Name: Amostragem e Análise de Sinais de Aroma Animal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: Aprenda técnicas de amostragem e análise de sinais olfativos em animais usando microextração em fase sólida e cromatografia gasosa. Este método ajuda pesquisadores a identificar compostos voláteis em marcas de odor.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Keith Holding por sua ajuda com análises químicas no Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton, e Ben Mantle pela produção do vídeo. Também somos gratos ao Prof. Gloriano Moneti, ao Dr. Giuseppe Pieraccini e aos membros do Centro de Espectrometria de Massa da Universidade de Florença, Florença, e ao Prof. Luca Calamai e ao Dr. Marco Michelozzi do Laboratório ARCA da CNR, Florença, por sua ajuda na criação dessa metodologia. Os projetos de pesquisa que incluíram os métodos de amostragem e análise descritos no manuscrito foram apoiados por duas Bolsas Intra Europeias Marie Skłodowska-Curie (IDs do Grant Agreement: 327083, 703611), uma pequena bolsa ('O primata enriquecido sensorial') da Sociedade Primata da Grã-Bretanha, e uma pequena bolsa de pesquisa ('Caçadores-coletores têm um senso especial de olfato?') da Academia Britânica/The Leverhulme Trust para S.V. O trabalho de laboratório necessário para criar essa metodologia também recebeu financiamento da Competição Anual de Financiamento da Faculdade de Ciências e Engenharia (Wolverhampton) para a S.V.

1. Coleta de amostras
<ol><li>Odores amostrais que são um dos seguintes:<ol>
<li>Coletar espontaneamente liberado por sujeitos de estudo habituados (por exemplo, primatas do zoológico) através da marcação do perfume em papel filtro estéril (por exemplo, secreções de odor de glândulas odor) ou diretamente em frascos (por exemplo, urina).</li>
		<li>Coletar esfregando cotonetes de algodão estéreis após o treinamento dos sujeitos do estudo usando treinamento de reforço positivo.</li>
		<li>Coletar esfregando cotonetes estéreis de algodão após sedação de sujeitos de estudo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque amostras em frascos de vidro transparente estéreis com tampa de parafuso de 10 mL e vedação com tampas de rosca que incorporam FTFE/septa de silicone. Guarde-os imediatamente a -20 °C. NOTA: É vital o uso de equipamentos de proteção individual limpos, como luvas de nitrito; alterá-los com frequência; evite contato direto da pele com amostras e frascos. É preferível usar frascos novinhos; no entanto, no caso de frascos usados, é vital pré-limpar os frascos e, em seguida, usar o mesmo protocolo.</li>
	<li>Leve espaços em branco ambientais toda vez que marcas de perfume forem coletadas. Por exemplo, colete os meios de amostragem (por exemplo, papel filtro ou cotonete) e um frasco de headspace que são expostos ao ambiente durante a realização da amostragem.</li>
</ol>2. Preparação da amostra
<ol><li>Prepare as amostras no campo cortando com uma lâmina um quadrado aproximado de 10 mm de um papel filtro marcado pelo cheiro, ou na cabeça do cotonete, e colocando-a em um frasco de 10 mL com tampa de cabeça.</li>
	<li>Depois de preparado, descarte ou limpe a lâmina usada para cortar a mídia de amostragem usando um lenço antibacteriano apropriado e/ou álcool e seque completamente.</li>
	<li>Armazene todas as amostras a -20 °C. NOTA: Preferencial a -20 °C ou de outra forma o mais baixo possível no campo.</li>
</ol>3. Preparação para análise
<ol><li>Retire amostras do congelador e deixe aquecer naturalmente à temperatura ambiente por pelo menos 1 h.</li>
	<li>Configure o método analítico no GC-MS da seguinte forma:<ol>
<li>Para condições de análise spme, siga as instruções do fabricante para condicionar as fibras SPME antes do primeiro uso: pré-condição de fibra (260 °C por 5 min), incubação de amostras (40 °C por 2 min), tempo de extração (15 min), tempo de dessorção (2 min) e pós-condição de fibra (260 °C para 20 min).</li>
		<li>Use as seguintes condições gc: coluna (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), temperatura do injetor (270 °C), taxa de fluxo (1 mL/min), modo de injeção (splitless), perfil do forno GC (45 °C por 2 min; 4 °C/min a 170 °C; 20 °C/min a 300 °C), linha de transferência MSD (280 °C). NOTA: Para melhorar entre a consistência do tempo de retenção da amostra, o método analítico é o tempo de retenção bloqueado).</li>
		<li>Use as seguintes condições de MSD: atraso de solvente (2,5 min) e faixa de varredura (29 a 400 amu). NOTA: Um intervalo de 10 a 400 foi usado nos protocolos anteriores4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Certifique-se de que o fornecimento de gás de purga para a unidade de condicionamento de fibras esteja ligado. NOTA: É vital que o conjunto SPME esteja corretamente instalado no amostrador automático e esteja alinhado às bandejas do amostrador automático, à unidade de condicionamento de fibras e à porta de entrada GC. O alinhamento incorreto pode resultar em danos ou destruição da fibra SPME.</li>
</ol>4. Análise
<ol><li>Coloque um frasco de espaço para cabeça vazio (para agir como um sistema em branco) na primeira posição da bandeja de amostrador automático GC-MS. Coloque o vazio ambiental na segunda posição da bandeja do amostrador automático. Coloque as amostras para análise nas posições subsequentes da bandeja de amostra automática.</li>
	<li>Crie uma sequência analítica para analisar cada amostra dentro da bandeja de amostras.<ol>
<li>Na tela inicial do MassHunter, selecione Sequência | Sequência de carga.</li>
		<li>Complete a tabela de sequência para todos os espaços em branco e amostras inserindo as informações apropriadas. Salve a tabela de sequência completa. NOTA: As informações exatas para a tabela de sequência dependerão da formatação dos laboratórios para a tabela. As informações mínimas normalmente incluem tipo de amostra, nome da amostra, localização e número de frascos, método analítico e localização e nome do arquivo de dados (a alocação de um nome de arquivo de dados que corresponde ao nome da amostra auxilia o processamento futuro de dados). Amostras adicionais podem ser adicionadas à sequência durante a análise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute a sequência selecionando sequência | Sequência de execução.</li>
	<li>Após análise, devolva amostras ao congelador o mais rápido possível. NOTA: pode ser possível reanalisar amostras, mas deve-se notar que alguns componentes voláteis podem ter sido totalmente extraídos durante a análise inicial e alguns compostos podem ter sofrido decomposição térmica e bacteriana a 40 °C, portanto, o cromatograma resultante pode não ser completamente representativo da marcação original do perfume.</li>
</ol>5. Análise de dados
NOTA: A análise inicial de dados inclui a integração de cromatógrafos para obter dados de tempo de retenção e área de pico, juntamente com a identificação provisória de picos usando o software ChemStation e bancos de dados espectrais de massa do NIST (National Institute of Standards and Technology), versão MSD F.01.01.2317. A análise dos dados pode ser realizada manualmente ou através de um método semi-automatizado. Se o método semi-automatizado for usado, às vezes é benéfico realizar um grau de análise manual de dados para verificar identificações provisórias.
<ol><li>Abra o arquivo de dados clicando no arquivo apropriado na barra de navegação à esquerda. O cromatógrafo de íon total (TIC) será exibido na janela superior da tela de análise de dados.</li>
	<li>Para integrar o TIC usando o integrador RTE, selecione o Croromatograma | Integrar.</li>
	<li>Ajuste os parâmetros de integração para que os picos superiores a 3 x ruídos da linha de base sejam integrados. Selecione | de cromatograma Parâmetros de integração de sinal MS. Na caixa de saída ajuste a área mínima de pico conforme apropriado (1.0 produz resultados aceitáveis em nossos exemplos).</li>
	<li>Para identificar picos e gerar um relatório de resumo, selecione Relatórios de exportação | Os resultados da pesquisa da biblioteca reportam-se ao XLS. NOTA: As bibliotecas espectrais a serem pesquisadas juntamente com o número de correspondências de biblioteca a serem exibidas precisam ser predefinidas dentro do software antes que uma pesquisa na biblioteca possa ser realizada.</li>
	<li>O relatório de planilha resultante contém dados de integração para cada pico e uma tentativa de correspondência de biblioteca espectral para atribuir identidade. Normalmente, a correspondência de qualidade/biblioteca da biblioteca deve ser >80 para aceitar a identificação provisória. Salve a planilha.</li>
	<li>Identifique um pico diretamente do TIC.<ol>
<li>Escolha o pico de interesse.</li>
		<li>Se o pico for pequeno, amplie desenhando uma caixa ao redor do pico segurando o botão do mouse da mão esquerda para baixo, estique a caixa sobre o pico e solte.</li>
		<li>Coloque a linha do cursor para que ela esteja no ponto mais alto do pico (ou logo depois).</li>
		<li>Clique duas vezes no botão do mouse da mão direita e o espectro de massa para o pico aparecerá na janela inferior da tela de análise de dados.</li>
		<li>Para pesquisar na biblioteca espectral, mova o cursor em qualquer lugar da janela espectral e clique duas vezes no botão do mouse da mão direita. Os resultados da pesquisa da biblioteca aparecerão em uma nova janela.</li>
		<li>Para remover o ruído de fundo de um espectro de interesse, clique primeiro em dobro no botão do mouse da mão direita no pico em questão. Em seguida, clique duas vezes no botão do mouse da mão direita em uma área sem picos imediatamente em frente ao pico de interesse. Selecione | de cromatograma Espectros subtraídos. O espectro subtraído será exibido na janela inferior da tela de análise de dados e exibirá '(-)' ao lado dos dados SCAN no cabeçalho da janela.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wyatt, T. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWyatt%2C+TD+%22Pheromones+and+Animal+Behavior%3A+Chemical+Signals+and+Signatures%22">Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures</a>. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).</li>
<li>Heymann, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neglected+sense-olfaction+in+primate+behavior%2C+ecology%2C+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution.</a> American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).</li>
<li>Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22secret%22+in+secretions%3A+Methodological+considerations+in+deciphering+primate+olfactory+communication%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The "secret" in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication.</a> American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).</li>
<li>Vaglio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sternal+gland+scent-marking+signals+sex%2C+age%2C+rank+and+group+identity+in+captive+mandrills%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills.</a> Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).</li>
<li>Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dung+odours+signal+sex%2C+age%2C+territorial+and+oestrous+state+in+white+rhinos%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).</li>
<li>Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+phylogenetic+signal+in+milliped+chemical+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Systematics+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses.</a> Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).</li>
<li>Kimura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+substances+in+feces%2C+urine+and+urine-marked+feces+of+feral+horses%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses.</a> Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).</li>
<li>Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+signals+during+pregnancy%3A+a+possible+chemical+basis+for+mother-infant+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition.</a> Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).</li>
<li>Setchell, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+composition+of+scent-gland+secretions+in+an+Old+World+monkey+%28Mandrillus+sphinx%29%3A+influence+of+sex%2C+male+status%2C+and+individual+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity.</a> Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).</li>
<li>Setchell, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odour+signals+MHC+genotype+in+an+Old+World+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Odour signals MHC genotype in an Old World monkey.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).</li>
<li>Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawliszyn%2C+J+%22Solid+phase+microextraction%3A+theory+and+practice%22">Solid phase microextraction: theory and practice</a>. , Wiley-VCH. New York, US. (1997).</li>
<li>Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+scent-marking+in+captive+red-ruffed+lemurs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs.</a> American Journal of Primatology. 81 (1), 22951(2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O uso de amostras de controle, ambos os controles ambientais criados no momento da coleta de amostras e espaços em branco do sistema, são cruciais para a interpretação das amostras de marca de odor. Quaisquer picos atribuídos ao ambiente amostral ou ao sistema instrumental precisam ser excluídos das amostras de marcas de odor para que apenas os picos de interesse sejam incluídos em qualquer interpretação. Esses controles também podem desempenhar um papel na avaliação e monitoramento da "saúde" da instrumentação.
<p c...

Muito pouco se sabe sobre as mudanças químicas que sustentam os sinais olfativos nos animais1, também por causa dos desafios metodológicos no registro e quantificação de perfis químicos voláteis de odores2. Existem várias armadilhas potenciais quando se trabalha com matrizes químicas altamente complexas; estes incluem na amostragem e análise das amostras de odor3.
No Centro de Ciências Rosalind Franklin, Universidade de Wolverhampton, estamos realizando a análise de odores e marcas de cheiro para entender como eles podem ser usados por animais. Combinamos semioquímica com ecologia comportamental, endocrinologia e citologia para melhorar nossa compreensão do papel desempenhado pelos sinais olfativos na comunicação animal.
Desenvolvemos uma metodologia e, em seguida, analisamos odores e marcas de uma variedade de espécies, incluindo vários primatas não humanos (ou seja, lêmures coroados, lêmures-vermelhos, macaques japoneses, babuínos de oliva, chimpanzés) e outros mamíferos (ou seja, gatos, vacas). Coletamos e analisamos uma variedade de amostras, incluindo urina, fezes, secreções de odor de cabelo e odor de glândulas odor. Estes odores e marcas de odor consistem em misturas complexas de compostos e, portanto, qualquer metodologia utilizada para sua análise precisa incluir alguma forma de técnica separada. Como ilustrado, também ocorrem em uma gama de matrizes que necessitam do uso de técnicas para extrair os componentes de interesse.
Estudos anteriores de Vaglio et al.4 e outros autores5 utilizaram extração dinâmica do headspace (DHS) com espectrometria de massa cromatografia gasosa (GC-MS), enquanto a extração direta de solventes6 e extrações complexas de solventes7 também foram utilizadas. Particularmente, a amostragem dinâmica do headspace envolve a eliminação do espaço para a cabeça com um volume conhecido de gás inerte que, em última análise, remove todos os compostos voláteis, com exceção daqueles que mostram uma forte afinidade com a matriz amostral (por exemplo, compostos polares em amostras aquosas).
Para a metodologia atual, adotamos a técnica de microextração em fase sólida do headspace (HS-SPME) aliada ao GC-MS. Em particular, desenvolvemos e aprimoraram a metodologia já utilizada por Vaglio et al. em seu laboratório anterior GC-MS8,9,10.
As técnicas de extração sem solvente são muito eficazes para analisar compostos pequenos e altamente voláteis (que de outra forma podem ser perdidos facilmente de uma amostra) porque esses métodos imobilizam compostos em um suporte de fase estável e sólido. O HS-SPME usa uma fibra revestida com um polímero adsorbente para capturar compostos voláteis no headspace da amostra ou para extrair compostos dissolvidos por imersão em um fluido biológico aquoso11. O revestimento de polímero não liga fortemente os compostos, portanto, pelo aquecimento na porta de injeção do GC eles podem ser removidos. Este método é mais poderoso do que as técnicas de extração de solventes e também mais eficaz que o DHS.
Na abordagem atual, as amostras estão contidas dentro de frascos de vidro. Estes frascos são aquecidos a uma temperatura de 40 °C para simular a temperatura do corpo animal, a fim de promover os componentes voláteis da marca do perfume para ocupar o espaço da cabeça do frasco. Uma fibra SPME, revestida com 65 μm de material sorbente de polidimtilsiloxano/divinylbenzene (PDMS/DVB), é exposta ao ambiente do headspace e componentes voláteis da amostra são adsorvidos na fibra. Ao aquecer a fibra na porta de entrada de um GC-MS, os componentes voláteis são desordenados da fibra e, em seguida, separados pelo GC. Padrões de fragmentação espectral em massa são obtidos para cada componente usando o MS. Comparando esses espectros de massa com bancos de dados espectrais em massa, pode ser possível identificar provisoriamente os componentes da marca do perfume. Através do uso de um amostrador automático, podemos analisar várias amostras em lotes de forma consistente.
Dado que cada tipo de fibra SPME tem uma afinidade diferente com produtos químicos polares, a fibra geralmente é escolhida dependendo da polaridade e/ou peso molecular dos compostos químicos alvo. Além disso, as condições de GC são alteradas dependendo do tipo de coluna GC e das características dos compostos químicos alvo.
Esta técnica permite a análise semi-quantitativa dos componentes voláteis das marcas de odor, permitindo a separação e a identificação provisória dos componentes da amostra, seguida pela análise das razões de pico de área para procurar tendências que possam significar componentes da marcação do odor que possam estar envolvidos na sinalização.
Os principais pontos fortes desta abordagem atual são:
<ul style="list-style-type: square;"><li>A gama de tipos de amostra que podem ser analisados.</li>
	<li>Não são necessárias preparações ou extrações complexas da amostra.</li>
	<li>A capacidade de analisar componentes voláteis.</li>
	<li>A capacidade de separar os componentes de uma mistura.</li>
	<li>Para ser capaz de identificar os componentes detectados.</li>
	<li>A capacidade de fornecer informações semi-quantitativas e potencialmente quantitativas sobre os componentes detectados.</li>
</ul>

<table><tbody><tr><td>Frascos de amostrador automático de 10 mL</td><td>Agilent</td><td>5188-5392</td><td>Frascos de rosca de 10 ml com</td></tr><tr><td>tampas de frascos de 18 mm</td><td>Agilent</td><td>8010-0139</td><td>Magnético com septos de PTFE/silicone</td></tr><tr><td>Amostrador automático</td><td>Agilent</td><td>GC120 PAL amostrador</td><td></td>automático</tr><tr><td>Coluna capilar Agilent</td><td></td><td>HP5-MS</td><td>30 m x 0,25 mm; 0,25 &micro; m</td></tr><tr><td>Software de análise de dados</td><td>Agilent-ChemStation</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cromatógrafo gasoso</td><td>Agilent</td><td>7890B</td><td></td></tr><tr><td>Septo de entrada</td><td>Agilent</td><td>5182-3442</td><td>Merlin microseal</td></tr><tr><td>Detector seletivo de massa</td><td>Agilent</td><td>5977A</td><td></td></tr><tr><td>Software de relatório</td><td></td> <td>Microsoft-Excel</td><td></td></tr> <tr><td>Biblioteca espectral</td><td>NIST</td><td>-</td><td>NIST/EPA/NIH Mass Spectral</td></tr><tr><td>Library Programa de pesquisa de biblioteca espectral</td><td>NIST-MS</td><td></td> <td>Search v.2.2</td></tr><tr><td>Splitless Inlet liner</td><td>Agilent</td><td>5190-4048</td><td></td></tr><tr><td>SPME fibres</td><td>Agilent</td><td>SU57345U</td><td>65 &micro; m Fibra PDMS/DVB</td></tr></tbody></table>

amostragem e análise de sinais de aroma animal

Sampling and Analysis of Animal Scent Signals

Desenvolvemos uma metodologia eficaz para amostragem e análise de sinais de odor, utilizando microextração em fase sólida do headspace, juntamente com espectrometria de massa cromatografia gasosa, para entender como eles podem ser usados na comunicação animal. Esta técnica permite a análise semi-quantitativa dos componentes voláteis das secreções do odor, permitindo a separação e a identificação provisória dos componentes na amostra, seguida pela análise das razões de pico de área para procurar tendências que possam significar compostos que possam estar envolvidos na sinalização. Os principais pontos fortes dessa abordagem atual são a gama de tipos de amostra que podem ser analisados; a falta de necessidade de qualquer preparação ou extração de amostras complexas; a capacidade de separar e analisar os componentes de uma mistura; a identificação dos componentes detectados; e a capacidade de fornecer informações semi-quantitativas e potencialmente quantitativas sobre os componentes detectados. A principal limitação à metodologia diz respeito às próprias amostras. Uma vez que os componentes de interesse específico são voláteis, e estes poderiam facilmente ser perdidos, ou suas concentrações alteradas, é importante que as amostras sejam armazenadas e transportadas adequadamente após sua coleta. Isso também significa que as condições de armazenamento e transporte de amostras são relativamente caras. Este método pode ser aplicado a uma variedade de amostras (incluindo urina, fezes, secreções de odor de cabelo e odor de glândulas odor). Esses odores consistem em misturas complexas, ocorrendo em uma variedade de matrizes, e, portanto, necessitam do uso de técnicas para separar os componentes individuais e extrair os compostos de interesse biológico.

Seguindo este protocolo, identificamos provisoriamente um total de 32 compostos químicos voláteis a partir da análise de 14 marcas de odor ano-genital liberadas espontaneamente em papel filtro por lêmures de babados vermelhos(Varecia variegata rubra) e comparamos perfis de odor com características do sinalizador12. Compostos voláteis de ocorrência natural, como hidrocarbonetos, terpenos, álcoois terpenos e cetonas, estavam presentes dentro desses perfis e incluíam compostos que haviam sid...

Desenvolvemos uma metodologia eficaz para amostragem e análise de sinais de odor, a fim de entender como eles podem ser usados na comunicação animal. Particularmente, usamos microextração de fase sólida do headspace, juntamente com espectrometria de massa cromatografia gasosa para analisar os componentes voláteis de odores animais e marcas de odor.

Amostragem e Análise de Sinais de Aroma Animal

We have developed an effective methodology for sampling and analysis of odor signals, by using headspace solid-phase microextraction coupled with gas ...

O papel desempenhado pelo odor na comunicação animal é atualmente subestimado e tão subestudado. Em particular, muito pouco se sabe sobre as mudanças químicas que sustentam os sinais olfativos em animais, incluindo humanos. E isso se deve também aos desafios metodológicos, registrando e quantificando compostos químicos de odores usados pelos animais para se comunicar.Existem vários desafios potenciais ao trabalhar com misturas químicas altamente complexas e estes incluem também na amostragem e análise das amostras de odor. Estamos conduzindo a análise dos odores usados pelos animais para entender como eles podem ser usados por eles quando se comunicam entre si. Combinamos citoquímica com endocrinologia bioecologia e citologia para melhorar nossa compreensão do papel desempenhado pelo odor na comunicação animal.Para nossa metodologia atual em Wolverhampton, adotamos a técnica de microestrutura de fase sólida do Headspace aliada à espectrometria de massa cromatografia a gás, construída e uma metodologia invisível da metodologia são utilizadas no passado. Os odores amostrais são coletados de uma das seguintes maneiras. Um, amostras liberadas espontaneamente de sujeitos habituados do estudo.Por exemplo, primatas do zoológico coletam secreções de odor de glândulas odor por marcação de perfume em papel filtro estéril ou amostras de urina diretamente em frascos. Dois, após o treinamento, os sujeitos do estudo usando reforço positivo coletam secreções de odor esfregando olhar de odor com cotonetes de algodão estéreis. Três, após a sedação dos sujeitos do estudo, coletam secreções de odor esfregando glândulas odor com cotonetes estéreis de algodão, por amostras em parafusos estéreis de 10 mililitros tampados, frascos de vidro transparente e vedação com tampas de rosca incorporando o setor de silicone P T F E.Armazene imediatamente os frascos a menos 20 graus Celsius. Note que é vital que equipamentos de proteção pessoal limpos, como luvas de nitrito, seja usado durante a amostragem. As luvas de mudança frequentemente evitam o contato direto da pele com amostras e frascos.É preferível usar frascos novos. No entanto, no caso de frascos usados, é vital pré-limpar os frascos e, em seguida, usar o mesmo protocolo. Leve espaços em branco ambientais toda vez que marcas de perfume forem coletadas.Faça isso expondo um papel filtro nãousado ou cotonete de algodão e frascos ao ambiente enquanto a amostragem é realizada. As amostras são preparadas no campo. Para um papel filtro marcado por perfume, corte um quadrado aproximado de 10 milímetros do papel e coloque em um frasco de espaço de cabeça de 10 mililitros.Para um cotonete, corte a cabeça do cotonete na extremidade do eixo do cotonete e coloque em um frasco de espaço para a cabeça. Depois de preparado cada amostra, descarte ou limpe o uso da lâmina para cortar a mídia de amostragem, com um lenço antibacteriano apropriado e ou álcool e seque completamente. Armazene todas as amostras a menos 20 graus celsius.Note que as amostras devem ser armazenadas a menos 20 graus celsius, no entanto, na loja de campo na temperatura mais baixa é possível a temperatura e transferir para menos 20 graus Celsius na primeira oportunidade. Antes da análise, remova amostras do congelador e possa andar naturalmente à temperatura ambiente por pelo menos uma hora. Configurar os métodos analíticos na GCMS da seguinte forma para as condições de análise de SPMS seguem as instruções do fabricante para condicionar as fibras SBME antes do primeiro uso.É vital que o conjunto SBME esteja corretamente instalado no amostrador automático e que esteja alinhado à unidade de condicionamento de fibras do sampler automático e à porta de entrada GC. O alinhamento incorreto pode resultar em danos ou destruição da fibra Sbme. Certifique-se de que o fornecimento de gás de poleiro para a unidade de condicionamento de fibras esteja ligado.Para melhorar a consistência do tempo de retenção da amostra, o método analítico é o tempo de retenção bloqueado adicionar os frascos de amostragem à bandeja do amostrador automático colocar um frasco vazio de espaço da cabeça para agir como um sistema em branco na primeira posição da bandeja de amostrador automático. Coloque o vazio ambiental na segunda posição e, em seguida, coloque todas as amostras restantes para análise nas posições subsequentes da bandeja do amostrador automático. Crie uma sequência analítica para analisar cada amostra dentro da bandeja de amostras.Na tela inicial do caçador de massa, selecione sequência para a barra de menu e, em seguida, carregue a sequência do menu suspenso. Uma tabela de sequência em branco será exibida completando a tabela de sequência para todos os espaços em branco e amostras inserindo as informações apropriadas salvo como tabela de sequência concluída. Note que as informações exatas para a tabela de sequência dependerão da formatação laboratorial da tabela.As informações mínimas normalmente incluem o nome da amostra do tipo de amostra, o local do arquivo e o método analítico numépria e a localização do arquivo de dados e a alocação de nome de um nome de arquivo de dados que corresponde ao nome da amostra envelhecendo o processamento de dados futuros. Amostras adicionais podem ser adicionadas à sequência durante a análise. Execute a sequência selecionando sequência na barra de menu e, em seguida, execute a sequência.Após análise, devolveu amostras ao congelador o mais rápido possível. Note que pode ser possível reanalisar amostras. Mas deve-se notar que alguns componentes voláteis podem ter sido totalmente extraídos durante a análise inicial e algum composto pode ter sofrido decomposição térmica e bacteriana a 40 graus Celsius.Assim, o resultado em cromatograma pode não ser completamente representativo da marcação original do perfume. A análise inicial dos dados inclui a integração de cromatógrafos para obter dados de tempo de retenção e área de pico, juntamente com a identificação provisória de picos usando software de estação de cam e bancos de dados espectrais de massa de ninhos. A análise dos dados pode ser realizada manualmente ou através de um método semi-automatizado.Se o método semi-automatizado for usado, às vezes é benéfico realizar um grau de análise manual de dados para verificar identificações provisórias. Para iniciar a análise de dados abra o arquivo de dados clicando no arquivo apropriado na barra de navegação à esquerda. O TIC de cromatograma de íon total será exibido na janela superior da tela de análise de dados.Para integrar o TIC usando o integrador RTE, primeiro selecione cromatograma na barra de menu e selecione o integrador no menu suspenso que uma caixa pop up abre e escolha o integrador RTE. Volte para o menu cromatograma e agora selecione integrar. Para ajustar os parâmetros de integração para que os picos ou até mais de três vezes o ruído da linha de base sejam integrados, selecione novamente o cromatógrafo na barra de menu e, em seguida, os parâmetros de integração do MS Signal do menu suspenso.Na caixa pop up, ajuste a área mínima de pico conforme apropriado 1.0 produz resultados aceitáveis em nossos exemplos. Para identificar picos e gerar um relatório de resumo, selecione relatórios de exportação na barra de menu e, em seguida, relatório de resultados de pesquisa de biblioteca para XLS. Note que as bibliotecas espectrais a serem pesquisadas juntamente com o número de correspondências de biblioteca a serem exibidas precisam ser predefinidas dentro do software antes que uma pesquisa na biblioteca possa ser realizada.O relatório de planilha resultante contém dados de integração para cada pico e uma tentativa de correspondência de biblioteca espectral para atribuir identidade. Normalmente, a qualidade da biblioteca ou a correspondência da biblioteca devem ser maiores que 80 para aceitar a identificação provisória. Salve a planilha.Para identificar um pico diretamente do TIC, escolha o pico de interesse. Se o pico for um pequeno zoom, desenhando uma caixa ao redor do pico, segurando o botão do mouse à esquerda para baixo, estique a caixa sobre o pico e solte o botão do mouse. Coloque a linha do cursor para que ela esteja no ponto mais alto do pico ou logo depois.Clique duas vezes, o botão do mouse da mão direita e o espectro de massa para o pico aparecerão na janela baixa da tela de análise de dados. Para pesquisar em uma biblioteca espectral, mova o cursor em qualquer lugar da janela espectral e clique duas vezes no botão do mouse da mão direita, os resultados de pesquisa da biblioteca aparecerão em uma nova janela. Para remover o ruído de fundo de um espectro de interesse primeiro, clique duas vezes no botão do mouse da mão direita no pico em questão e clique no botão do mouse da mão direita em uma área sem picos imediatamente em frente ao pico de interesse clique no botão subtraído na fita do menu ou selecione cromatógrafo para a barra de menu e, em seguida, subtrair espectros do menu suspenso.O espectro subtraído será exibido na janela inferior da tela de análise de dados e exibirá um painel ao lado dos dados de varredura no cabeçalho da janela. Seguindo este protocolo, identificamos provisoriamente um total de 32 compostos químicos voláteis a partir da análise de 14 marcas de odor genital liberadas espontaneamente em papel filtro por lêmures vermelhos e comparamos perfis de odor com características do sinalador que ocorrem naturalmente compostos voláteis como hidrocarbonetos, terpenos, álcoois turpin e cetonas estavam presentes dentro desses perfis e incluem os compostos que haviam sido encontrados anteriormente para agir como hormônios sexuais e sinais de aptidão. em outras espécies animais. Os compostos que foram identificados provisoriamente estão listados na tabela um.Cromatógrafos representativos um de um controle e outro de uma marca de perfume lima são mostrados na figura um. O número e a abundância relativa dos componentes variaram de amostra para amostra em diferentes sujeitos do estudo. No entanto, seis compostos rotulados de A a F no cromatógrafo estavam presentes em todas as amostras.Estes compostos foram, respectivamente, curvas para a altura para a ilha de E um paracrystal hexanal seis paramentha dois oito corantes um dois pinene quatro e pentodecano. Os resultados deste estudo sugeriram que os lêmures-de-babados vermelhos usam marcação enviada para transmitir informações sobre sexo e idade feminina sem marcação genital desempenhando um papel na comunicação sociosexual. Outro resultado representativo após o uso deste protocolo foi o nosso estudo da propaganda de fertilidade por babuínos de oliva femininos.Identificamos um total de 74 compostos voláteis a partir da análise de 395 amostras de odor vaginal babuíno feminino. Estes incluíam uma gama de compostos voláteis odorosos de ocorrência natural, como cetonas, álcoois, aldeídos, terpenos, ácidos graxos voláteis e hidrocarbonetos. Cromatógramas típicos usados para comparar trolls em branco e amostras de odor vaginal babuíno fêmea de períodos férteis e não férteis são mostrados na figura dois.Examinamos as relações entre perfis de odor vaginal e receptividade sexual de babuínos fêmeas. Nossos resultados mostraram que a quantidade total de odor vaginal difere da fertilidade sugerindo que o odor pode desempenhar um papel na sinalização da fertilidade babuína feminina. Também encontramos diferenças no odor vaginal entre os tipos de grupo, mas não conseguimos distinguir os efeitos da composição do grupo, a imparidade da idade feminina.São as vantagens combinadas da amostragem e uso da GCMS. Assim, o uso da micro extração de fase sólida do espaço da cabeça permite que uma ampla gama de amostras diferentes seja analisada usando GCMS. Somos capazes de separar os componentes dessas marcas complexas e, em seguida, identificar cada um desses componentes individuais usando o espectrômetro de massa.E então, então toda a técnica combinada é muito poderosa e nos dá muitas informações sobre essas marcas de perfume, que no passado teria havido muita extração de preparação de amostra necessária para ser capaz de obter os resultados.

sampling-and-analysis-of-animal-scent-signals

Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Neste artigo de vídeo, descrevemos um método novo que permite a construção de gradientes de odores com geometrias estável e controlável. Brevemente ilustrar como esses gradientes podem ser usados ​​para triagem de defeitos olfativa (anosmia total e parcial) e estudar características mais sutis de comportamento de quimiotaxia.

De alta resolução de Medição do Comportamento Odor-Driven em larvas de Drosophila

Fundamentais, ainda propriedades únicas do sistema olfativo dos roedores, levaram ao seu estudo crescente entre os biólogos. A avaliação relativamente simples de sua função é, então, também é necessário. Aqui nós descrevemos testes sensíveis para a caracterização da sensibilidade olfativa do mouse e preferência.

Teste Comportamental olfativo no rato adulto

A abordagem comparativa permite que os neurocientistas espécies de comportamento para explorar vários fatores neurobiológicos associados com comportamentos específicos vistos como característica de um modelo animal específico. Aproveitando naturalmente diferenças de comportamento entre espécies estreitamente relacionadas, esta técnica não requer técnicas invasivas para manipular a expressão do comportamento.

Usando uma abordagem comparativa de espécies para investigar o Neurobiology of Responses Paternal

Pistas olfativas mediar muitos comportamentos diferentes em insetos, e muitas vezes são misturas complexas compostas de dezenas a centenas de compostos voláteis. Utilizando cromatografia em fase gasosa com multi-canais de gravação no lobo antenal inseto, descreve-se um método para a identificação de compostos bioactivos.

Identificação de voláteis olfativas utilizando cromatografia gasosa-Multi-unidade Gravações (GCMR) no lobo antenal Inseto

Nós demonstramos as variações da técnica de gravação extracelular de multi-unidade para caracterizar odor evocadas respostas nas três primeiras etapas da via olfactiva invertebrado. Estas técnicas podem ser facilmente adaptados para examinar a actividade conjunto de outros sistemas neurais também.

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuitos olfatórias

Descrevemos um protocolo para o uso de antenas de insetos na forma de eletroantenogramas (EAGs) em robôs autônomos. Nosso design experimental permite gravações estáveis em um dia e resolve manchas de odor individuais de até 10 Hz. A eficiência dos sensores EAG para pesquisas olfativas é demonstrada na condução de um robô em direção a uma fonte de odor.

Usando insetos eletroantenogramas Sensores em robôs autônomos para Pesquisas olfativas

Os ratos produzem um complexo repertório multisilábico de vocalizações ultra-sônicas (USVs). Estes USVs são amplamente utilizados como leituras para transtornos neuropsiquiátricos. Este protocolo descreve algumas das práticas que aprendemos e desenvolvemos para consistentemente induzir, coletar e analisar as características acústicas e sintaxe de canções de mouse.

Eliciando e Analisando Canções de Vocalização Ultrassônica de Rato Masculino (USV)

Este protocolo descreve etapas para usar o novo software, SwarmSight, para o seguimento do frame-por-frame de insetos posições da antena e narigudo de vídeos de câmera web convencional usando computadores convencionais. O software livre, open-source processa quadros cerca de 120 vezes mais rápido do que os seres humanos e realiza-se no melhor do que a precisão humana.

SwarmSight: Acompanhamento em tempo real dos movimentos de antena do inseto e reflexo de extensão Proboscis usando uma preparação comum e Hardware convencional

O Sistema de Permeação Odor Controlado é um método simples, portátil de campo e de baixo custo de entrega de odor para testes e treinamento olfativos. É construído de um odor retido em um material adsorbent e contido dentro de um saco de polímero permeável permitindo a liberação controlada do vapor odorante ao longo do tempo.

Sistemas de permeação de odor controlados para treinamento olfativo e testes de campo

Este protocolo investiga a relação cérebro-comportamento no hipocampo CA1 em camundongos navegando em uma pluma de odor. Fornecemos um protocolo passo a passo, incluindo cirurgia para acessar imagens do hipocampo, treinamento comportamental, gravação e processamento do cérebro do miniscope GCaMP6f e dados comportamentais para decodificar a posição do mouse a partir da atividade neural do ROI.

Miniscope registrando sinais de cálcio no hipocampo de camundongos navegando em uma pluma de odor

Este protocolo estabelece métodos para extrair e quantificar as respostas ao feromônio sexual volátil em C. elegans, fornecendo ferramentas para estudar a comunicação química e a trajetória de navegação.

Extração de feromônios sexuais voláteis e ensaio de quimioatração em Caenorhabditis elegans

Aprenda técnicas de amostragem e análise de sinais olfativos em animais usando microextração em fase sólida e cromatografia gasosa. Este método ajuda pesquisadores a identificar compostos voláteis em marcas de odor.

Amostragem e Análise de Sinais de Aroma Animal

Explorar mais vídeos