Análise otimizado de metilação do DNA e expressão gênica de pequenas áreas anatomicamente definidos do Cérebro

O objetivo geral deste procedimento é estudar o DNA. A metilação e a expressão gênica mudam no início da vida Isso é feito primeiro submetendo filhotes de camundongos recém-nascidos à separação materna para induzir o estresse no início da vida como uma segunda etapa das áreas de interesse do cérebro aqui, o PVN é obtido por micro dissecção in loco e o DNA e o RNA são isolados simultaneamente de um único punção de tecido.

Em seguida, o DNA obtido é tratado por sulfito, e a região de interesse é amplificada por PCR de bi sulfito. Este é então ligado a um vetor e transformado em bactéria. As transformações bem-sucedidas são identificadas pela expressão do marcador e pelo tamanho do fragmento de PCR.

E, por último, o sequenciamento de bissulfeto é usado para avaliar o status de metilação. A principal vantagem desse fluxo de trabalho é que ele permite uma análise conveniente da programação epigenética em resposta a estímulos ambientais. Este método pode fornecer informações sobre a programação epigenética pela adversidade no início da vida.

Também pode ser aplicado a outros sistemas. Onde quer que a metilação e a expressão gênica sejam analisadas em ambientes altamente específicos do tecido e onde a disponibilidade do tecido seja limitada Para induzir o estresse no início da vida. A separação materna é realizada em filhotes de mães C 57 pretas pretas de seis N prenhes cronometradas para afetar a separação materna.

Transfira cada ninhada para uma gaiola limpa e aquecida por três horas diárias dos dias pós-natais de um a 10 dias e deixe os filhotes de controle sem estresse e sem perturbação. Além da separação de três horas, todas as ninhadas são deixadas com suas mães até o desmame no dia 21 pós-natal. Em seguida, os filhotes são alojados em grupos de sexo combinado, três a cinco camundongos por gaiola sob condições de alojamento padrão para iniciar a coleta de tecido cerebral, os cérebros dos camundongos são removidos dos crânios e imediatamente congelados em gelo seco isop e armazenados a 80 graus Celsius negativos.

Quando estiver pronto para coletar os punções de tecido, remova os cérebros do freezer de 80 graus negativos e coloque-os em gelo seco. Comece criosseccionando os cérebros em seções coronais de 10 mícrons, do rostral ao coddle. Monte as seções em lâminas de vidro super frost e seque-as para coloração violeta de crista.

Lâminas adicionais podem ser retiradas e armazenadas a menos 20 graus para análises adicionais, como hibridização in situ de dois. Quando estiver pronto para receber socos, pinte as lâminas com violeta crestal para identificar estruturas cerebrais de interesse. Em seguida, usando uma agulha de perfuração, dê punções de 0,8 milímetros das regiões de interesse usando microdissecção in loco.

Os punções devem ser armazenados a menos 80 graus Celsius. É de importância crítica que a microperfuração seja realizada de maneira padronizada, pois a expressão gênica e a metilação são altamente específicas do tecido. Homogeneizar os punções em 400 microlitros de tampão tiocianato de qádio usando uma pipeta e, em seguida, vórtice à temperatura ambiente.

Em seguida, passe o lisado resultante por uma seringa de calibre 29. Várias vezes o soco não deve mais ser visível. Divida o lisado em partes iguais.

Um para processar o RNA, o que deve ser feito primeiro e o outro para processar o DNA, que pode ser armazenado à temperatura ambiente até que o RNA seja processado para purificação do RNA em um décimo volume de acetato de sódio, um volume de aqua fenol e meio volume de 24 para um clorofórmio para vórtice isoamilama AML. A mistura vigorosamente após cada adição e incube a mistura final no gelo por 10 minutos. Em seguida, centrifugue a mistura.

Colete a fase aquosa e adicione um volume igual de etanol a 70%. Usando um kit de coluna de rotação de RNA. Realize uma digestão de DNA em coluna e lave eluir o RNA em 25 microlitros de água.

Agora purifique o DNA usando um protocolo de kit modificado para incluir a adição de uma digestão de RN a e para aquecer o tampão eluciano e a coluna eluciana a 70 graus Celsius antes de seu uso. 10 minutos a 70 graus Celsius são suficientes para as colunas. Finalmente, use um espectrofotômetro para determinar as concentrações de DNA e RNA.

Um punção típico de PVN produz cerca de 600 nanogramas de DNA e cerca de 400 nanogramas de RA reservados, cerca de 100 nanogramas de RNA para análise de expressão gênica por PCR quantitativo antes da amplificação por sulfito. Trate 200 nanogramas do DNA isolado com um kit disponível comercialmente para amplificar o DNA das regiões metiladas. Encomende primers projetados especificamente para DNA convertido em bissulfito O design ideal do primer em bi PCR é essencial, pois a qualidade e a especificidade do amplicon de PCR determinam o sucesso das etapas a seguir.

Quando os primers chegarem, determine sua temperatura ideal e ajoelhada com experimentos piloto. Use dois microlitros de DNA tratado com sulfito de bis como modelo para cada 25 microlitros. Mistura de PCR.

Amplifique a mistura começando com uma desnaturação de seis minutos a 95 graus Celsius, seguida por 45 a 50 ciclos de amplificação antes de um alongamento final de cinco minutos a 72 graus Celsius. Analise sete microlitros do produto da PCR por eletroforese em gel Agros para verificar o tamanho do amplicon. Purifique o produto de PCR restante para ligadura subsequente usando um kit de limpeza de PCR disponível comercialmente.

Se forem obtidos produtos de PCR indesejados, use purificação em gel para isolar o produto de interesse para este protocolo. Um kit de clonagem comercial é empregado. A eficiência da clonagem depende criticamente da inserção.

Portanto, se um número baixo de clones recombinantes for obtido repetidamente, tente um vetor de clonagem diferente. Configure uma reação de ligação de 10 microlitros com um microlitro de vetor e três microlitros de produto de PCR limpo. Misture a reação pipetando e incube-a durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte.

Limpe a reação de ligação por precipitação clássica de etanol e transforme as bactérias com o produto. Adicione um mililitro de meio SOB pré-aquecido diretamente após a administração do pulso e transfira as bactérias transformadas para um tubo de reação. Depois de recuperar as bactérias por uma hora a 37 graus Celsius, espalhe 100 microlitros de cada suspensão em uma placa de ampicilina LB revestida com IPTG.

Xal incubar as placas durante a noite, uma vez que as colônias podem ser colhidas. Configure reações de PCR de colônia de 25 microlitros em uma placa de 96 poços usando três microlitros de cloreto de magnésio 2,5 milimolares em cada reação. Escolha clones brancos positivos com uma ponta de pipeta e transfira-os para uma mistura de PCR com um simples mergulho.

Comece a PCR com um ciclo de fusão de quatro minutos. Siga isso com 10 ciclos de amplificação com uma temperatura de ling de 56 graus Celsius. Cada etapa desses ciclos é de 30 segundos.

Em seguida, diminua a temperatura de ealing para 48 graus Celsius por mais 30 ciclos de amplificação. Termine com um ciclo de alongamento de cinco minutos. Agora carregue cinco microlitros de cada produto em um gel aros e identifique as reações que contêm o inserto do tamanho certo.

Use um kit disponível comercialmente para limpar os produtos de PCR de interesse para que possam ser sequenciados usando sequenciamento de ciclo de terminador de corante grande. Em poços de carga de placa de 96 poços com três microlitros de mistura mestre de reação DI grande, seguidos por dois microlitros de produto de PCR de colônia limpa. Execute a reação em um termociclador começando com um minuto a 96 graus Celsius, seguido por 35 ciclos de 10 segundos a 96 graus Celsius, cinco segundos a 50 graus Celsius e quatro minutos a 60 graus Celsius.

Depois que a reação da matriz grande for concluída, limpe a reação usando uma placa de purificação da matriz grande. Depois de obter as sequências, analise-as usando o big analyzer online ou a ferramenta B-I-S-M-A para derivar o padrão de metilação da região de DNA investigada para obter informações sobre a influência do estresse no início da vida ou ELS na expressão de VP e no status de metilação. Os bastões pretos C 57 e camundongos foram processados de acordo com o protocolo descrito, o núcleo paraventricular e o núcleo supraóptico foram perfurados para isolar o DNA e o R-N-A-D-N-A foi tratado com bissulfito, amplificado com primers específicos para o intensificador de VP e os produtos de PCR foram clonados e sequenciados pelo menos 20 clones recombinantes de cada camundongo.

A PCR foi analisada para determinar as frequências de metilação para os CPGs contidos no amplicon de PCR no tecido do P-V-N-E-L-S induziu uma hipometilação significativa em quatro locais no intensificador A VP, sugerindo marcação epigenética dessa região regulatória por meio de experiências no início da vida. Em contraste com a metilação PVN do intensificador A VP não foi afetada pelo ELS no SON, ilustrando a especificidade tecidual do efeito epigenético em animais controle, o status de metilação do DNA no CPG 10 correlacionou-se negativamente com uma expressão do gene VP apontando para um papel da metilação do DNA no ajuste fino de uma expressão gênica VP. Após este procedimento, outros métodos como UPCR podem ser prontamente realizados no RNA isolado, a fim de responder a perguntas adicionais, como alterações na expressão gênica no tecido analisado.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estudar as mudanças de metilação do DNA em resposta a estímulos ambientais ou dependentes experientes.