítios de ligação para SH3 ITSN de domínios. Usando co-imunoprecipitação com ITSN e mutantes PI3K-C2β truncamento demonstramos que SH3A ITSN e domínios SH3C interagir com a região amino-terminal da PI3K C2β. Em seguida, utilizamos BiFC para visualizar a localização subcelular deste complexo. ITSN foi fundida ao amino-terminal de Vênus (PFLAG-VN173) e PI3K-C2β constrói fundido a carboxi-terminal de Vênus (PHA-VC155). Como outro controle negativo, um peptídeo não-específica foi fundida a PHA-VC155. VN-ITSN e VC-PI3K C2β formado um complexo com uma distribuição BiFC pontuam (Figura 2A, painéis superiores). Mutações no domínio Pro-rica de PI3K-C2β que perturbam co-precipitação de ITSN e PI3K-C2β diminuiu o sinal BiFC (Figura 2A, painéis inferiores) 11. Esta diferença de sinal entre BiFC ITSN e os dois PI3K C2β-proteínas não foi devido a diferenças na expressão da proteína (Figura 2B). <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> . Figura 1 Em BiFC, um fluoróforo (neste caso, Venus) é dividido em aminoácidos (VN) - e carboxi (VC)-terminal termina. Esses fins são fundidos para duas proteínas de interesse. Quando as duas proteínas interagem, os fragmentos VN e VC re-associar resultando em reconstituição do fluoróforo e fluorescência nos locais de interação. BiFC é um exemplo específico do ensaio complementação protéica fragmento (PCA) utilizado para medir proteína: interações proteína 5. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. ITSN e PI3K-C2β formar um complexo BiFC. A. VN-tagged ITSN foi co-tranfected com VC-tagged PI3K-C3β WT ou um domínio rico em prolina mutante (PI3K-C2β-PA). ITSN e WT forma PI3K-C2β um complexo (verde). PCP (vermelho) foi usado como um controle de transfecção B. A Western blot foi realizada para demonstrar a expressão de igualdade dos construtos. O VC-tagged construções são HA marcados. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643table1.jpg" alt="Tabela 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabela 1"> Tabela 1. Existem vários vetores que são compatíveis com BiFC. YN155: 1-155aa de YFP; YC155: 155-238aa de YFP; YN173: 1-172aa de YFP; YC173, 173-238aa de YFP; VN155: 1-154aa de Vênus; VC155: 155-238 de Vênus; VN173: 1-172aa de Vênus; VC173: 173-238aa de Vênus; CN155 1-154aa do PCP; CC155 155-238aa do PCP, GN173: 1-172aa da GFP, CitN155: 1-155aa de Citrino, CitC155: 155-238aa de citrino, CitN173: 1-172aa de Citrino, CitC173: 173-238aa de Citrino, CerN173: 1-172aa de Cerulean 2,3,9.

<ol><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+molecular+interactions+by+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40, 61-66 (2006).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein-protein+interactions+by+protein+fragment+complementation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies.</a> Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).</li>
<li>Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+strategies+to+delineate+MAP+kinase+signaling+pathways+using+protein-fragment+complementation+assays+%28PCA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA).</a> Methods. 40, 287-293 (2006).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li>
<li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li>
<li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).</li>
<li>Martin, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+regulates+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis%2C+ubiquitylation%2C+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling.</a> Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).</li>
<li>Das, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuron+survival+through+an+intersectin-phosphoinositide+3%27-kinase+C2beta-AKT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway.</a> Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).</li>
<li>Mohney, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+activates+Ras+but+stimulates+transcription+through+an+independent+pathway+involving%5BTitle%5D)+AND+%22JNK.+J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving.</a> JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).</li>
<li>Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+can+regulate+the+Ras%2FMAP+kinase+pathway+independent+of+its+role+in+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).</li>
<li>Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+an+adaptor+protein+involved+in+clathrin-mediated+endocytosis%2C+activates+mitogenic+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways.</a> J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).</li>
<li>O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogenesis+and+endocytosis%3A+What%27s+at+the+INTERSECTIoN%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN?</a> Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

BiFC é um excelente método para a visualização de proteínas: interações de proteínas em células inteiras e determinar a localização subcelular desses complexos. As vantagens de BiFC são de que apenas as proteínas que interagem são fluorescentes, as interações transitórias são estabilizadas, e pós-processamento dos dados de imagem é mínima. Duas desvantagens deste método são o tempo de maturação para a fluoróforo ea irreversibilidade do complexo fluoróforo. Em algumas aplicações este irreversibilidade pode ser usado como...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>Placas com fundo de vidro e poços microliter</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-14C</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>Falcon BD</td><td>35-3846</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina</td><td>Invitrogen</td><td>18324020</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM510 META</td><td></td></tr></tbody></table>

complementação de fluorescência bimolecular

Bimolecular Fluorescence Complementation

Definir a distribuição subcelular de complexos de sinalização é imprescindível para a compreensão de que a saída do complexo. Métodos convencionais, tais como imunoprecipitação não fornecem informações sobre a localização espacial dos complexos. Em contraste, BiFC monitora a interação e compartimentalização subcelular de complexos de proteínas. Neste método, uma proteína fluororescent é dividido em amino-e carboxi-terminal não-fluorescentes fragmentos que são então fundidas para duas proteínas de interesse. Interação das proteínas resulta na reconstituição do fluoróforo (Figura 1) 1,2. Uma limitação do BiFC é que uma vez que o fluoróforo fragmentada é reconstituído o complexo é irreversível 3. Esta limitação é vantajoso na detecção de interações transitória ou fraco, mas impede uma análise cinética da dinâmica complexa. Uma advertência adicional é que o flourophore reconstituído requer 30min para amadurecer e fluorescentes, mais uma vez impedindo a observação de interações em tempo real 4. BiFC é um exemplo específico do ensaio complementação protéica fragmento (APC), que emprega proteínas repórter como o verde variantes proteína fluorescente (BiFC), diidrofolato redutase, b-lactamase, e luciferase para medir proteína: interações de proteínas 5,6. Métodos alternativos para o estudo de proteínas: as interações das proteínas nas células incluem fluorescência co-localização e transferência de energia de ressonância Förster (FRET) 7. Para co-localização, duas proteínas são individualmente marcados diretamente com um fluoróforo ou por imunofluorescência indireta. No entanto, esta abordagem leva a fundo elevado de proteínas não-interativas que torna difícil de interpretar co-localização de dados. Além disso, devido aos limites de resolução da microscopia confocal, duas proteínas podem aparecer co-localizadas, sem necessariamente interagir. Com BiFC, a fluorescência é observada somente quando as duas proteínas de interesse interagem. FRET é outro método excelente para estudar proteínas: interações de proteínas, mas pode ser tecnicamente desafiadora. FRET experimentos requerem o doador e receptor seja de brilho semelhantes e estequiometria na célula. Além disso, deve-se conta de sangrar através do doador para o canal receptor e vice-versa. Ao contrário FRET, BiFC tem pouco fundo de fluorescência, o pós-processamento de dados de imagem pouco, não exige a superexpressão de alta, e pode detectar interações fracas ou transitórios. Bioluminescência transferência de energia de ressonância (BRET) é um método semelhante ao FRET exceto o doador é uma enzima (luciferase, por exemplo) que catalisa um substrato para se tornar bioluminescente, assim, uma emocionante aceitador. BRET falta a problemas técnicos de sangrar através fluorescência de fundo e alta, mas não tem a capacidade de fornecer informação espacial, devido à falta de localização do substrato para compartimentos específicos 8. No geral, BiFC é um excelente método para a visualização de localização subcelular de complexos de proteínas para obter insights sobre sinalização compartimentada.

A localização subcelular de proteínas é importante para determinar a regulação espaço-temporal de sinalização celular. Aqui, descrevemos complementação bimolecular de fluorescência (BiFC) como um método simples para monitorar as interações espaciais de proteínas na célula.

Complementação de fluorescência bimolecular

Definir a distribuição subcelular de complexos de sinalização é imperativo para a compreensão do resultado desse complexo. Métodos convencionais, tais como...

Este experimento tem como objetivo definir se duas proteínas interagem em células e delinear aspectos dos sítios dessa interação. Primeiro, as células são transfectadas com construtos de expressão que codificam as duas proteínas de interesse, sendo que uma delas é fundida ao extremo N de uma proteína fluorescente fragmentada e a outra ao extremo C complementar da proteína fluorescente fragmentada. Após permitir que as células transfectadas desenvolvam sinal fluorescente em cultura, os complexos proteicos são visualizados por meio de imagem e imunoblotagem.Em seguida, as imagens coletadas são exportadas para softwares de análise de imagem, como o Image J, com o objetivo de quantificar a intensidade média de fluorescência por célula. Em um experimento controlado, os resultados de BIFC podem demonstrar interações entre proteínas e a localização desses complexos, como os domínios SH3 da proteína de sustentação (scaffold) intersectina e o domínio rico em prolina da PI3KC2β. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como colocalização, imunoprecipitação e FRET, é que o BFC permite a localização espacial de interações fracas e transitórias na célula. Além disso, este método não exige um processamento extensivo das imagens, como ocorre com o FRET.Este método pode abordar questões fundamentais na área de transdução de sinal, como se as proteínas X e Y interagem, e, em caso afirmativo, quais são os compartimentos específicos aos quais esses complexos se localizam na célula? Geralmente, iniciantes neste método enfrentarão dificuldades porque não escolheram a configuração adequada para expressar sua biópsia. Proteínas marcadas de interesse iniciam-se pela seleção de um dos múltiplos fluoróforos para as proteínas de fusão BIFC.Considere que as extremidades amino e carboxi terminais da Venus são capazes de formar um complexo a 37 graus Celsius, enquanto os fragmentos Y-F-P-B-I-F-C requerem uma pré-incubação a 30 graus Celsius. Projete vetores de expressão para a adição de marcadores nas proteínas de interesse, levando em conta como a ligação dos fragmentos BIFC pode afetar a função das proteínas de interesse. Por exemplo, a família RAs, as GTPases são modificadas por lipídios na extremidade carboxi terminal e não podem ser marcadas nessa extremidade sem interromper essa modificação.Sempre realize experimentos piloto para determinar as condições de transfeção. Além disso, acompanhe as células por microscopia de fluorescência para identificar um tempo ideal para o desenvolvimento do sinal. Em seguida, realize análise por western blot para confirmar a expressão igualitária dos construtos.Importante imunomarcar o marcador HA ou flag para verificar se a adição dos fragmentos BIFC não altera a localização celular das proteínas de interesse em cada placa de amostra. Semear 1,3 × 10⁵ células em cada placa de fundo de vidro e em dois poços de uma placa de seis poços e deixar as células se aderirem durante a noite em um incubador a 37 °C; no dia seguinte, preparar os DNAs para transfeção por lipofecção ou outro método preferido.Primeiro, dilua o DNA em 250 microlitros de DMEM sem soro como controle de transfeção. Adicione CFP na proporção de um para cinquenta, em relação à quantidade total dos seus DNAs BIFC. Agora, dilua o lip em 250 microlitros de DMEM sem soro, utilizando 10 microlitros de lip por um micrograma de DNA.Misture as diluições de DNA e lipídeo e incube à temperatura ambiente por 20 minutos. Lave as células duas vezes com DMEM sem soro aquecido. Adicione dois mililitros de DMEM sem soro a cada placa com fundo de vidro ou poço de uma placa de seis poços.Em seguida, divida igualmente cada mistura de transfeção entre um recipiente com fundo de vidro e duas cavidades de uma placa de seis poços. Incube as células a 37 graus Celsius por cinco horas. Por fim, remova o meio de transfeção e substitua por meio DMEM completo acrescido de 10% de soro bovino fetal (FBS).Incube as células pelo tempo determinado em experimentos pilotos para obter os níveis necessários de expressão das proteínas de interesse. Examine as células transfectadas em um microscópio fluorescente de epifluorescência para garantir que o controle positivo esteja fluorescente. Lave as células três vezes com PBS para a aquisição de imagens de células vivas.Coloque as células em meio sem corantes indicadores. Para aquisição de imagens de células fixadas, adicione paraformaldeído 2% e coloque no gelo por 10 minutos.Em seguida, lave as células três vezes com PBS, agora cobertas com um mililitro de PBS, e armazene no escuro a quatro graus Celsius, lisando imediatamente as células na placa de seis poços. Para análises de Western blot, é importante que todas as células sejam preparadas ao mesmo tempo, de modo que as células lisadas sejam representativas das células utilizadas na imagem. Realize um Western blot para garantir que as proteínas marcadas sejam expressas em níveis equivalentes.Ao realizar a imagem de células com um microscópio confocal, é importante manter as configurações constantes durante todo o experimento para que a fluorescência seja comparável entre as amostras. Certifique-se de imaginar células individuais em que os pixels não estejam saturados. Como CFP foi incluído como controle de transfeção, selecione apenas células positivas para CFP para análise dos sinais de BIFC.Quantifique a fluorescência utilizando um software de imagem, como o ImageJ. Abra os arquivos de imagem no ImageJ. Vá até Analisar e defina as medições. Marque as caixas de área e valor médio de cinza na caixa de medições. Observe que, neste exemplo, as imagens venosas foram coloridas artificialmente de verde e as imagens de CFP, coloridas artificialmente de vermelho.Usando a ferramenta de seleção manual, desenhe um contorno ao redor da borda de toda a célula no canal CFP, mantendo esse contorno no lugar. Alterne para o canal YFP. Vá até analisar e meça o valor médio de cinza, que reflete a intensidade média de fluorescência por célula para cada imagem.Desenhe um círculo no canal YFP em uma área que não contenha uma célula. Faça uma medição dessa área como fundo. Subtraia o fundo de cada imagem.Por fim, para calcular a intensidade média de fluorescência para uma população de células, faça a média do valor médio da graduação subtraído do fundo para todas as células imagiadas em uma amostra. Idealmente, quantifique 60 células ao longo de três experimentos. A proteína de sustentação multidomínio intersectina regula a sobrevivência neuronal por meio da regulação de uma nova classe dois de fosfatidilinositol três quinase, PI três KC dois beta. Os domínios SH três da intersectina interagem com a região rica em prolina do terminal amino de PI três KC dois beta. A transfeção de intersectina marcada com VN juntamente com PI três KC dois beta marcada com VC resulta em um sinal fluorescente no canal YFP, que é pseudocolorido em verde, indicando a formação do complexo.CFP pseudo-colorido aqui em vermelho é usado como controle para marcar células transfectadas; mutações no domínio rico em prolina da PI três KC dois beta, que interrompem a co-precipitação da intersectina e da PI três KC dois beta, reduzem o sinal de BIFC. Essa diferença no sinal de BIFC não se deve a diferenças na expressão das proteínas tipo selvagem e PA PI três K. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três dias, se executada corretamente. Ao realizar este procedimento, é necessário lembrar-se de incluir os controles apropriados e verificar a expressão proteica para garantir que as diferenças no sinal de BC se devam à formação do complexo e não à expressão proteica após este procedimento.Outras técnicas, como o plasma de superfície em residentes, podem ser realizadas para responder perguntas como: quais são as diferentes afinidades desses complexos entre si?

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular fornece um método quantitativo de alto rendimento para estudar a interação proteína-proteína. Esta metodologia pode ser aplicada ao mapeamento de locais de ligação de proteína e para o rastreio de factores que regulam a interacção proteína-proteína.

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A formação de complexos de proteína in vivo, podem ser visualizados por fluorescência bimolecular complementação. Parceiros de interacção são fundidas com as peças complementares de marcas fluorescentes e transitoriamente expressa em folhas de tabaco, resultando num sinal fluorescente reconstituído na estreita proximidade das duas proteínas.

Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

As interações proteína-proteína são visualizadas em células com resolução espacial nanométrica combinando complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) com microscopia de localização fotoativada (PALM). Descrito aqui é o uso de BiFC-PALM para interações Ras-Raf de imagem em células U2OS para visualizar o agrupamento em nanoescala e difusão de complexos Ras-Raf individuais.

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Este manuscrito descreve o protocolo para a purificação de afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP). Este novo método facilita o isolamento específico e caracterização proteômica a jusante de algum duas proteínas interagindo, enquanto excluir un-complexado proteínas individuais, bem como os complexos formados com concorrentes parceiros de ligação.

Dissecando a proteínas multi sinalização complexos pela purificação da afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP)

Este protocolo descreve caspase Bimolecular complementação de fluorescência (BiFC); um método baseado em imagens que pode ser usado para visualizar induzida proximidade das caspases de iniciador, que é o primeiro passo para sua ativação.

Iluminando os caminhos para a ativação de Caspase usando fluorescência Bimolecular complementação

Este protocolo demonstra o uso do ensaio de ligadura de proximidade para sondar interações proteína-proteína in situ na germinação C. elegans.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline usando Ensaio de Ligação de Proximidade

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