Name: Microscopia intravital do Baço: Análise Quantitativa da Mobilidade Parasite e do fluxo sanguíneo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Aprenda microscopia intravital quantitativa para analisar a mobilidade de parasitas de malária e o fluxo sanguíneo no baço usando camundongos infectados com parasitas transgênicos GFP. Este método permite comparar dinâmicas de cepas PULE.

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Estamos particularmente gratos ao S. Graewe e Heussler V. para a formação inicial e contínua de entrada em microscopia intravital de parasitas da malária, a J. Burns para a doação de parasitas GFP transgênicos, a A. Bosch (Unidade Confocal, CCIT-UB, IDIBAPS) de assistência em análise de imagem e quantificação e P. Astola para assistência técnica. Agradecemos a R. e I. Tous Caralt para produção de vídeo. MF é um receptor de uma bolsa de pós-graduação da Generalidade da Catalunha. HAP é um professor e pesquisador ICREA. Trabalho no laboratório de HAP é financiado pelo Programa da Comunidade Europeia Sétimo Programa-Quadro (FP7/2007-2013), sob subvenção N ° 242095, pela Fundação Privada Cellex (Catalunha, Espanha), e pelo Ministério espanhol da Ciência e Inovação ( SAF2009-07760).

<ol><li>Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+malaria+parasites--recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).</li>
<li>Heussler, V., Doerig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+enters+parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging enters parasitology.</a> Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).</li>
<li>Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+malaria+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22in+the+dermis+of+the+mammalian%22%5BJournal%5D)">Imaging malaria sporozoites.</a> in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).</li>
<li>Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+malaria+parasite+in+the+skin+of+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).</li>
<li>Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+host+hepatocytes+by+the+malaria+parasite+for+delivery+into+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids.</a> Science. 313, 1287-1290 (2006).</li>
<li>Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+host+cell+modifications+of+Plasmodium+falciparum+blood+stages+in+four+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions.</a> Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).</li>
<li>Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+spleen+remodelling+in+Plasmodium+yoelii+infections+in+Balb%2Fc+mice+facilitates+adherence+and+spleen+macrophage-clearance+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape.</a> Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).</li>
<li>Linden, M. vander, R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Plasmodium+berghei+reference+line+that+constitutively+expresses+GFP+at+a+high+level+throughout+the+complete+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein.</a> 173, 33-38 (1996).</li>
<li>Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li>
<li>Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+erythrocyte+velocity+and+retinal+blood+flow+using+adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Bowdler, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBowdler%2C+AJ+%22The+complete+spleen%22">The complete spleen</a>. , Totowa. Humana Press. (2002).</li>
<li>Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+comparing+T+lymphocyte+trafficking+to+the+spleen+and+the+mesenteric+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).</li>
<li>Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).</li>
<li>Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+splenic+control+of+murine+malaria%3A+reticular+cell+activation+and+the+development+of+a+blood-spleen+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier.</a> Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).</li>
<li>Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li>
<li>Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+fluorescent+intravital+microscopy+of+the+murine+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen.</a> J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).</li>
<li>Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+guide+T+lymphocyte+entry+into+and+migration+within+the+splenic+T+cell+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone.</a> J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A implementação da microscopia intravital do baço, neste modelo de malária de roedor abriu a possibilidade de investigar a passagem dinâmica de parasitas através deste órgão, que até agora tem sido considerada uma &quot;caixa-preta&quot;, devido a considerações técnicas. Aqui, um grande esforço foi colocado para adaptar um método quantitativo que permite a análise comparativa das diferentes linhas de parasita nos níveis individual e populacional. Em contraste com outros tecidos e células que tinham sido fotografados ant...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Leica TCS-SP5 microscópio confocal </td><td> Leica Microsystems, Heidelberg, Alemanha </td><td> TCS-SP5 n º de série. 5100000419 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamina (Ketolar 50 mg / ml) </td><td> Pfizer </td><td> 631028 </td><td></td></tr><tr><td> Midazolam 15 ml mg / 3 </td><td> Normon </td><td> 838193 </td><td></td></tr><tr><td> 70.000 MW Dextran, conjugado com Texas Red </td><td> Sondas moleculares </td><td> D1830 </td><td></td></tr><tr><td> Isotiocianato de fluoresceína, isômero I (FITC) </td><td> Sigma </td><td> F7250 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Sigma </td><td> H1399 </td><td></td></tr><tr><td> Giemsa </td><td> Sigma </td><td> GS1 </td><td> Solução de trabalho é de 10% em água destilada </td></tr><tr><td> Super Glue-3 Loctite </td><td> Loctite </td><td> 9975-0880 </td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia intravital do baço: análise quantitativa da mobilidade parasite e do fluxo sanguíneo

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

O advento da microscopia intravital em modelos de malária experimental de roedores tem permitido grandes avanços para o conhecimento de parasita-hospedeiro 1,2 interações. Assim, em imagem in vivo de parasitas da malária durante a pré-eritrocítica estágios revelaram a entrada ativa de parasitas da pele em nós linfáticos 3, o desenvolvimento completo do parasita na pele 4, ea formação de um hepatócito merosome derivados para garantir a migração e liberação de merozoítos na corrente sanguínea 5. Além disso, o desenvolvimento de parasitos nos eritrócitos foi recentemente documentado usando imagens 4D e desafiou a nossa visão atual sobre a exportação de proteínas em malária 6. Assim, imagens intravital mudou radicalmente a nossa opinião sobre eventos-chave no desenvolvimento de Plasmodium. Infelizmente, os estudos da passagem dinâmica de parasitas da malária através do baço, um órgão linfóide importante primorosamente adaptada para limpar infectados vermelho bcélulas lood faltam devido a limitações técnicas. Utilizando o modelo murino de malária Plasmodium yoelii em camundongos Balb / c, temos implementado imagem intravital do baço e relatou uma remodelação diferencial dele e aderência de glóbulos vermelhos parasitados (pRBCs) às células de origem fibroblástica barreira na polpa vermelha durante a infecção com o parasita não-letal de linha P.yoelii 17x em oposição a infecções letais com o 17XL P.yoelii linha parasita 7. Para chegar a estas conclusões, uma metodologia específica usando o software livre ImageJ foi desenvolvido para permitir a caracterização do movimento tridimensional rápida de single-pRBCs. Resultados obtidos com este protocolo permite determinar a direcionalidade, velocidade e tempo de residência de parasitas no baço, todos os parâmetros referentes a adesão in vivo. Além disso, relatamos a metodologia de quantificação do fluxo sanguíneo através de microscopia intravital eo uso de diferendiferentes corantes para obter insights sobre a estrutura da microcirculação complexas do baço. Declaração de Ética Todos os estudos com animais foram realizados no biotério da Universidade de Barcelona, ​​em conformidade com as diretrizes e protocolos aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Barcelona-UB CEEA (Protocolo n º DMAH: 5429). Feminino camundongos Balb / c de 6-8 semanas de idade foram obtidos a partir Charles River Laboratories.

Nós mostramos o método para a realização de microscopia intravital do baço usando parasitas da malária transgênica GFP ea quantificação da mobilidade do parasita e do fluxo sanguíneo dentro do órgão.

Microscopia intravital do Baço: Análise Quantitativa da Mobilidade Parasite e do fluxo sanguíneo

O advento da microscopia intravital em modelos experimentais de malária em roedores permitiu avanços significativos no conhecimento das interações parasita-hospedeiro 1,2. ...

Neste procedimento, apresentamos uma abordagem quantitativa de microscopia intravital para avaliar a dinâmica da passagem do parasita pelo baço. Em um modelo de malária em roedor, camundongos infectados com parasitas transgênicos GFP são preparados para microscopia intravital, e a canulação da veia esplênica permitirá a injeção de corantes intravitais. Durante o experimento, células fluorescentes são visualizadas em movimento em diferentes regiões do baço.Apresentamos a metodologia para descrever a mobilidade do parasita no compartimento lento tridimensional do baço e calcular o fluxo sanguíneo nos vasos. Esses parâmetros foram utilizados para comparar a dinâmica esplênica de duas linhagens de PULE. Olá a todos.Meu nome é Nando El Portillo e uma das principais questões de pesquisa no meu laboratório é tentar compreender o papel do baço na malária. A esplenomegalia é um dos marcos desta doença, mas devido a questões técnicas e éticas, realizar estudos sobre este órgão é muito difícil. Para tanto, desenvolvemos tecnologias que nos permitem observar a passagem dinâmica deste parasita e quantificar esse fenômeno.É isso que Lorena e MI explicarão nestes protocolos. Esta pesquisa está sendo conduzida em parte em colaboração com os grupos do Dr. Ler, da Universidade de Hamburgo, na Alemanha, e da Dra. Maria Kbo aqui no Hospital Clínic, e recebeu financiamento geral da fundação Cellex e do órgão ministerial CIA. A infecção em espanhol é iniciada a partir de um doador M infectado com parasitas GFP letais ou não letais a 10% de parasita. Para verificar o parasita, retire uma pequena gota de sangue da veia da cauda do camundongo e estenda-a sobre um microscópio.Deslize uma coloração métrica com GIMs. Uma solução permitirá a visualização de hemácias infectadas após secagem; fixe o esfregaço sanguíneo com metanol por dois minutos, aplique a solução de GIMs e incube por 20 minutos. Lave a lâmina com água corrente da torneira e seque. Enumere a porcentagem de GBs sobre o total de hemácias utilizando um microscópio óptico com objetivo de 100x com imersão em óleo.Infecte camundongos com parasitas letais ou não letais obtidos do sangue da cauda de camundongos doadores diluídos em PBS. Ajuste a dose para injetar meio milhão de parasitas por camundongo, a fim de atingir um parasita periférico de 1% no terceiro dia pós-infecção, e injete por via intraperitoneal. Alternativamente, hemácias marcadas com FITC podem ser usadas como controle.Os animais coletam um mililitro de sangue arterial de um camundongo e lavam o pellet por centrifugação em PBS contendo EDTA, seguido pela incubação em solução de FITC por duas horas no escuro com agitação suave. Após esse período, remova o sobrenadante por centrifugação e lave extensivamente. Injete em um camundongo controle para atingir em média 1% na circulação periférica e prossiga para experimentos in vivo.Olá, eu sou a Mija. Para obter imagens do baço in vivo, precisamos realizar uma pequena cirurgia no animal para expor o baço; obviamente, nesta técnica. Aprendi com Stephanie GR no laboratório de Worker Heisler, a quem gostaria de agradecer, e agora vou mostrar a vocês como proceder.Imagem do mioma infectado realizada no terceiro dia pós-infecção, quando a parasitemia é de 1% em ambas as cepas. Mantenha o camundongo anestesiado e em temperatura regulada durante todo o procedimento. Proteja os olhos da desidratação e verifique se o camundongo está completamente anestesiado pressionando a planta do pé antes de prosseguir, a fim de facilitar a administração intravenosa de substâncias.Durante o experimento, cânule a veia da cauda do camundongo para construir a cânula. Insira uma agulha pequena em uma extremidade de um tubo e seu aplicador na outra extremidade. Encha a cânula com solução salina fisiológica removendo as bolhas e verifique se a solução flui corretamente através da cânula.A veia lateral da cauda será canulada com precisão. Aumente sua visibilidade fazendo uma leve constrição na base da cauda. Introduza a ponta da cânula dentro da veia.A presença de sangue indicará que a agulha está bem posicionada. Caso contrário, repita a canulação a montante da veia, em seguida fixe a cânula à cauda usando cola e fita adesiva. Exponha a parte inferior do baço por meio de uma pequena incisão na pele e na musculatura do lado dorsal esquerdo do animal.Posicione um baço onde menos movimento respiratório é observado e aplique PBS sobre a superfície exposta para mantê-lo livre dos pelos do camundongo e hidratado. Sobre o baço, coloque um lamínula para permitir a visualização. Olá, meu nome é Lorena.O protocolo mostrado permitirá visualizar o movimento de parasitas PULI através do baço. Isso foi possível graças a parasitas transgênicos GFP. Doação gentil de James Burnes da Universidade Drexel.A imagem do movimento de parasitas fluorescentes nos permitirá saber se existem diferenças no comportamento entre cepas letais e não letais. Os experimentos de microscopia intravital foram realizados em um microscópio multiphotônico Leica, equipado com um sistema de incubação com controle de temperatura e uma objetiva de glicerol de 63 x. Coloque o animal sobre a platina do microscópio com uma lamínula cobrindo o baço voltado para baixo, em direção à objetiva. Inicialmente.A visualização do baço em aumentos menores fornecerá uma visão geral da estrutura microcirculatória do órgão. Foque o baço utilizando a autofluorescência do tecido; parasitas GFP são observados passando pelas diferentes áreas do baço. Olá, meu nome é Maria Albo dos Centros Científicos e Tecnológicos da Universidade de Barcelona, e realizaremos imagem intravital do baço.Para estudar o fluxo sanguíneo e a mobilidade de hemácias infectadas, utilizaremos um microscópio confocal equipado com varredura ressonante, que permite imagens de alta velocidade, muito úteis para evitar o movimento do órgão. Trata-se de um microscópio espectral que permite selecionar a faixa de visão. Para obter imagens muito rapidamente, realizaremos a aquisição simultânea das duas marcações com fluoresceína e da reflexão.Selecione diferentes zonas para imagem com a ajuda de hemácias, reflexão, contraste e corantes Vidal para evidenciar a microvasculatura do baço. Agora explicaremos como medir a mobilidade do parasita no fluxo sanguíneo dos vasos utilizando microscopia Vidal e o software ImageJ para acompanhar o movimento do parasita na rede tridimensional da polpa vermelha. Adquira imagens através de cinco profundidades Z usando um modo de varredura de alta velocidade.Converta pilhas de imagens em filmes coloridos codificados por Z para facilitar o rastreamento de células fluorescentes individuais. Informações detalhadas são fornecidas no texto para rastrear diferentes partículas ao longo do tempo em profundidade em cada vídeo; utilizando as coordenadas X, Y, Z e T, parâmetros de mobilidade como direcionalidade, velocidade média e tempo de residência podem ser calculados e representados como mapas de distribuição para permitir análise comparativa entre populações de cepas. O fluxo vascular no baço pode ser visualizado por injeção sistêmica de várias moléculas fluorescentes descritas na tabela suplementar, como a dextrina.E, utilizando o contraste de reflexão de eritrócitos endógenos, escaneie o fluxo sanguíneo da linha central ajustando os vasos horizontalmente na direção da varredura a laser e usando a média de linhas aprimorada. Nessas imagens, as trilhas resultantes das células em movimento serão usadas para calcular o fluxo sanguíneo; obtenha imagens de vasos com diferentes diâmetros e ao longo do ciclo cardíaco para compensar flutuações. O baço tem sido há muito considerado uma caixa preta na pesquisa da malária, e aqui desenvolvemos uma abordagem quantitativa de microscopia intravital para obter informações sobre a dinâmica da infecção parasitária e do fluxo sanguíneo neste órgão, permitindo-nos responder a questões biológicas importantes, como a aderência in vivo de hemácias infectadas ao baço.Obrigado e.

intravital-microscopy-spleen-quantitative-analysis-parasite-mobility

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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