Microscopia intravital do Baço: Análise Quantitativa da Mobilidade Parasite e do fluxo sanguíneo

Neste procedimento, mostramos uma abordagem de microscopia intravital quantitativa para avaliar a dinâmica da passagem do parasita pelo baço. Em um modelo de malária de roedores, camundongos infectados com parasitas transgênicos GFP são preparados para microscopia intravital da canulação da veia do baço para permitir a injeção de corantes intravitais. Durante o experimento, as células fluorescentes são imagens que se movem em diferentes áreas do baço.

Fornecemos a mitologia para descrever a mobilidade do parasita no compartimento lento tridimensional da polpa vermelha e calcular o fluxo sanguíneo dos vasos. Esses parâmetros foram usados para comparar a dinâmica do baço de duas cepas de PULE. Olá a todos.

Meu nome é Nando El Portillo e uma das principais questões de pesquisa em meu laboratório é tentar entender o papel do baço na malária. A esplenomegalia S é um dos marcos desta doença, mas devido a questões técnicas e éticas tentar abordar estudos deste órgão é muito difícil. Para isso, possibilitamos tecnologias que nos permitem ver a passagem dinâmica desse parasita e quantificar esse fenômeno.

É isso que Lorena e MI explicarão nesses protocolos. Esta pesquisa está sendo conduzida em parte em colaboração com os grupos do Dr. Ler da Universidade de Hamburgo, na Alemanha, e da Dra. Maria Kbo aqui no hospital Clinic e recebeu o financiamento geral do Cellex encontrado e da CIA ministerial A infecção pelo Español é iniciada a partir do Doador M infectado com parasitas GFP letais ou não letais a 10% do parasita. Para verificar o parasita, pegue uma pequena gota de sangue da veia da cauda do rato e estenda-a em um microscópio.

Deslize uma coloração métrica de chole com GIMs. Uma solução permitirá a visualização de glóbulos vermelhos infectados depois de secos, fixar o esfregaço de sangue com metanol por dois minutos, aplicar GIMs uma solução e incubar por 20 minutos. Lave a lâmina com água da torneira atual e enumere a seco a porcentagem de pbcs sobre o total de hemácias usando um microscópio óptico com cem x óleo. Objetivo.

Infectar camundongos com parasitas letais ou não letais obtidos do sangue da cauda de camundongos doadores diluídos em PBS. Ajuste a dose para injetar meio milhão de parasitas por camundongo, a fim de atingir um parasita periférico de 1% no terceiro dia pós-infecção e injete Intraperitoneal. Alternativamente, as hemácias marcadas com FITC podem ser usadas no controle.

Os animais coletam um mililitro de sangue arterial de um camundongo e lavam o pellet por centrifugação em PBS contendo EDTA, respanam em solução FITC e incubam por duas horas no escuro com agitação suave. Após esse tempo, remover o sobrenadante por centrifugação e lavar extensivamente. Injete em um camundongo de controle para obter uma média de 1% na circulação periférica e prossiga para experimentos in vivo.

Olá, eu sou mija. Para obter imagens do baço in vivo, precisamos realizar uma pequena sinergia do animal para expor o baço em uma técnica obviamente assim. Aprendi com Stephanie GR no laboratório do trabalhador Heisler, a quem gostaria de agradecer e agora vou mostrar como proceder.

Imagem da miose infectada Realizado no terceiro dia Pós-infecção, quando o parat é de 1% em ambas as cepas. Mantenha o mouse anestesiado e em temperatura regulada durante todo o procedimento. Proteja os olhos da hidratação e verifique se o mouse está completamente anestesiado fazendo ping na almofada do pé antes de prosseguir, a fim de facilitar a administração intravenosa de substâncias.

Durante o curso do experimento, canule a veia da cauda do camundongo para construir a cânula. Insira uma pequena agulha em uma extremidade de um tubo e seu aplicador na outra. Carregue a cânula com solução salina fisiológica removendo bolhas e verifique se a solução flui corretamente através da cânula.

A veia lateral da cauda será canulada limpa. Melhore sua visibilidade fazendo uma constrição suave na base da cauda. Introduza a ponta da cânula dentro da veia.

O aparecimento de sangue indicará que a agulha está bem posicionada. Se não estiver, repita a canulação a montante da veia e, em seguida, fixe a cânula na cauda usando cola e fita adesiva. Exponha a parte inferior do baço através de uma pequena incisão na pele e musculatura no lado dorsal esquerdo do animal.

Coloque um baço onde menos movimento da respiração é observado e aplique PBS na superfície exposta para mantê-lo limpo do cabelo do rato e hidratado. Sele o baço com uma cobertura de sono para permitir a visualização. Olá, meu nome é Lorena.

O protocolo mostrado nos permitirá visualizar o movimento dos parasitas PULI através do baço. Isso foi possível graças aos parasitas transgênicos GFP. Por favor, doe por James Burnes da Drexel University.

A imagem do movimento de parasitas fluorescentes nos permitirá saber se há diferença no comportamento entre cepas letais e não letais. Os experimentos de microscopia Vidal foram realizados em microscópio multifotônico Leica, equipado com sistema de incubação com controle de temperatura e objetiva de glicerol 63 x. Coloque o animal no palco do microscópio com uma tampa do baço do sono voltada para baixo para a objetiva. Inicialmente.

A visualização do baço em ampliações mais baixas fornecerá uma visão geral da estrutura microcirculatória do órgão. Concentre o baço usando parasitas GFP de tecido autofluorescente são observados passando pelas diferentes áreas do baço. Olá, meu nome é Maria Albo dos Centros Científicos e Tecnológicos da Universidade de Barcelona, e faremos imagens intravitais do baço.

Para estudar o fluxo sanguíneo e a mobilidade dos glóbulos vermelhos infectados, usaremos um microscópio confocal equipado com uma varredura ressonante que permite imagens de alta velocidade que são muito úteis para evitar o movimento do órgão. Este é um microscópio espectral que permite selecionar o alcance da visão. Para obter imagens muito rápidas, faremos a aquisição simultânea das duas fluoresceínas, marcações e reflexão.

Selecione diferentes zonas para obter imagens com a ajuda de corantes de hemácias, reflexão, contraste e Vidal para evidenciar a microvasculatura do baço. Vamos agora explicar como medir a mobilidade do parasita no fluxo sanguíneo dos vasos usando a microscopia Vidal e o software de imagem J para acompanhar o movimento do parasita na malha tridimensional da polpa vermelha. Adquira imagens através de cinco profundidades Z usando um modo de digitalização de alta velocidade.

Converta pilhas de imagens em filmes coloridos codificados em Z para facilitar o rastreamento de uma única célula fluorescente. Informações detalhadas são fornecidas no texto, rastreie diferentes partículas ao longo do tempo na profundidade em cada vídeo usando coordenadas X, Y, Z e T, parâmetros de mobilidade, como direcionalidade, velocidade média e tempo de residência, podem ser calculados e representados como mapas de distribuição para permitir a análise comparativa entre as populações de deformação. O fluxo vascular no baço pode ser visualizado por injeção sistêmica de várias moléculas fluorescentes descritas na tabela de suporte, como a dextrina.

E usando contraste de reflexão eritrocitária endógena, escaneie o fluxo sanguíneo da linha central, ajustando os vasos horizontalmente na direção da varredura a laser e usando a média de linha aprimorada. Nessas imagens, as estrias resultantes do movimento das células serão usadas para calcular o fluxo sanguíneo, tirar imagens de vasos com diâmetros diferentes e ao longo do ciclo cardíaco para compensar as flutuações. O baço tem sido considerado uma caixa preta na pesquisa da malária e aqui desenvolvemos uma abordagem quantitativa de microscopia intravital para obter informações sobre a dinâmica da infecção do parasita e do fluxo sanguíneo neste órgão, permitindo-nos abordar questões biológicas importantes, como a adesão in vivo de glóbulos vermelhos infectados ao baço.

Obrigado e.