Microscopia intravital da Microcirculação cérebro de camundongo usando uma janela fechada Cranial

O objetivo geral deste procedimento é estudar a microcirculação no cérebro de camundongos por microscopia intravital, que permite rastrear mudanças dinâmicas nos marcadores hemodinâmicos e inflamatórios na microcirculação da pilha por longos períodos de tempo. Esta técnica foi desenvolvida no Instituto de Bioengenharia La Jolla, onde foi utilizada para diversos tipos de estudos. Por exemplo, o acompanhamento de alterações hemodinâmicas durante o curso da infecção por plasmodium burgi onca e no momento da expressão da malária cerebral.

Isso é feito implantando primeiro uma janela craniana crônica duas semanas antes dos estudos de microscopia intravital. A segunda etapa do procedimento é registrar a morfologia geral da janela craniana usando uma imagem digital de alta resolução com baixa ampliação. A terceira etapa do procedimento é adquirir imagens de microscopia intravital usando iluminação convencional e fluorescente e selecionar locais de estudo específicos para medições on-line do diâmetro do vaso e da velocidade das hemácias.

A etapa final do procedimento é realizar a análise intravital da aderência de leucócitos e plaquetas nos vasos da pilha por meio de anticorpos específicos marcados com fluorescência. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram in vivo alterações microcirculatórias em modelos de espelhamento cerebral de condições fisiológicas fisiopatológicas ou doentes por meio de microscopia intravital cerebral para estabelecer alterações hemodinâmicas associadas a essas condições. A principal vantagem desta técnica é que observamos o cérebro em seu ambiente fisiológico sem expô-lo a agentes externos ou meio artificial, microscopia intravital em comparação com imagem, ressonância magnética e angiografia tem uma resolução espacial e temporal e nos permite olhar do nível microscópico para o microscópico.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave na fisiologia e fisiopatologia da microcirculação cerebral, como alterações hemodinâmicas e inflamatórias durante doenças agudas e crônicas Duas a três semanas antes da microscopia intravital. Uma craniotomia é realizada em camundongos de oito a 10 semanas de idade é demonstrada anteriormente, exceto que uma barra de titânio não é colocada na cabeça do animal. A janela craniana crônica é uma preparação estável, permitindo o exame da microcirculação da pilha mesmo meses após ser implantada no dia do experimento.

Primeiro, verifique a temperatura corporal do animal antes de colocá-lo em uma estrutura estereotáxica infundida com eritrócitos marcados com fluorescência previamente preparados através da veia da cauda do camundongo. Isso permitirá o rastreamento de eritrócitos, que será demonstrado posteriormente. Em seguida, anestesifique levemente o mouse com isof flúor.

4% para indução, um a 2% para manutenção. Em seguida, coloque o animal em decúbito ventral em uma estrutura estereotáxica em uma almofada de aquecimento. Prenda a cabeça cuidadosamente usando as barras auriculares e ajuste o nível usando as alavancas direita e esquerda.

Limpe suavemente a lamínula da janela craniana com um cotonete umedecido com óleo mineral. Em seguida, usando um microscópio estéreo conectado a uma câmera digital, tire algumas fotos panorâmicas dos vasos sob a janela. Após transferir as fotos panorâmicas para um computador, selecione a melhor para ser impressa, identificada e datada.

Esta foto será usada como um mapa para medições do diâmetro do vaso e das velocidades dos glóbulos vermelhos, que serão demonstradas a seguir para iniciar a microscopia intravital. Transfira o mouse para um estágio de microscópio intravital personalizado. Coloque uma gota de água na janela craniana aproveitando o poço formado pelo acrílico dental.

Uma objetiva de imersão em água de 20 x com abertura numérica de 0,5 é usada. As imagens são gravadas usando duas câmeras, uma câmera digital de baixa luminosidade e alta velocidade conectada a um computador e monitor e uma câmera analógica de baixa luminosidade conectada a uma fita de videocassete, um carimbo de data/hora e um monitor colorido antes de selecionar os vasos para medição, verifique os vasos para avaliar a qualidade da preparação e se o sangue está fluindo em todos os vasos, Em seguida, selecione os recipientes a serem medidos. Eles devem incluir locais e artérias de diferentes diâmetros e cobrir diferentes locais dentro da área exposta pela janela.

Em nosso experimento, selecionamos 12 vasos para medição à medida que você visualiza vários campos dentro da janela craniana. Para selecionar os vasos, anote a localização precisa de cada ponto a ser medido na foto da vasculatura PY que foi tirada anteriormente para cada ponto, o diâmetro do vaso é medido usando um dispositivo de cisalhamento de imagem. Uma vez selecionado o local, a imagem do vaso é alinhada na posição vertical e a imagem é cortada até o oposto.

Os extremos são alinhados e a leitura é documentada. Para rastreamento de eritrócitos, cada ponto é gravado pela câmera digital por pelo menos 30 segundos, e as imagens de vídeo são gravadas a 150 quadros por segundo. Essa taxa é definida para obter de uma a seis imagens de uma célula em um quadro de vídeo para determinação de velocidades de até seis milímetros por segundo.

Uma vez concluída a coleta de dados, remova o mouse da estrutura estereotáxica e devolva-o à gaiola para se recuperar da anestesia usando o software apropriado. As imagens de vídeo adquiridas são digitalizadas e XY. Os dados de coordenadas para cada imagem de célula são obtidos. As posições das células são determinadas manualmente e não por análise de imagem.

Dado que o olho de um observador treinado dá uma boa estimativa da localização do centro de uma célula, que em geral corresponde à localização da fluorescência máxima observada. Para a maioria das orientações celulares, são feitas determinações de posição e velocidade para 15 células em cada vaso. Uma média para obter a velocidade média das hemácias, uma vez que as medições do diâmetro do vaso e da velocidade das hemácias estejam disponíveis.

O cálculo do fluxo sanguíneo em cada vaso pode ser feito usando a fórmula Q igual a D sobre dois vezes ao quadrado PI vezes V, onde Q é igual ao fluxo sanguíneo V é igual à velocidade das hemácias e D é igual ao diâmetro do vaso para avaliação da profusão e análise da aderência dos leucócitos em vasos em pêlos. A microscopia intravital é realizada em um animal infundido com uma mistura de albumina marcada com FSE e anticorpos contra o marcador de leucócitos pan CD 45 marcado com Texas Red. A albumina marcada com fluorescência permite uma melhor visualização da rede vascular, incluindo vasos penetrantes e é particularmente útil em estados de doença, como malária cerebral, para verificar se há vasos não perfundidos ou subperfundidos.

Os anticorpos anti CD 45 marcados com fluorescência facilitam a identificação e a quantificação do rolamento de leucócitos e a adesão aos vasos de pêlo. A quantificação da adesão leucocitária é feita contando o número de leucócitos em um comprimento de vaso de 100 mícrons. O rolamento é quantificado contando o número de leucócitos viajando a uma velocidade significativamente mais lenta que a velocidade do sangue no mesmo comprimento de 100 mícrons durante 30 segundos. Mostrado.

Aqui está um exemplo de medições microvasculares da velocidade dos glóbulos vermelhos por rastreamento celular a partir de fluorescência de alta velocidade. As imagens de gravação de vídeo de A a F são imagens de sequência da microcirculação. Cada imagem representa a posição de um único glóbulo vermelho fluindo, que é capturado quadro a quadro pela câmera de alta velocidade.

Este gráfico de um experimento representativo mostra as mudanças no fluxo sanguíneo da pilha ao longo do tempo. Em camundongos infectados com plasmódio, burgi, onca e em camundongos de controle não infectados, enquanto em camundongos de controle, o fluxo sanguíneo da pilha é relativamente estável ao longo do tempo. Os camundongos infectados com PBA mostram uma diminuição do fluxo sanguíneo no mercado em um momento de desenvolvimento da malária cerebral.

No sexto dia, a coloração com anticorpos fluorescentes vermelhos anti CD 45 do Texas revela um grande número de leucócitos aderidos a vasos de pilha de um camundongo infectado com plasmodium burgi onca. Este procedimento tem uma ampla gama de aplicações além do trabalho aqui hoje. Qualquer técnica óptica que possa ser usada in vivo pode ser adaptada a este modelo e parâmetros como tecido, nível de oxigênio do tecido, espécies de oxigênio reativas ao pH e interação endotelial com leucócitos podem ser estudados neste modelo.