Name: Análise de Frutas volátil Usando um Nariz Eletrônico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprenda a analisar compostos voláteis em frutas usando cromatografia ultra-rápida com sensor de onda acústica de superfície. Este método permite identificar diferenças relacionadas à variedade, maturação e armazenamento.

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Os autores agradecem Bill Copes (Harris Seed Company Moran, Davis) para fornecimento de frutos de melão para esta análise. Este projecto é apoiado pelo Programa de Investigação de Culturas Especialidade Initiative Grants Competitiva conceder nenhum. 2009-51181-05783 do USDA National Institute of Food and Agriculture.

1. Preparação da Amostra <ol><li> Frutos da colheita na fase de maturidade desejado. Lavar com água da torneira, a fim de remover a sujidade e poeira. </li><li> Selecione frutos para análise com base na ausência de defeitos internos e externos, e homogeneidade de tamanho. </li><li> Cortar frutas longitudinalmente em fatias para ser usados ​​para a amostragem volátil. Se for o caso, retire a pele, sementes, tecidos da cavidade de sementes, ou cova. Seleção tecido de frutos deve ser consistente durante todo o experimento e ter em conta a variabilidade dentro de uma única fruta (isto é, obter amostra igualmente da flor, equatorial e peças finais tronco). </li><li> Combine o tecido de frutos selecionado, misturá-lo, a fim de embaralhar e pesar 200 g em um liquidificador. </li><li> Adicionar 200 mL de solução saturada de CaCl2 solução (372,5 g, a 20 ° C, em 500 mL de água desionizada) e 50 uL de uma solução 100 mM de 2-metilbutilo isovalerato em metanol. O 2 CaCl destina-se a actuar como um inibidor de ac enzimáticaca, que pode ocorrer após o corte e homogeneização da carne de fruta. 2-metilbutilo isovalerato é adicionado como um padrão interno para a monitorização de eventuais perdas de compostos voláteis durante o processo de homogeneização. </li><li> Homogeneizar mistura em um misturador de laboratório (Waring, EUA), durante 30 segundos a 18.000 rpm, em seguida, imediatamente verter em frasco de vidro e de vedação com a tampa de teflon. Manter o homogeneizado no frasco à temperatura ambiente, até que todas as amostras são preparadas. </li><li> Após o vazamento do homogenato dentro da garrafa, esperar 10 minutos para permitir a separação da espuma a partir do líquido, em seguida, de pipeta alíquotas de 5 ml de líquido, sem espuma, em 20 ml frascos de vidro âmbar e selar os frascos com tampas de rosca de aço equipado com Teflon / silicone septos. Este procedimento é adequado para a preparação melão e homogenato de pêra. Se outros frutos são usados ​​para a análise, um passo de centrifugação pode ser necessária. Portanto, remover a espuma e, em seguida, centrifugar o líquido para partículas de aglomerados que possamobstruir a pipeta. Preparar pelo menos três frascos por amostra para servir como técnica repetições. </li><li> Neste ponto, as amostras podem ser analisadas imediatamente ou flash-congelados em azoto líquido e armazenado a ultra-baixa temperatura (-80 ° C) para posterior análise. </li><li> Para amostras congeladas, no dia análise remover as amostras a partir do congelador e permitir-lhes a descongelar durante uma hora à temperatura ambiente. Após descongelação, e antes da análise, substituir a tampa do frasco com um novo que tem um septo, limpo e seco. Se o septo não é substituído, a água condensada sobre o septo durante o descongelamento pode ser arrastado para o instrumento e danificá-la. </li></ol> 2. Gas Chromatography onda acústica de superfície (SAW-GC) Set-up e Aquisição de Dados <ol><li> Carregar o método de análise apropriado na zNose. Para a análise do perfil de éster-rico volátil do melão, os nossos parâmetros na versão Microsense 5.44.22 software (Newbury Park, CA, EUA) são como segue: headspace de aspiração node entrada durante 20 segundos a 30 mL min -1 através da bomba; temperatura de entrada de 200 ° C; Tenax temperatura armadilha a 225 ° C, caudal de gás portador (pureza de hélio 99,999%) de 2,9 mL min-1; coluna (DB-5 coluna, 1 m × 0,25 milímetros ID programa de temperatura × 0,25 espessura da película mm) a partir de 45 ° C a 180 ° C a uma taxa de 10 ° C seg -1; válvula a 165 ° C; sensor de temperatura a 40 ° C O tempo de análise total é de 1 minuto por amostra. </li><li> Conectar uma agulha de aço inoxidável com não-coring ponta para a entrada zNose e purgar o sistema várias vezes com o ar ambiente até que a linha de base é estável e sem picos maiores do que 200 contagens (Ct) são detectados. </li><li> Ajustar o instrumento, utilizando uma solução de alcanos de cadeia linear (C6-C14). O resultado composição é utilizada pelo software do aparelho para converter o tempo de retenção dos picos eluídos a partir de unidades de tempo em Kovats Index (Kl) unidades. Por conseguinte, depois de o sistema é sintonizado, os tempos de retenção foram apresentados em unidades de KI. </li&gt; <li> Antes da análise, permitir que a amostra a equilibrar durante 30 minutos. Para analisar um dos frascos de amostra, inserir uma agulha no septo do frasco para aliviar a pressão. Em seguida, inserir a agulha ligada à entrada do instrumento para o septo do frasco e iniciar a amostragem headspace. Analise pelo menos três técnica repetições por amostra. </li><li> Iniciar manualmente o instrumento, clicando no botão &quot;Play&quot;, a ativação da bomba e retira os vapores apresentam acima da amostra. No final da análise, um cromatograma aparece no ecrã, e do sensor é automaticamente aquecida a 150 ° C durante 10 segundos para o limpar. Quando o sistema de botão de caixa de status fica verde novamente, o aparelho está pronto para analisar outra amostra. </li><li> Para garantir uma base estável e limpeza adequada do sistema, executar pelo menos um em branco ar entre cada amostra. Para monitorizar a contaminação possível volátil a partir do frasco ea tampa, analisar duas frasco de espaços em branco (frasco vazio com tampa), no início e no fim do dia. &lt;/ Li&gt; </ol> 3. Exportação de Dados e Análise <ol><li> Exportar os dados em um arquivo do Microsoft Excel após a aquisição utilizando o &quot;Peak registro&quot; em função Microsense software. Uma vez que os dados são exportados, adicionar colunas contendo rótulos para variáveis ​​e repetições. </li><li> Transformar o formato de dados para facilitar a manipulação usando o Python (versão 2.6; disponível gratuitamente on-line) script que desenvolvemos, com o nome &quot;reform_data.py&quot; (ver Figura 1 para um exemplo do formato de dados antes e depois de usar o script &quot;reform_data. py &quot;). O nome do arquivo de origem (formato xls) e nome da folha para os dados de entrada, bem como o nome do arquivo desejado para a saída (formato xls), são editados diretamente no script. </li><li> Iniciar &quot;kim_interface.py&quot; (também escrito em Python 2.6, ver Figura 2), e importar os dados do arquivo gerado no passo anterior. Especificamente, a análise baseia-se na visualização e analisando o número de vezes que cada valor de Ki foi detectado(&quot;Hits KI&quot;). Assim, o programa exibe um gráfico de barras de hits Ki para cada valor de KI. </li><li> Avaliar os hits KI de subconjuntos específicos de amostras, analisando cada grupo de técnicos replicado em conjunto. Para isso, analisar cada tratamento ou variável separadamente, marcando / desmarcando as caixas correspondentes. Ver legenda Figura 2 para uma descrição detalhada da interface gráfica do usuário (GUI) características. </li><li> Depois de identificar a largura de cada janela KI usando o GUI, escolher aleatoriamente alguns dos cromatogramas correspondentes em software Microsense e avaliar a sobreposição entre os picos do técnico repetições. Ver Figura 3 para um exemplo de cromatogramas sobrepostas de duas repetições técnica. </li><li> Quando a janela do KI é individuado, utilize o recurso &quot;mala direta&quot; disponível na GUI para mesclar as KIs que caem na janela, para o KI mais populosa. Ao usar esse recurso, os picos marcados com um intervalo de valores Ki são consolidadas em um único rótulo KI, allowing tratar esses picos como uma única variável. Para isso, primeiro clique no botão &#39;merge&#39; para ativar o recurso e selecione o KI mais populoso como o centro da janela ao clicar na barra correspondente. Uma vez que o bar tenha sido selecionado, ele muda de cor e ficar verde. Para mesclar os KIs que caem dentro da janela para o KI selecionado, botão direito do mouse sobre as barras correspondentes, o que faz com que as barras de vermelho, enquanto uma barra azul do comprimento correspondente é adicionado no topo do KI central (veja a Figura 4 ). Depois que todos os KIs selecionados foram incorporadas ao KI central adequado, clique no botão &#39;Mesclar&#39; novamente para aceitar as alterações, o que provoca o botão &quot;Mesclar&quot; a virar amarelo. Em caso de erros, o botão &#39;Separar &quot;também está disponível. Para desinstalar, clique no botão &quot;Separar&quot; no GUI, então botão direito do mouse sobre a barra vermelha que você deseja desinstalar. De vermelho, a barra fica azul. Clique no botão &quot;Separar&quot; botão novamente para aceitar as alterações. </li><li> Se alguém tenta incorrectly mesclar dois picos em uma única amostra em um valor único KI, uma mensagem de erro será impressa. Em tais circunstâncias, verificar rigorosamente o cromatograma e redefinir a janela de KI na região. </li><li> Depois de todas as operações de fusão foram realizados, salve o arquivo. </li><li> Antes de prosseguir com a análise estatística, os cromatogramas do ar e espaços em branco dos frascos são analisados ​​para monitorar possíveis contaminações. Uma vez que o KI dos picos nos espaços em branco foram identificados, subtrair a área do pico detectado no ar e / ou frasco em branco a partir da área do pico presente na amostra. Em seguida, proceder com a análise estatística. </li></ol> 4. Os resultados representativos O nariz eletrônico foi capaz de detectar diferenças nos perfis de voláteis entre melão, colhidos em diferentes estádios de maturação (Figura 5). Vinte KI janelas foram identificados em todas as amostras. Uma análise de variância mostrou que 14 picos DeteCTED pelo nariz eletrônico variou significativamente entre os estádios de maturação. Na Figura 6, o registro das áreas médias máximas de 14 componentes estes são plotados para mostrar diferenças na abundância de pico entre dois estágios de maturidade, cedo maduros e frutas maduras. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig1.jpg" /> Figura 1. Exemplos de formato de dados exportados a partir de software do aparelho (A) e após a transformação, realizada utilizando script &quot;reform_data.py&quot; (B). Para facilitar a manipulação de dados e análise, todas as KIs únicas são identificados através de todas as amostras, então os dados são reordenadas com informação da amostra em linhas e da área do pico em colunas, correspondentes a KIs únicas. Se um pico não for detectada por um valor de Ki numa amostra, a célula correspondente permanece vazio. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig2.jpg" /> Figura captura de tela 2. Do script arquivo &quot;kim_interface.py&quot;. O enredo no centro exibe o número de visitas por KI KI contra. &#39;Hit por Kl&#39; é o número de amostras em que um pico com que KI específica foi detectada. No lado esquerdo, existem três caixas amarelas que controlam os dados seleccionados. Eles exibem parâmetros para dividir o conjunto de dados (tratamentos, repetições, variáveis ​​qualitativas, etc.) Nessa figura, eles são (de cima para baixo): variedade, data de plantio e estádio de maturação na colheita. Na parte inferior: clicando nas barras 3 e movendo-se a barra de azul para a esquerda ou para a direita, um pode seleccionar o mínimo eo valor máximo da gama de KI, ea área de pico mínima (&#39;Limiar&#39;). À direita: o botão &quot;Mesclar&quot; permite fusão KIs selecionados manualmente clicando nas barras da parcela. O botão &quot;Separar&quot; permite inverter o processo para casos selecionados. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig3.jpg" /> Cromatogramas Figura 3. Sobrepostas (em<html> vermelho e preto), de duas repetições técnica de headspace melão volátil para ilustrar uma mudança no tempo de retenção. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig4.jpg" /> Figura 4. Exemplo de KI fusão procedimento. Na trama central, a barra verde (Central KI) representa o KI mais populosa, que foi escolhido como centro da janela KI. KI KI X e Y são KIs queda na janela de juros e elas precisam ser incorporadas ao KI central. Clicando na barra de KI X, ela torna-se vermelho e, ao mesmo tempo, uma barra azul do mesmo comprimento da barra de KI X, aparece na parte superior do um verde. Ao repetir o mesmo procedimento para KI Y, o comprimento da barra de azul (KIs Mesclados) aumentará o comprimento correspondente. Depois que todos os KIs foram adicionados, clicando no botão verde &quot;direta&quot;, termina o processo de fusão, as alterações são salvas, e a cor do botão fica amarelo. / Files/ftp_upload/3821/3821fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Dois cromatogramas das amostras de melão, colhidas em diferentes estádios de maturação precoce, madura (superior) e completamente maduras (inferior), para ilustrar a capacidade do nariz electrónico para detectar diferenças na abundância voláteis. <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig6.jpg" /> Figura 6. Enredo Radar mostrando a área do pico de 14 componentes presentes em duas amostras de melão em dois estádios de maturação diferentes, cedo maduros e totalmente maduros. As áreas de pico são relatados em escala logarítmica para ajudar a visualizar a comparação. Os números no final de cada raio representam os Índices de Kovats correspondentes.

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<li>Evans, M. B., Haken, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+the+gas-chromatographic+index+scheme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Recent developments in the gas-chromatographic index scheme.</a> Journal of Chromatography. 472, 93-127 (1989).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

Narizes eletrônicos representam um método promissor para a avaliação rápida e objetiva de perfis de aroma de frutas ou volátil ricas amostras. No entanto, se desloca em tempo de retenção representam um desafio para a identificação de pico e pode levar a erros de interpretação dos dados, quando dois cromatogramas não estão perfeitamente alinhados. A inspecção visual dos cromatogramas indicaram que a variabilidade de tempos de retenção entre as amostras frequentemente causada mesmo pico de ser rotulados com valores de Ki ligeiramente diferente (aproximadamente ± 10). Isso se traduziu em um número exagerado de KIs únicos detectados. A fim de tirar vantagem dos factos de que (a) compostos diferentes estão presentes em diferentes estádios de maturação e (b) técnico repetições são aproximadamente idênticas, dois scripts baseados em computador (&quot;kim_merge.py&quot;, que contém as rotinas para a manipulação dos dados conjunto, e &quot;kim_interface.py&quot;, que fornece uma interface gráfica de usuário (GUI)) foram desenvolvidos de forma sistemáticacomparar amostras de uma forma semi-automatizada, reduzindo significativamente o tempo necessário para análise cromatograma de grandes conjuntos de dados. Estes programas permitir a consolidação, se for caso disso, de picos marcados com uma gama de valores de Ki sob uma etiqueta KI único. Isso serve para duas finalidades importantes: (a) que permite uma análise estatística para tratar esses picos como uma única variável, e (b) que facilita a identificação de pico e comparação com outros sistemas e os valores publicados. Os resultados apresentados aqui indicam que as amostras de melão, puderam ser discriminados com base na maturidade e aroma utilizando o sistema de zNose em combinação com a identificação KI adequada. Isto representa uma nova tecnologia promissora para a análise de compostos voláteis que podem ser utilizados para os programas de controlo de qualidade.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio </td><td> MP Biomédica </td><td> 195088 </td><td></td></tr><tr><td> 2-metilbutilo isovalerato </td><td> SAFC global </td><td> W350613 </td><td> ≥ 98%, natural, FCC </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A411-4 </td><td></td></tr><tr><td> Vial </td><td> Sigma / Supelco </td><td> SU860098 </td><td></td></tr><tr><td> Capa </td><td> Sigma / Supelco </td><td> SU860101 </td><td></td></tr><tr><td> Laboratório de liquidificador </td><td> Waring Laboratório de Ciências </td><td> 7009G </td><td> 2 velocidades liquidificador, 1 - recipiente de vidro Litro </td></tr><tr><td> Garrafa </td><td> Fisher Scientific </td><td> 06-414-1C </td><td> Pyrex, 500 mL; polipropileno bujão de vedação- </td></tr><tr><td> Agulha </td><td> Tecnologia Sensor Eletrônico </td><td> TLC101046 </td><td> Side buraco luer </td></tr><tr><td> Solução Alcanos </td><td> Tecnologia Sensor Eletrônico </td><td></td><td> C6-C14 solução alcanos em metanol </td></tr><tr><td> zNose </td><td> Tecnologia Sensor Eletrônico </td><td> Modelo 4500 </td><td></td></tr><tr><td> DB-5 de coluna GC </td><td> Tecnologia Sensor Eletrônico </td><td> SYS4500C5 </td><td></td></tr><tr><td> Microsense </td><td> Tecnologia Sensor Eletrônico </td><td> Versão 5.44.22 </td><td></td></tr><tr><td> Python 2.6 </td><td></td><td></td><td> Disponível gratuitamente on-line </td></tr><tr><td> &quot;Reform_data.py&quot; e &quot;roteiros&quot; kim_interface.py</td><td></td><td></td><td> Scripts disponíveis como material suplementar em JOVE </td></tr></tbody></table>

análise de frutas volátil usando um nariz eletrônico

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Numerosas e diversas alterações fisiológicas ocorrer durante o amadurecimento de frutos, incluindo o desenvolvimento de uma mistura específica volátil que caracteriza aroma de fruta. Maturação na colheita é um dos principais fatores que influenciam a qualidade do sabor de frutas e vegetais 1. A validação de métodos robustos que avaliar rapidamente maturação e qualidade aroma permitiria uma melhor gestão de programas de melhoramento avançados, práticas de produção e manuseio pós-colheita. Ao longo das últimas três décadas, muitas pesquisas têm sido realizadas para desenvolver os chamados narizes eletrônicos, que são dispositivos capazes de detectar rapidamente os odores e sabores 2-4. Actualmente, existem vários comercialmente disponíveis narizes electrónicos capazes de realizar a análise volátil, com base em tecnologias diferentes. O nariz eletrônico usado em nosso trabalho (zNose, EST, Newbury Park, CA, EUA), consiste em ultra-rápido de cromatografia gasosa acoplada com um sensor de onda acústica de superfície (UFGC-SAW). Esta tecnologia já foi testada por sua capacidade de monitorar a qualidade de várias commodities, incluindo a detecção de deterioração da maçã 5; maturação e avaliação podridão em manga 6; perfil de aroma de espécies timo 7; C 6 compostos voláteis em bagos de uva 8; caracterização de óleo vegetal 9 e detecção de adulterantes em óleo de coco virgem 10. Este sistema pode executar as três etapas principais de análise aroma: headspace de amostragem, a separação de compostos voláteis, e de detecção. Em cerca de um minuto, a saída, um cromatograma, é produzida e, depois de um ciclo de purga, o aparelho está pronto para análise posterior. Os resultados obtidos com o zNose podem ser comparados com os de outros sistemas de gás-cromatográficos por cálculo dos Índices de Kovats (Kl). Uma vez que o instrumento foi ajustado com uma solução alcano padrão, os tempos de retenção são automaticamente convertidos emKIS. No entanto, pequenas alterações na temperatura e na taxa de fluxo Espera-se que ocorrem ao longo do tempo, fazendo com que os tempos de retenção à deriva. Além disso, dependendo da polaridade da fase de coluna estacionária, a reprodutibilidade dos cálculos Ki pode variar de acordo com as unidades de índice vários 11. Uma série de programas e interfaces gráficas foram desenvolvidas, portanto, comparar KIs calculadas entre amostras de uma forma semi-automatizada. Estes programas reduzir o tempo necessário para a análise cromatograma de grandes conjuntos de dados e minimizar o potencial para a interpretação errada dos dados quando cromatogramas não são perfeitamente alinhadas. Nós apresentamos um método para análise de compostos voláteis em frutas rápida. Procedimentos de preparação de amostras, aquisição de dados e manipulação também são discutidos.

Um método rápido para análise composto volátil na fruta é descrito. Os compostos voláteis presentes no espaço de topo de um homogenato da amostra são rapidamente separados e detectados com ultra-rápida cromatografia gasosa (GC) acoplado com uma onda acústica de superfície (SAW) do sensor. Um procedimento para manipulação de dados e análise também é discutida.

Análise de Frutas volátil Usando um Nariz Eletrônico

Inúmeras e diversas alterações fisiológicas ocorrem durante o amadurecimento dos frutos, incluindo o desenvolvimento de uma mistura volátil específica que caracteriza a fruta ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma análise rápida de compostos voláteis em frutas. Isso é realizado primeiramente cortando e homogeneizando o tecido da fruta. A seguir, a fase vapor acima da amostra líquida é analisada com o nariz eletrônico.Após a análise com o nariz eletrônico, os dados são exportados e transformados. A etapa final do procedimento consiste em identificar as janelas de índice covas e consolidar os picos sob um único rótulo de índice covas utilizando a interface gráfica. Em última análise, os resultados mostram que as diferenças na abundância de folículos de frutas, medidas com um nariz eletrônico, podem ser relacionadas a tratamentos experimentais, como variedade da fruta, maturação e armazenamento.A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como a cromatografia gasosa tradicional, é que ela permite uma análise mais rápida de compostos voláteis em frutas. Ao realizar esta análise, podem ocorrer pequenas alterações nos tempos de retenção dos analitos. Isso poderia levar à interpretação incorreta dos dados sem uma consideração cuidadosa do processo de alinhamento de picos.Após a colheita dos frutos no estágio desejado de maturação, enxágue-os com água da torneira. Para remover sujeira e poeira, selecione os frutos para análise. Com base na ausência de defeitos externos e internos e no tamanho, corte frutos homogêneos longitudinalmente em gomos para serem utilizados na coleta de compostos voláteis.Se aplicável, remova as sementes da casca, o tecido da cavidade das sementes ou frutos com caroço. A seleção do tecido deve ser consistente durante todo o experimento, e a variabilidade dentro de um único fruto deve ser considerada. Por exemplo, as amostras devem ser obtidas igualmente das regiões equatorial, da parte da flor e da parte da haste.Combine o tecido de fruta selecionado, misture para randomizar e, em seguida, pese 200 gramas em um liquidificador comercial. Adicione 200 mililitros de solução saturada de cloreto de cálcio. O cloreto de cálcio tem a finalidade de atuar como inibidor da atividade enzimática, que pode ocorrer após o corte e a homogeneização da polpa da fruta.Em seguida, adicione 50 microlitros de uma solução de 100 milimolar de dois metil butil isoato em metanol. Essa solução é adicionada como padrão interno para monitorar quaisquer perdas possíveis de compostos voláteis durante o processo de homogeneização. A seguir, homogeneíze a mistura em um liquidificador de laboratório por 30 segundos a 18.000 rpm.Em seguida, despeje imediatamente em um frasco de vidro e feche com uma tampa de teflon. Mantenha o homogeneizado no frasco até que todas as amostras sejam preparadas. Pipete alíquotas de cinco mililitros de suco sem espuma em frascos âmbar de vidro de 20 mililitros, preparando pelo menos três frascos por amostra.Para servir como réplicas técnicas. Feche os frascos com tampas metálicas rosqueadas equipadas com septos de silicone com teflon. Neste ponto, as amostras podem ser analisadas imediatamente ou congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas em temperatura ultra baixa para análise posterior.Carregue o método de análise apropriado no Xenos. Insira os parâmetros conforme indicado no protocolo escrito. Conecte uma agulha de aço inoxidável com ponta não perfurante à entrada do Xenos.Esvazie o sistema várias vezes com ar ambiente até que a linha de base esteja estável e não sejam detectados picos superiores a 200 contagens. Prepare-se para calibrar o instrumento inserindo uma agulha na septa de um frasco contendo uma solução de ácidos graxos de cadeia reta para aliviar a pressão. Em seguida, insira a agulha conectada à entrada do instrumento na septa.Realize a calibração iniciando a amostragem do espaço superior. O resultado da calibração é utilizado pelo software do instrumento para converter o tempo de retenção dos picos referidos de unidades de tempo para unidades de índice de covas ou KI. Consequentemente, após o sistema ser calibrado, os tempos de retenção são informados em unidades KI.Inicie a análise da amostra após a equilibrar por 30 minutos, inserindo as agulhas na septa do frasco da amostra. Como feito para a solução de ácidos graxos de cadeia linear. Inicie manualmente a amostragem do espaço livre clicando no botão de reprodução, o que ativa a bomba e retira os vapores presentes acima da amostra.No final da análise, um cromatograma aparece na tela e o sensor é automaticamente aquecido a 150 graus Celsius por 10 segundos para limpeza. Quando a caixa de status do sistema ficar verde novamente, o instrumento estará pronto para analisar outra amostra. Para garantir uma linha de base estável e a correta limpeza do sistema, execute pelo menos um branco de ar entre cada amostra.Analise pelo menos três réplicas técnicas por amostra, bem como brancos de frasco. Exporte os dados para um arquivo Microsoft Excel após a aquisição, utilizando a função de dados registrados no software Mense. Após a exportação dos dados, adicione colunas contendo rótulos para as variáveis e réplicas.O formato de dados exportado do software do instrumento pode ser transformado para facilitar a manipulação, utilizando o script Python 0.6 gerado por este laboratório. O nome do arquivo de origem e o nome da planilha dos dados de entrada, bem como o nome desejado para o arquivo de saída, são editados diretamente no script. Esse script facilita a manipulação e análise dos dados por meio da identificação de kis únicos em todas as amostras.Os dados são reorganizados com as informações das amostras nas linhas e os KIS únicos nas colunas, sendo que cada célula representa a área do pico correspondente. Se um pico não for detectado para um valor de KI em uma amostra, a célula correspondente permanece vazia. Em seguida, utilizando um segundo script gerado por esta importação de laboratório, os dados do arquivo editado na etapa anterior são importados.A análise baseia-se na visualização e no exame do número de vezes que cada valor de KI foi detectado. Assim, o programa exibe um gráfico de barras com os acertos de KI. Para cada valor de KI, avalie os acertos de K em subconjuntos específicos de amostras, analisando cada grupo de réplicas técnicas em conjunto.Para fazer isso, analise cada tratamento ou variável separadamente marcando ou desmarcando as caixas correspondentes. Após identificar a largura de cada janela de KI usando a interface gráfica, selecione aleatoriamente alguns dos cromatogramas correspondentes. No software mense, avalie picos sobrepostos entre as réplicas técnicas.Uma vez que a janela de KI é individualizada, a função de mesclagem na interface gráfica é usada para mesclar os KIS que caem na janela no ki mais populoso primeiro. Clique no botão de mesclagem para ativar a função e selecione o ki mais populoso no centro da janela clicando com o botão esquerdo na barra correspondente. Após a seleção da barra, ela muda de cor e fica verde; para mesclar os KIS que estão dentro da janela no ki selecionado, clique com o botão direito nas barras correspondentes.Isso faz com que as barras fiquem vermelhas enquanto uma barra azul de comprimento correspondente é adicionada sobre o ki central. Depois que todos os kis selecionados forem mesclados ao ki central apropriado, clique novamente no botão de mesclagem para aceitar as alterações. Isso faz com que o botão de mesclagem fique amarelo em caso de erros.O botão de desagrupar também está disponível para desagrupar. Clique no botão de desagrupar na interface gráfica. Em seguida, clique com o botão direito sobre a barra vermelha a ser desagrupada.Da cor vermelha, a barra fica azul. Clique novamente no botão desfazer mesclagem para aceitar as alterações. Se alguém tentar mesclar incorretamente dois picos em uma única amostra em um único valor de KI, uma mensagem de erro é exibida.Após todas as operações de mesclagem terem sido salvas, salve o arquivo antes de prosseguir com a análise estatística; os cromatogramas dos brancos de ar e do frasco são analisados para monitorar possíveis contaminações. Uma vez identificados os ki dos picos e dos brancos, subtraia a área do pico detectado no branco de ar e/ou do frasco da área do pico presente na amostra. O nariz eletrônico foi capaz de detectar diferenças nos perfis voláteis entre frutos de melão colhidos em diferentes estágios de maturação.Mostram-se aqui exemplos de cromatogramas de frutos jovens maduros e frutos totalmente maduros, revelando as diferenças na área dos picos. Para diversos picos, foram identificadas janelas de 20 K em todas as amostras. Uma análise de variantes mostrou que, entre essas diferentes kis, a abundância de 14 picos detectados pelo nariz eletrônico variou significativamente entre os dois estágios de maturação. Aqui, a abundância dos picos do fruto jovem maduro para cada uma dessas kis é representada em verde, e a do fruto totalmente maduro é representada em laranja.Após a conclusão deste procedimento, outros métodos, como a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas, podem ser realizados com o objetivo de identificar os componentes correspondentes a cada pico no nariz eletrônico após seu desenvolvimento. Esta técnica fornecerá uma ferramenta de análise rápida e permitirá que pesquisadores nas áreas de patologia vegetal, fisiologia vegetal, biologia pós-colheita e ciência dos alimentos explorem alterações na composição de compostos voláteis em frutas em função da maturação, variedade ou armazenamento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar rapidamente compostos voláteis com um nariz eletrônico e realizar o alinhamento de picos utilizando nossa interface gráfica.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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