Name: Microscopia intravital do Baço: Análise Quantitativa da Mobilidade Parasite e do fluxo sanguíneo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Aprenda microscopia intravital quantitativa para analisar a mobilidade de parasitas de malária e o fluxo sanguíneo no baço usando camundongos infectados com parasitas transgênicos GFP. Este método permite comparar dinâmicas de cepas PULE.

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Estamos particularmente gratos ao S. Graewe e Heussler V. para a formação inicial e contínua de entrada em microscopia intravital de parasitas da malária, a J. Burns para a doação de parasitas GFP transgênicos, a A. Bosch (Unidade Confocal, CCIT-UB, IDIBAPS) de assistência em análise de imagem e quantificação e P. Astola para assistência técnica. Agradecemos a R. e I. Tous Caralt para produção de vídeo. MF é um receptor de uma bolsa de pós-graduação da Generalidade da Catalunha. HAP é um professor e pesquisador ICREA. Trabalho no laboratório de HAP é financiado pelo Programa da Comunidade Europeia Sétimo Programa-Quadro (FP7/2007-2013), sob subvenção N ° 242095, pela Fundação Privada Cellex (Catalunha, Espanha), e pelo Ministério espanhol da Ciência e Inovação ( SAF2009-07760).

<ol><li>Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+malaria+parasites--recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).</li>
<li>Heussler, V., Doerig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+enters+parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging enters parasitology.</a> Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).</li>
<li>Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+malaria+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22in+the+dermis+of+the+mammalian%22%5BJournal%5D)">Imaging malaria sporozoites.</a> in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).</li>
<li>Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+malaria+parasite+in+the+skin+of+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).</li>
<li>Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+host+hepatocytes+by+the+malaria+parasite+for+delivery+into+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids.</a> Science. 313, 1287-1290 (2006).</li>
<li>Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+host+cell+modifications+of+Plasmodium+falciparum+blood+stages+in+four+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions.</a> Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).</li>
<li>Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+spleen+remodelling+in+Plasmodium+yoelii+infections+in+Balb%2Fc+mice+facilitates+adherence+and+spleen+macrophage-clearance+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape.</a> Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).</li>
<li>Linden, M. vander, R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Plasmodium+berghei+reference+line+that+constitutively+expresses+GFP+at+a+high+level+throughout+the+complete+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein.</a> 173, 33-38 (1996).</li>
<li>Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li>
<li>Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+erythrocyte+velocity+and+retinal+blood+flow+using+adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Bowdler, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBowdler%2C+AJ+%22The+complete+spleen%22">The complete spleen</a>. , Totowa. Humana Press. (2002).</li>
<li>Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+comparing+T+lymphocyte+trafficking+to+the+spleen+and+the+mesenteric+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).</li>
<li>Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).</li>
<li>Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+splenic+control+of+murine+malaria%3A+reticular+cell+activation+and+the+development+of+a+blood-spleen+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier.</a> Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).</li>
<li>Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li>
<li>Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+fluorescent+intravital+microscopy+of+the+murine+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen.</a> J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).</li>
<li>Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+guide+T+lymphocyte+entry+into+and+migration+within+the+splenic+T+cell+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone.</a> J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A implementação da microscopia intravital do baço, neste modelo de malária de roedor abriu a possibilidade de investigar a passagem dinâmica de parasitas através deste órgão, que até agora tem sido considerada uma &quot;caixa-preta&quot;, devido a considerações técnicas. Aqui, um grande esforço foi colocado para adaptar um método quantitativo que permite a análise comparativa das diferentes linhas de parasita nos níveis individual e populacional. Em contraste com outros tecidos e células que tinham sido fotografados ant...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Leica TCS-SP5 microscópio confocal </td><td> Leica Microsystems, Heidelberg, Alemanha </td><td> TCS-SP5 n º de série. 5100000419 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamina (Ketolar 50 mg / ml) </td><td> Pfizer </td><td> 631028 </td><td></td></tr><tr><td> Midazolam 15 ml mg / 3 </td><td> Normon </td><td> 838193 </td><td></td></tr><tr><td> 70.000 MW Dextran, conjugado com Texas Red </td><td> Sondas moleculares </td><td> D1830 </td><td></td></tr><tr><td> Isotiocianato de fluoresceína, isômero I (FITC) </td><td> Sigma </td><td> F7250 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Sigma </td><td> H1399 </td><td></td></tr><tr><td> Giemsa </td><td> Sigma </td><td> GS1 </td><td> Solução de trabalho é de 10% em água destilada </td></tr><tr><td> Super Glue-3 Loctite </td><td> Loctite </td><td> 9975-0880 </td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia intravital do baço: análise quantitativa da mobilidade parasite e do fluxo sanguíneo

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

O advento da microscopia intravital em modelos de malária experimental de roedores tem permitido grandes avanços para o conhecimento de parasita-hospedeiro 1,2 interações. Assim, em imagem in vivo de parasitas da malária durante a pré-eritrocítica estágios revelaram a entrada ativa de parasitas da pele em nós linfáticos 3, o desenvolvimento completo do parasita na pele 4, ea formação de um hepatócito merosome derivados para garantir a migração e liberação de merozoítos na corrente sanguínea 5. Além disso, o desenvolvimento de parasitos nos eritrócitos foi recentemente documentado usando imagens 4D e desafiou a nossa visão atual sobre a exportação de proteínas em malária 6. Assim, imagens intravital mudou radicalmente a nossa opinião sobre eventos-chave no desenvolvimento de Plasmodium. Infelizmente, os estudos da passagem dinâmica de parasitas da malária através do baço, um órgão linfóide importante primorosamente adaptada para limpar infectados vermelho bcélulas lood faltam devido a limitações técnicas. Utilizando o modelo murino de malária Plasmodium yoelii em camundongos Balb / c, temos implementado imagem intravital do baço e relatou uma remodelação diferencial dele e aderência de glóbulos vermelhos parasitados (pRBCs) às células de origem fibroblástica barreira na polpa vermelha durante a infecção com o parasita não-letal de linha P.yoelii 17x em oposição a infecções letais com o 17XL P.yoelii linha parasita 7. Para chegar a estas conclusões, uma metodologia específica usando o software livre ImageJ foi desenvolvido para permitir a caracterização do movimento tridimensional rápida de single-pRBCs. Resultados obtidos com este protocolo permite determinar a direcionalidade, velocidade e tempo de residência de parasitas no baço, todos os parâmetros referentes a adesão in vivo. Além disso, relatamos a metodologia de quantificação do fluxo sanguíneo através de microscopia intravital eo uso de diferendiferentes corantes para obter insights sobre a estrutura da microcirculação complexas do baço. Declaração de Ética Todos os estudos com animais foram realizados no biotério da Universidade de Barcelona, ​​em conformidade com as diretrizes e protocolos aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Barcelona-UB CEEA (Protocolo n º DMAH: 5429). Feminino camundongos Balb / c de 6-8 semanas de idade foram obtidos a partir Charles River Laboratories.

Nós mostramos o método para a realização de microscopia intravital do baço usando parasitas da malária transgênica GFP ea quantificação da mobilidade do parasita e do fluxo sanguíneo dentro do órgão.

Microscopia intravital do Baço: Análise Quantitativa da Mobilidade Parasite e do fluxo sanguíneo

O advento da microscopia intravital em modelos experimentais de malária em roedores permitiu avanços significativos no conhecimento das interações parasita-hospedeiro 1,2. ...

Neste procedimento, apresentamos uma abordagem quantitativa de microscopia intravital para avaliar a dinâmica da passagem do parasita pelo baço. Em um modelo de malária em roedor, camundongos infectados com parasitas transgênicos GFP são preparados para microscopia intravital, e a canulação da veia esplênica permitirá a injeção de corantes intravitais. Durante o experimento, células fluorescentes são visualizadas em movimento em diferentes regiões do baço.Apresentamos a metodologia para descrever a mobilidade do parasita no compartimento lento tridimensional do baço e calcular o fluxo sanguíneo nos vasos. Esses parâmetros foram utilizados para comparar a dinâmica esplênica de duas linhagens de PULE. Olá a todos.Meu nome é Nando El Portillo e uma das principais questões de pesquisa no meu laboratório é tentar compreender o papel do baço na malária. A esplenomegalia é um dos marcos desta doença, mas devido a questões técnicas e éticas, realizar estudos sobre este órgão é muito difícil. Para tanto, desenvolvemos tecnologias que nos permitem observar a passagem dinâmica deste parasita e quantificar esse fenômeno.É isso que Lorena e MI explicarão nestes protocolos. Esta pesquisa está se

intravital-microscopy-spleen-quantitative-analysis-parasite-mobility

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

In vivo de imagens de parasitas Leishmania transgênicas em um host ao vivo

Microscopia intravital para seguir temporal e espacial eventos inflamatória e hemodinâmica na microcirculação pial.

Microscopia intravital da Microcirculação cérebro de camundongo usando uma janela fechada Cranial

Este vídeo demonstra um ensaio para quantificar o crescimento intracelular de parasitas em macrófagos derivados da medula óssea (BMMs). As células de macrófagos estão infectadas com os estágios invasivos móveis e imóveis de Leishmania, promastigotas metacíclicos e amastigotas, respectivamente. Os parasitas invadem os macrófagos, internalizando-se em um vacúolo parasitóforo e se multiplicando em seu interior. O crescimento do parasita intracelular é quantificado usando um microscópio após a...

Um ensaio in vitro para quantificar o crescimento intracelular do parasita em macrófagos

Um método para o isolamento de leucócitos aderentes inflamatórios dos vasos sanguíneos do...

Isolamento e Análise de Cérebro-sequestrados de Leucócitos<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA infectadas Mice

Este artigo relata um método detalhado para a medição dinâmica e quantificação da velocidade do fluxo sanguíneo dentro dos vasos sanguíneos individuais da vasculatura hepática de camundongo usando imagens de microscopia intravital em combinação com uma metodologia específica para aquisição e análise de imagens.

Microscopia intravital Imagem do Fígado seguinte<em&gt; Leishmania</em&gt; Infecção: Uma Avaliação de hepáticas Hemodinâmica

Os invade parasita da malária e repetições dentro das células vermelhas do sangue. A avaliação precisa da invasão merozoite e parasitemia é fundamental para avaliar o curso da infecção da malária. Aqui nós descrevemos um protocolo de citometria de fluxo com base para a medição desses parâmetros em um modelo de rato da malária.

A avaliação in vivo de Rodent Plasmodium parasitemia e Merozoito Invasion por citometria de fluxo

Esta aplicação simplificada de microscopia intravital de veias mesentérias em camundongos pode ser usada em diferentes modelos de inflamação para observar as interações leucócitos-endoteliais e plaquetas-leucócitos.

Interações Intravital Microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial Veias Ratos

Descrevemos um modelo de camundongo de malária cerebral experimental e mostramos como a patologia inflamatória e microvascular pode ser rastreada in vivo usando ressonância magnética.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology em um Modelo de Malária Cerebral Experimental Usando Ressonância Magnética

Devido às semelhanças marcantes do ciclo de vida e biologia de parasitas da malária de roedores para parasitas da malária humana, modelos de malária de roedores tornaram-se indispensáveis para a pesquisa da malária. Neste documento, padronizamos algumas das técnicas mais importantes utilizadas na análise fenotípica de espécies selvagens e transgênicas de malária por roedores.

Análise fenotípica de roedores malária parasita assexuada e estágios do sangue sexual e estágios do mosquito

Todas as espécies de Leishmania patogênicas residem e replicam no interior de macrófagos de seus hospedeiros vertebrados. Aqui, apresentamos um protocolo para infectar murino macrófagos derivados da medula óssea em cultura com Leishmania, seguido por quantificação exacta da cinética de crescimento intracelular. Esse método é útil para estudar os fatores individuais que influenciam a interação patógeno-hospedeiro e virulência de Leishmania .

Quantificação de crescimento intracelular dentro de macrófagos é um rápido e confiável método para avaliar a virulência de Leishmania parasitas

Aprenda microscopia intravital quantitativa para analisar a mobilidade de parasitas de malária e o fluxo sanguíneo no baço usando camundongos infectados com parasitas transgênicos GFP. Este método permite comparar dinâmicas de cepas PULE.

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