Quantificação de crescimento intracelular dentro de macrófagos é um rápido e confiável método para avaliar a virulência de Leishmania parasitas

O objetivo geral deste experimento é avaliar a virulência de várias cepas de Leishmania através da infecção de macrófagos derivados da medula óssea murina in vitro e a subsequente quantificação da cinética de crescimento intracelular do parasita. Este método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave sobre os fatores do macrófago do hospedeiro e do patógeno que determinam a virulência dos parasitas infecciosos de Leishmania. A principal vantagem dessa técnica é que é um método rápido, econômico e confiável que requer significativamente menos animais, em comparação com estudos in vivo.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia da leishmaniose, pois pode ser usada para avaliar a infectividade de cepas mutadas de Leishmania ou a eficácia de compostos terapêuticos. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de isolamento de macrófagos derivados da medula óssea e quantificação de parasitas intracelulares são difíceis de aprender apenas com protocolos escritos. Comece prendendo um camundongo fêmea de quatro a seis semanas a uma placa de dissecação e desinfetando o animal com etanol a 70%.

Use uma tesoura para fazer uma incisão de um centímetro perto de uma articulação do quadril e corte a pele ao redor da articulação. Puxe a pele da perna em direção ao tornozelo para desenluvar cuidadosamente o membro e corte o pé na articulação do tornozelo ou abaixo dela para deixar a tíbia intacta. Para localizar a articulação do quadril, manipule o fêmur para identificar o ponto de rotação e use a tesoura para cortar a perna acima da articulação do quadril, deixando a cabeça proximal do fêmur intacta.

Remova o máximo possível de músculo e tecido conjuntivo da perna e coloque os ossos limpos em uma placa de Petri contendo RPMI estéril suplementado com antibióticos no gelo. Depois de colher o segundo conjunto de ossos da perna, use uma pinça esterilizada e uma lâmina número dez para remover qualquer músculo e tecido conjuntivo restantes. Transfira os ossos limpos para uma tampa de placa de Petri vazia e use o bisturi para remover as duas extremidades de cada tíbia para acessar a medula.

Usando uma pinça, coloque uma tíbia sobre a boca de um tubo cônico de 50 mililitros no gelo e insira a ponta de uma agulha de calibre 25 presa a uma seringa de 10 mililitros cheia de meios suplementados com antibióticos em uma extremidade da tíbia. Lave aproximadamente cinco a 10 mililitros de meio através do osso no tubo cônico até que todo o tecido vermelho da medula óssea tenha sido colhido e o osso pareça branco. Quando toda a medula tiver sido coletada, centrifugue a medula óssea agrupada e ressuspenda a paleta de células da medula óssea em cinco mililitros de meio macrófago derivado da medula óssea.

Transfira a suspensão de células da medula óssea para um frasco de cultura de células de 175 centímetros quadrados contendo 60 mililitros de meio macrófago estéril derivado da medula óssea e enxágue o tubo duas vezes com o meio do frasco de cultura para garantir a recuperação celular máxima. Após a segunda lavagem, transferir uma alíquota de células de 30 mililitros para um segundo balão de cultura de células de 175 centímetros quadrados e fechar cada balão com uma tampa de filtro. Em seguida, incube ambas as culturas durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir a separação dos macrófagos residentes de quaisquer fibroblastos contaminantes ou outras células aderentes.

Na manhã seguinte, transfira 10 mililitros de sobrenadante contendo células indiferenciadas da medula óssea de cada frasco para placas de Petri de poliestireno não tratadas com cultura de tecidos individuais de 100 por 15 milímetros e retorne as células à incubadora de cultura de células por mais dois a três dias. Em seguida, alimente as culturas com cinco mililitros de meio macrófago fresco derivado da medula óssea a 37 graus Celsius por prato e devolva as placas à incubadora. No sétimo ou oitavo dia após a cultura, use uma ponta de aspiração instalada em uma linha de vácuo para transferir quatro lamínulas de vidro de 12 milímetros esterilizadas em autoclave para o fundo de cada poço de uma placa de cultura de seis poços sem sobreposição.

Prepare placas idênticas para cada ponto de tempo do experimento. Em seguida, lave as culturas de macrófagos derivados da medula óssea duas vezes com PBS fresco a 37 graus Celsius e cinco mililitros de PBS sem cálcio e magnésio suplementados com um EDTA milimolar em cada placa. Após cinco minutos a 37 graus Celsius, agrupe as células destacadas em um tubo cônico de 50 mililitros, enxaguando cada placa duas vezes com mais cinco mililitros de PBS sem cálcio e magnésio.

Após a centrifugação, ressuspenda os macrófagos em cinco a 10 mililitros de meio macrófago fresco derivado da medula óssea em gelo. Após a contagem, dilua as células para cinco vezes 10 elevado a quinto por mililitro de concentração em meio macrófago fresco derivado da medula óssea e adicione dois mililitros de células por poço à placa de seis poços. Em seguida, incube as células durante a noite na incubadora de cultura de células.

Para infectar as células com L. amazonesis, diluir a suspensão do parasita para a multiplicidade experimental apropriada de infecção e adicionar 50 a 100 microlitros de parasitas a cada poço de todas as seis placas de poço, incluindo todos os pontos de tempo do experimento. Incubar os macrófagos derivados da medula óssea durante o período de infecção e a temperatura adequados. Em seguida, lave os poços três vezes com dois mililitros de PBS fresco a 37 graus Celsius sem cálcio ou magnésio por poço e fixe as amostras iniciais com 1,5 a 2 mililitros de paraformaldeído a 2% por 10 minutos.

Para as placas correspondentes aos pontos de tempo posteriores, adicione dois mililitros de meio macrófago derivado da medula óssea fresca a cada poço e retorne as placas à incubadora apropriada. Em seguida, fixe e lave as células para cada um dos pontos de tempo restantes, como acabamos de demonstrar, e armazene as amostras a quatro graus Celsius em PBS fresco. Para corar as células com DAPI, substitua o sobrenadante por 1,5 mililitros de PBS fresco sem cálcio e magnésio, suplementado com detergente não iônico a 0,1% por 10 minutos em temperatura ambiente, seguido de três lavagens de dois mililitros com PBS sem cálcio ou magnésio.

Em seguida, core as células com dois microgramas por mililitro de DAPI em um mililitro de PBS por uma hora em temperatura ambiente. Após três lavagens, coloque as lamínulas com o lado da célula voltado para baixo na lâmina de microscópio de vidro individual montada com um reagente de montagem anti-desbotamento comercial. Em seguida, para quantificar o número de células infectadas, use a objetiva de óleo de emersão 100x de um microscópio de fluorescência e um contador manual para identificar o número de núcleos amastigotas menores agrupados em torno de cada grande núcleo corado com DAPI.

Leishmania tem duas formas infecciosas, promastigotas metacíclicos, que se diferenciam dos promastigotas pró-cíclicos na fase estacionária da cultura, e amastigota, a forma infectante intracelular encontrada no hospedeiro vertebrado. Aqui, amastigotas diferenciadas axenicamente podem ser visualizadas dentro de um macrófago derivado da medula óssea uma hora após a infecção inicial e antes da formação de vacúolos parasitóforos via fusão fagolisossômica. Às 48 horas, podem ser observados grandes vacúolos parasitóforos distintos com múltiplos parasitas, característicos de uma infecção virulenta por Leishmania.

Os promastigotas de fase logarítmica não virulentos, em contraste, são incapazes de iniciar o desenvolvimento do vacúolo parasitóforo, não conseguem se replicar e são eventualmente mortos dentro dos macrófagos do hospedeiro. Neste experimento, um aumento constante no número de parasitas metacíclicos intracelulares de Leishmania do tipo selvagem foi observado até 72 horas após a infecção, enquanto pouco ou nenhum crescimento intracelular para parasitas mutantes com uma importação de ferro mitocondrial prejudicada foi medido, sugerindo que a atividade mitocondrial é necessária para o crescimento do parasita dentro dos macrófagos. As infecções por macrófagos realizadas com amastigotas axênicas selvagens e mutantes mostraram um padrão de crescimento intracelular semelhante ao observado com promastigotas metacíclicos, mas com uma infectividade parasitária do tipo selvagem ainda maior do que a observada em promastigotas metacíclicos.

É importante notar que há um atraso inicial de 24 horas para infecções por promastigotas metacíclicos, representando o tempo necessário para que os promastigotas metacíclicos internalizados se diferenciem primeiro em amastigotas antes de começar a se replicar. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 15 dias se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante usar as cepas de camundongos apropriadas e realizar uma quantificação cuidadosa das células de macrófagos e parasitas para garantir MOIs consistentes em todos os experimentos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar macrófagos derivados da medula óssea e infectá-los com Leishmania para quantificação de seu crescimento de parasitas intracelulares, após coloração nuclear com DAPI. Não se esqueça de que trabalhar com Leismania pode ser extremamente perigoso e que precauções como usar uma cabine de segurança biológica e equipamentos de proteção individual e evitar instrumentos pontiagudos devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.