Name: Correlacionando DNA Alterações metilação específico do gene com expressão e transcrição Atividade de astrocítica KCNJ10 (Kir4.1) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprenda a avaliar a metilação do DNA do gene KCNJ10 em astrocitos usando MS.HRMA e ensaio de luciferase. Este método correlaciona alterações epigenéticas com atividade transcricional em neurociência.

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Este trabalho foi apoiado por R01NS075062-01A1. Classificação FACS realizada nas instalações do Núcleo de Citometria de Fluxo Abrangente da UAB (P30 AR048311, P30 A1027767). O Dr. Scott Philips, da instalação do Núcleo de Neurobiologia da UAB, e a Dra. Susan Nozell, do UAB CDIB, ajudaram nos aspectos técnicos do ensaio de luciferase.

Todos os animais foram tratados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde orientações. O tratamento ea utilização Comitê Animal da Universidade de Alabama em Birmingham aprovou o uso animal. 1. A obtenção de RNA e DNA a partir de uma Enriched astrocítica População usando fluorescente de células activadas (FACS) de astrócitos partir de tecido cerebral Whole <ol><li> Sedar animais com CO 2 durante 1 min e, em seguida, rapidamente decapitar. Dissecar córtices como descrito em Albuquerque et ai, 26.; não é necessário para remover das meninges. Nota: Ratos transgênicos expressando eGFP sob a S100β (um marcador de astrócitos) promotor foram gerados por Itakura et al 27 e utilizado para triagem de FACS astrócitos.. </li><li> Prepare homogenato de cérebro total utilizando um kit de dissociação de papaína em condições não-estéreis de acordo com o protocolo do fabricante. Calor-activar a papaina, a 37 ° C em banho-maria durante 10 min. Nota:Solução de papaína é fornecido pelo fabricante e contém L-cisteína e EDTA (Ver Tabela de Materiais). <ol><li> Cortar ou dremel um furo no topo de um tubo de 50 ml para tubos de permitir transportar 95% de O2: 5% de CO 2 a ser alimentado a um tubo cónico fechado (Figura 1A). Coloque córtices dissecadas em 10 milímetros placa de cultura contendo meio de dissociação (MEM suplementado com glucose 20 mM e penicilina / estreptomicina (500 U / ml) e equilibrou-se a 95% de O2: 5% de CO 2) e utilizar uma lâmina de barbear limpa para tecido triturado em 1 x 1 mm 2 peças. </li></ol></li><li> Tecido de transferência usando 10 ml PIPETMAN manual para tubo de 50 ml contendo solução de papaína. Permitir que o tecido para resolver a parte inferior da pipeta de transferência antes da descarga para minimizar a quantidade de mídia dissociação transitadas. Manter solução de papaína equilibrada a 95% de O2: 5% de CO 2 por meio de intercâmbio de gás de superfície para a duração da incubação. Não bolha papaína solutiligar. Incubar o tecido durante 20 minutos em 37 ° C num banho de água. </li><li> A seguir à incubação em solução de papaína, o tecido triturado 10 vezes com uma pipeta de 10 ml de transferência a uma velocidade lenta. Centrifugar a suspensão de células a 1000 x g turva durante 5 min à TA. <ol><li> Equilibrar soluo do inibidor de ADNase / albumina (fornecido pelo fabricante), através de intercâmbio de gás superficial e re-suspender as células precipitadas em 3 ml de solução / inibidor de albumina de ADNase. Prepare gradiente de densidade descontínua comercial seguindo as instruções do fabricante. </li></ol></li><li> Gire gradiente de densidade descontínua em 1000 xg durante 6 min. Isolar as células dissociadas a partir do fundo do tubo por sucção sedimento de fundo, utilizando uma pipeta. </li><li> Re-suspender as células dissociadas em 2-3 ml de DPBS com 0,02% de albumina de soro bovino e 1 mg / ml de DNase ou tamponadas de HEPES preferidos meios de cultura. Passe por 40 um filtro antes de FACS (Figura 2A). Manter as células no gelo até a classificação. <ol><li> Execute FACS 28. &lt;/ li&gt; <li> Células sedimento em 1,5 ml de tubos de centrífuga a 2000 xg durante 5 min a 4 ° C. Nota: astrócitos sedimentado pode ser utilizada imediatamente ou mantidas em -80 ° C até à extracção do ADN. </li></ol></li><li> Extrair RNA e DNA usando o método de isolamento preferido 29 30. Avaliar RNA e DNA e qualidade através de espectrofotómetro e 31 Bioanalyzer. Nota: Utilize apenas RNA de alta qualidade e DNA em passos subsequentes, 260/280 = 2,0-2,2 e 1,8-1,9, respectivamente. Análise Bioanalyzer é essencial para avaliar a degradação do RNA ou a fragmentação do DNA. ARN ou ADN pode ser utilizado imediatamente ou armazenado em -80 ° C ou -20 ° C, respectivamente, para os estudos subsequentes. </li></ol> 2. Avaliar DNA metilação status de um Gene usando metilação-sensível de alta resolução Melt Análise (MS-HRMA) <ol><li> Digite sequência do gene de interesse em software de mapeamento on-line preferido de metilação para identificar quaisquer ilhas CpG em genede interesse 32. <ol><li> Iniciadores design contra bissulfito convertido sequência de ADN 33 e amplificar utilizando polimerase de ADN preferida de acordo com o protocolo do fabricante. Verificar o tamanho do produto amplificado, executando um gel de agarose a 1% de ADN a 100 V durante 45 min. Loja primers na concentração estoque de 20 mM em -20 ° C. </li></ol></li><li> Bissulfito converter 500-1000 ng de ADN de cada amostra e padrões de ADN metilado que variam de 0-100% em relação à mesma espécie animal 34. Elui-se amostras para proporcionar uma concentração de 20 ng / ul. Verificar a concentração de ADN convertido por meio de bisulfito espectrofotómetro 31. </li><li> 20 ul de configuração para reacções de amplificação MS-HRM utilizando polimerase de ADN preferida e iniciadores na concentração de 5 ^ M de acordo com a Tabela 1 e 2. Executar todas as amostras, incluindo os padrões de ADN metiladas e FACS, em triplicado. </li><li> Dependendo de software de análise, definir pré e pós iniciar e parar parâmetrosem torno das transições da curva de fusão. Set começar a pré-melt e os parâmetros de paragem pré-fusão assim que a diferença entre os dois é 0,2-0,5 ° C. Definir início de pós-fusão e pós-melt parar de forma semelhante. Extrair dados de diferença de temperatura de pico para cada amostra. </li><li> Utilizar percentagem normas metilados (valor-y) e seus correspondentes diferenças médias de temperatura de pico (valor-x) gerar uma equação de regressão linear (Figura 3A-B, Tabela 3-4). Use esta equação de regressão linear para estimar estado de metilação de amostras desconhecidas 35. </li></ol> 3. Avaliação Hyper-metilado Promotor Atividade via uso de ensaio de luciferase <ol><li> Identificar ilhas CpG do gene alvo (Passo 2.1). PCR amplificar regiões de interesse 36 e clone a montante do Firefly gene repórter de luciferase luc2 para produzir plasmídeos CpG-island-luc2 37. </li><li> Linearizar 30 ug do plasmídeo CpG-island-luc2 via restriçãodigestão enzimática 38. Verifique sites para digestão de restrição e evitar cortes de casal usando software cortador de 38 preferida. Calor-inactivar enzimas, à temperatura e duração apropriada, após digestão de acordo com o protocolo do fabricante. Perda mínima de ADN ocorre durante a etapa de linearização. </li><li> Metilato de plasmídeos linearizados utilizando CpG metilase (M.Sssl) O / N a 30 ° C ou deixam protocolo fabricante seguinte sem tratamento, exceto para os seguintes ajustes. </li><li> Realizar 50 reações ul. </li><li> Use 5 unidades de CpG metilase para metilar 700 ng do plasmídeo linearizado. </li><li> Execute reações O / N para 13-19 h. </li><li> Após reacção CpG metilase, executar a limpeza do DNA usando o padrão, comercialmente membrana de gel de sílica disponíveis limpar kit de acordo com o protocolo do fabricante. Perdas significativas de DNA ocorrem após reação metilase CpG, perda de 30-60%. </li><li> Verificar a metilação dos plasmídeos através de uma digestão de restrição Hpall. </li&gt; <li> Tomar 1 ug de ADN metilado ou não metilado e digestão de restrição com Hpa II durante 1 hora a 37 ° C. Use 5-10 unidades de Hpa II para cada ug de ADN. Após a digestão Hpa II, executar a limpeza DNA usando membrana comercialmente disponível sílica-gel limpar kit preferido,. Executar tanto CpG metilados plasmídeos e não metilados no ADN de um gel de agarose a 1% em tampão TAE ou TBE a 100 V durante 45 min para visualização (figura 4B). </li><li> Plasmídeos Assunto tanto metilados e não metilados a dupla digestão com enzimas de restrição apropriadas para liberar full-length luc 2 (vector) e ilha CpG (insert) fragmenta 38. Execute dupla digestão O / N à temperatura adequada e enzimas inatividade ao calor após digestão de acordo com o protocolo do fabricante. Perda mínima de concentração de DNA ocorre durante a restrição dupla digestão. </li><li> Executar plasmídeos duplamente digerido em gel de agarose a 1% de ADN a 100 V durante 1 h para permitir a separação óF vector e inserção (Figura 4C). Cuidado. Vestindo protetor rosto protetor UV, coloque gel DNA em uma luz negra tabletop para visualizar bandas. Com base no tamanho, consumo de inserção metilado e não metilado e não metilado vector utilizando uma lâmina cirúrgica limpo. </li><li> Extracto de gel de ADN utilizando fenol saturado, pH 6,6. Resumidamente, pesar de gel contendo o vector de ADN ou de inserção. Use 100 ul de fenol por 0,1 grama de gel de ADN. Homogeneizar em gel de ADN de fenol Dounce de vidro usando homogeneizador. </li><li> Adicionar clorofórmio (utilizando 1/5 do volume de fenol) e agitar amostras por 20 s. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 2-3 minutos. Centrifugar durante 15 minutos à velocidade máxima (16,1 x 1000 x g) a 4 ° C. </li><li> Remover solução aquosa e adicionar o volume de 0,1X de 3 M de acetato de sódio e o volume de 2,5X de etanol. Incubar as amostras durante 1 hora a -80 ° C. Após a incubação, remover o etanol e re-suspender o ADN em 30 ul de tampão preferido. Perda significativa de DNA ocorre isolamento seguimento de inserções e vetores, 30-50% loss. </li><li> Re-ligar inserções metilados e não metilados para não metilado vector utilizando DNA ligase T4 38. Usar uma proporção de 1: 4 de vector para inserir para reacções de ligação. Reação de configuração de acordo com as instruções do fabricante. Utilizar um volume total de 50 ul por reacções e incubar O / N à temperatura de -20 ° C ou sobre gelo com a tampa sobre o balde de gelo. </li><li> Após a ligação, executar a limpeza DNA usando membrana comercialmente disponível sílica-gel limpar kit preferido,. Uma perda significativa de ADN ocorrem após reacção de ligação, uma perda de aproximadamente 30-50% do DNA. Verifique re-ligação, executando em 1% de gel de agarose de ADN a 100 V durante 45 min e avaliar a concentração de plasmídeos re-ligado (Figura 4D). </li><li> Transfectar plasmídeos metilados ou não metilados nas células D54 usando um reagente de transfecção comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Células D54 sementes Onto de 12 poços na placa de 0,14 x 10 6 células / poço. </li><li> Na sequência de 24 horas, as células transf with concentrações iguais de ambos (1) plasmídeo não methyated CpG-luc2 + Renilla ou outro vector controle luciferase ou (2) metilado plasmídeo CpG-luc2 + Renilla ou outro vector controle luciferase. </li><li> Permitir que as células transf durante 24 horas antes de realizar ensaio de luciferase duplo. Realizar ensaio de acordo com as instruções do fabricante. Realizar as leituras utilizando um luminómetro. Leia cada poço em triplicado. </li><li> Calcular a relação da actividade da luciferase do pirilampo ou de Renilla para outra actividade de luciferase de controlo. Normalizar Firefly metilado: atividade luciferase controle para Firefly não metilado: atividade luciferase controle dividindo atividade luciferase metilado pela atividade luciferase não metilado </li></ol>

Os autores não têm divulgações.

Este protocolo descreve o isolamento de uma população enriquecida de astrócitos via FACS, bem como uma variedade de técnicas que permitem estudos correlativos e causais entre a metilação do DNA e a expressão gênica. Essas técnicas, usadas isoladamente ou em combinação, são particularmente úteis para laboratórios que trabalham com tecidos de alta heterogeneidade celular ou estão interessados no estado de metilação do DNA de um determinado gene ou região do gene versus alterações globais de metilação do DNA. Um desafio rel...

Epigenética é o estudo de modificações químicas que podem afetar a atividade transcricional do genoma. Essencialmente, sem uma alteração na sequência de DNA, modificações epigenéticas como metilação do DNA, acetilação de histonas e metilação de histonas são suficientes para alterar reversivelmente os padrões de expressão gênica 1. A metilação do DNA, um potente regulador da expressão gênica, é a modificação epigenética mais bem caracterizada. A metilação do DNA é a ligação covalente de grupos metil na posição C5 de uma citosina, normalmente a citosina de um dinucleotídeo citosina-guanina, também conhecido como sítio CpG. As áreas que contêm uma alta densidade de locais CpG são conhecidas como ilhas CpG (CGIs). Os CGIs são frequentemente associados a locais de início de transcrição (TSS) e promotores de genes 1-3. Assim, embora as mudanças na metilação do DNA em CGIs nem sempre sejam concomitantes com mudanças na expressão ou função celular, as mudanças na metilação do DNA em CGIs podem exercer uma regulação poderosa na atividade transcricional 2. 
Historicamente, observou-se que a metilação do DNA é essencial na embriogênese, imprinting e desenvolvimento, com poucas alterações nos níveis de metilação do DNA ocorrendo em células pós-mitóticas (com exceção de alterações em genes relacionados ao câncer) 4,5. No entanto, o campo da neuroepigenética destacou um importante papel não desenvolvimental para a metilação do DNA. Especificamente, a epigenética cognitiva redefiniu a metilação do DNA como um mecanismo altamente plástico integral na mediação da ativação transcricional e da repressão de genes essenciais para o processo de aprendizagem e memória 6. Além da epigenética cognitiva, estudos que modelam lesão isquêmica e dor neuropática caracterizam a metilação do DNA como um mecanismo lábil que responde rapidamente a uma variedade de insultos do SNC 7-9. Em relação aos astrócitos, várias linhas de evidência sugerem que a metilação do DNA desempenha um papel importante na astrogliogênese. Fan et al., descobriram que o KO condicional de DNMT1 em células progenitoras neurais (NPCs) resultou no desenvolvimento precoce de astrócitos concordantes com um estado global de hipometilação 10. Além disso, Perisic et al., concluíram que os níveis diferenciais de metilação do DNA do promotor GLT-1 mediaram os níveis diferenciais de expressão do transportador de glutamato no córtex e no cerebelo, enfatizando um papel na metilação do DNA no estabelecimento de padrões específicos da região cerebral de expressão gênica astrocítica 11. No geral, vários estudos ressaltam a natureza dinâmica e lábil da metilação do DNA no SNC, pois o ambiente, as drogas e as lesões demonstraram alterar a metilação do DNA e, muitas vezes, a expressão gênica 4,9. Juntos, esses estudos neuroepigenéticos apontam para a metilação do DNA como um alvo terapêutico viável com potencial para mitigar uma variedade de patologias do SNC.
À medida que o campo da epigenética expande sua compreensão do papel da metilação do DNA no neurodesenvolvimento e na doença, o desafio de mover a metilação do DNA em direção a um alvo terapêutico é realizar estudos não apenas correlativos, mas causais que definem alvos e locais genéticos específicos. Além disso, o levantamento de mudanças na metilação do DNA específicas para a região do cérebro e o tipo de célula continua sendo um desafio contínuo e digno de tempo, exclusivo do campo da neuroepigenética. Este protocolo utiliza uma variedade de técnicas, incluindo classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) de astrócitos, análise de fusão de alta resolução sensível à metilação (MS-HRM) e um ensaio de metilação luciferase para investigar o estado de metilação do DNA de KCNJ10, um gene que codifica para Kir4.1. Kir4.1 é um canal de potássio específico da glia que demonstra padrões de expressão específicos da região cerebral e da célula no SNC 12-16. A expressão de Kir4.1 aumenta movendo-se das regiões rostral para caudal do SNC, com a maior expressão ocorrendo na medula espinhal 15. Embora o canal seja expresso em células ependimárias, oligodendrócitos e suas células precursoras, Kir4.1 é predominantemente expresso em astrócitos e considerado essencial para manter os níveis homeostáticos de potássio, bem como apoiar a captação de glutamato, definindo o potencial de membrana astrocítica em repouso em -80mV hiperpolarizado 12,16-19. É importante ressaltar que a expressão de Kir4.1 não é estática tanto durante o desenvolvimento quanto após múltiplas formas de lesão do SNC 20-25. Queríamos examinar a regulação epigenética desse canal, especificamente em astrócitos durante o desenvolvimento. As técnicas utilizadas oferecem análises de locais CpG específicas e direcionadas a genes que fornecem evidências causais de um papel da metilação do DNA na regulação da expressão gênica KCNJ10. Essas técnicas podem ser aplicadas a outros genes.

<table><tbody><tr><td>Sistema de Dissociação de Papaína</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA / RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Metil Primer</td> Software <td>on-line</td> da <td>Applied Biosystems</td><td>para localizar Ilhas CpG</td></tr><tr><td>Kit de metilação de DNA EZ</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td></td></tr><tr><td>Padrão de calibração pré-misturado de rato</td><td>EpiGenDx</td><td>80-8060R-Premix</td><td></td></tr><tr><td>CpG Methylase (M.Sssl)</td><td>Zymo Research</td><td>E2010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction&nbsp;</td><td>QIagen</td><td>28704</td><td>Usado para extração de gel e limpeza de DNA</td></tr><tr><td>Enzimas de restrição</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cortador NEB</td><td>New England BioLabs</td><td>online</td><td>verificar sites de resumo de restrição</td></tr><tr><td>Sistema de ensaio de repórter de luciferase dupla</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Luc2 vetor, pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>vetor renilla, pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>TD-20/20 Luminômetro</td><td>Turner Designs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX e Plus Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A12621</td><td></td></tr><tr><td>Fenol, pH saturado 6.6/6.9</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 17501-100</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c Spectroftometer</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MeltDoctor Master Mix</td> Life <td>Technologies</td><td>4415440</td><td></td></tr><tr><td>Software de Fusão de Alta Resolução (HRM) v2.0</td><td>Life Technologies</td><td>4397808</td><td></td></tr><tr><td>Software AB SDS v2.3</td> Life <td>Technologies</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB High Resolution Melting Guia de Introdução&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB 7900HT Sistema rápido em tempo real</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

correlacionando dna alterações metilação específico do gene com expressão e transcrição atividade de astrocítica<em&gt; kcnj10</em&gt; (kir4.1)

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

A metilação do DNA serve para regular a expressão gênica através da ligação covalente de um grupo metil na posição C5 de uma citosina em um dinucleotídeo citosina-guanina. Embora a metilação do DNA forneça mudanças duradouras e estáveis na expressão gênica, os padrões e níveis de metilação do DNA também estão sujeitos a alterações com base em uma variedade de sinais e estímulos. Como tal, a metilação do DNA funciona como um regulador poderoso e dinâmico da expressão gênica. O estudo da neuroepigenética revelou uma variedade de estados fisiológicos e patológicos associados a mudanças globais e específicas de genes na metilação do DNA. Especificamente, existem correlações marcantes entre mudanças na expressão gênica e metilação do DNA em distúrbios neuropsiquiátricos e neurodegenerativos, durante a plasticidade sináptica e após lesão do SNC. No entanto, como o campo da neuroepigenética continua a expandir sua compreensão do papel da metilação do DNA na fisiologia do SNC, delinear relações causais em relação às mudanças na expressão gênica e metilação do DNA é essencial. Além disso, em relação ao campo mais amplo da neurociência, a presença de vastas diferenças específicas de regiões e células requer técnicas que abordem essas variações ao estudar o transcriptoma, proteoma e epigenoma. Aqui descrevemos a classificação FACS de astrócitos corticais que permite o exame subsequente de uma transcrição de RNA e metilação do DNA. Além disso, detalhamos uma técnica para examinar a metilação do DNA, análise de fusão de alta resolução sensível à metilação (MS-HRMA), bem como um ensaio de promotor de luciferase. Através do uso dessas técnicas combinadas, pode-se não apenas explorar mudanças correlativas entre a metilação do DNA e a expressão gênica, mas também avaliar diretamente se as mudanças no estado de metilação do DNA de uma determinada região do gene são suficientes para afetar a atividade transcricional.

Uma população enriquecida dos astrócitos foi adquirida via FACS classificação de eGFP-S100β animais transgênicos 27. Devido à diminuição da qualidade das células e moléculas moleculares isoladas de animais com idade superior a 50 dias pós-parto (p50), animais com idade p0-p40 são ideais para tais experimentos. Tecido cortical foi usada para estas experiências. Córtices de dois a seis animais foram reunidas. FACS foi realizada nas instalações UAB Comprehensive Citometria de Fluxo Core. Triagem foi realizada em...

A metilação do DNA é capaz de manter níveis estáveis de expressão gênica, além de permitir mudanças dinâmicas na expressão gênica em resposta a uma variedade de estímulos. Detalhamos técnicas que permitem o estudo de alterações específicas de genes na metilação do DNA e o efeito dessas mudanças na expressão gênica.

Correlacionando DNA Alterações metilação específico do gene com expressão e transcrição Atividade de astrocítica<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar o status de metilação do DNA do gene KCNJ10 em uma população enriquecida de astrócitos e correlacionar as alterações na metilação do DNA do promotor com a atividade transcricional opcional. Isso é realizado primeiramente isolando uma população enriquecida de astrócitos corticais a partir do cérebro inteiro de roedores por meio de triagem celular, em seguida o DNA é isolado da população enriquecida de astrócitos. Então, o status de metilação do DNA do KCNJ10 é avaliado utilizando a análise de dissociação de alta resolução sensível à metilação, ou MS.HRMA.Por fim, o promotor KCNJ10 é hipermetilado e o ensaio de luciferase é utilizado para correlacionar alterações na metilação do DNA do promotor com a atividade transcricional. Em última análise, MS.HRMA e o ensaio de luciferase são usados para medir o estado de metilação do DNA de KCNJ10 e correlacionar alterações na metilação do promotor com a atividade transcricional do gene. O procedimento será demonstrado. Um pesquisador pós-doutorando do meu laboratório manipulou todos os animais de acordo com as Diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde, e o Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade do Alabama em Birmingham aprovou o uso de animais.Todos os tampões e reagentes foram preparados de acordo com o protocolo descrito no texto. Após dissecar os córtices da cabeça de um animal eutanasiado, de acordo com o protocolo descrito no texto, corte ou use uma dremel para fazer um orifício no topo de um tubo cônico de 50 mililitros, permitindo que uma tubulação seja inserida no tubo. Em seguida, adicione a solução de papaina ao tubo.Coloque os córtices dissecados em uma placa de cultura de 10 milímetros contendo meio de dissociação equilibrado a 95%O₂ e 5%CO₂ e use uma lâmina de barbear limpa para picar o tecido em pedaços de um por um milímetro quadrado. Com uma pipeta de 10 mililitros, transfira o tecido para o tubo de 50 mililitros contendo a solução de pepanase. Deixe o tecido sedimentar no fundo da pipeta antes de transferi-lo.Para minimizar a quantidade de meio de dissociação carreado sem provocar formação de bolhas na solução de pepanase, aplique um fluxo constante de 95%O₂ para 5%CO₂ por meio de troca gasosa na superfície durante a incubação em banho-maria a 37 graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, utilize uma pipeta de transferência de 10 mililitros para agitar lentamente o tecido 10 vezes, centrifugue a suspensão celular turva a 300 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Equilibre a solução inibidora de albúmina de DNA por meio de troca gasosa na superfície e ressuspenda as células em pelote em três mililitros da solução.Em seguida, prepare um gradiente de densidade descontínuo comercial seguindo as instruções do fabricante. Gire o gradiente de densidade descontínuo a 70 G durante seis minutos. Em seguida, isole as células dissociadas da parte inferior do tubo utilizando uma pipeta para aspirar o meio.Utilize dois a três mililitros de DPBS com 0,02% de albúmina sérica bovina e um miligrama por mililitro de DNA ou meio de preferência. Para reutilizar, suspenda as células dissociadas. Passe as células através de um filtro de 40 microgramas antes de realizar a triagem de fatores e a extração de DNA ou RNA de acordo com o protocolo descrito.Após projetar primers contra uma sequência de DNA convertida por bisulfito e amplificar o DNA de acordo com o protocolo descrito, converta com bisulfito de 500 a 1000 nanogramas de DNA de cada amostra e de padrões de DNA metilado variando de zero a 100%, provenientes da mesma espécie animal, utilizando uma DNA polimerase preferencial e primers a cinco micromolares. Prepare reações de 20 microlitros para amplificação por Ms HRM. De acordo com esta tabela, execute todas as amostras, incluindo DNA de controle e padrões metilados, em triplicata, dependendo do software de análise, com parâmetros pré e pós-iniciais e finais ajustados ao redor das transições da curva de dissociação.Defina os parâmetros de início e término da pré-fusão. A diferença entre os dois deve ser de 0,2 a 0,5 graus Celsius. Defina da mesma forma o início e término da pós-fusão e extraia os dados da diferença de temperatura de pico para cada amostra utilizando padrões de metilação percentual e suas respectivas diferenças de temperatura de pico.Gere uma equação de regressão linear. Utilize esta equação de regressão linear para estimar o status de metilação de amostras desconhecidas após identificar ilhas CPG de interesse e amplificar e clonar a ilha CPG Luke dois plasmídeos de acordo com o protocolo descrito no texto. Utilize o software Preferred Cutter para verificar os sítios de digestão por restrição, evitando cortes duplos, e linearize 30 microgramas do plasmídeo uma vez que a amostra tenha sido digerida com as enzimas apropriadas.Inative as enzimas pelo calor na temperatura e duração apropriadas em reações de 50 microlitros. Utilize cinco unidades de metilase CPG para metilar 700 microgramas de plasmídeos linearizados a 30 graus Celsius por 13 a 19 horas.Após a purificação do DNA conforme descrito no protocolo textual, realize uma dupla digestão com a enzima de restrição HPA em amostras de um micrograma de DNA metilado, incubando a 37 graus Celsius por uma hora. Após a purificação do DNA, execute as amostras em um gel de agarose 1%, a 100 volts, por 45 minutos para visualização. Em seguida, submeta plasmídeos metilados e não metilados à digestão dupla com enzimas de restrição apropriadas, durante a noite, para liberar o vetor completo Luke dois e os fragmentos da ilha CPG.Inative as enzimas pelo calor após a digestão. Execute as amostras digeridas em duplicado em um gel de agarose 1% a 100 volts durante uma hora para separar o vetor e o inserto; em seguida, utilizando proteção contra luz UV, coloque o gel sob luz negra e, com lâminas cirúrgicas limpas, recorte os insertos metilados e não metilados. Após extrair o DNA conforme o protocolo descrito, use a DNA ligase T4 e uma proporção de um para quatro de vetor para inserto para ligar os insertos metilados e não metilados em um vetor não metilado. Incube a menos 20 graus Celsius ou sobre gelo durante a noite após a ligação.Limpe o DNA e verifique a religação realizando amostras em um gel de agarose de DNA a 1%, e avalie a concentração do plasmídeo religado. Semente células CD54 em uma placa de 12 poços com 140.000 células por poço. Após 24 horas, utilize um reagente de transfeção comercial para transfectar as células com concentrações iguais de plasmídeo não metilado CPG loop dois mais RAN vanilla ou outro vetor controle ferroso, ou plasmídeo metilado cpg Luke dois mais ELLA ou outro vetor controle luciferase. Incube as células para transfeção por 24 horas antes de realizar o ensaio de luciferase.De acordo com as instruções do fabricante, use um luminômetro para ler cada poço em triplicata. Calcule a razão entre a atividade da luciferase de vagalume e a luciferase de ranilla ou outro controle. Atividade da luciferase.Normalize a atividade da luciferase de controle metilada pela atividade da luciferase de controle não metilada dividindo a atividade metilada pela atividade da luciferase metilada. Como demonstrado aqui, uma população enriquecida de astrócitos foi obtida por meio de triagem por fax de animais transgênicos E-G-F-P-S 100 beta. Uma população selecionada foi direcionada com base no espalhamento para frente e lateral, e uma população de células viáveis foi determinada usando um indicador de células mortas com brometo; os dados de seleção apresentados aqui são imagens representativas de astrócitos positivos para EGFP após dissociação, mas antes da triagem, bem como após a triagem. Esta figura mostra uma população isolada de células positivas para EGFP que demonstrou um aumento de 40 vezes no mRNA para o marcador específico de astrócito.Uma LDH uma L uma. Além disso, apesar da expressão compartilhada de S100 beta e OPCs NG2 positivos e astrócitos, observou-se uma redução quatro vezes maior no mRNA de NG2, um marcador para células precursoras de oligodendrócitos, indicando o isolamento de uma população celular astrócita enriquecida. Esta tabela lista o RNA e DNA totais, isolados de idades e números variados de animais, e é apresentada como referência para o rendimento esperado de moléculas moleculares após os fatos.Finalmente, um ensaio de luciferase dual foi utilizado para avaliar a atividade transcricional de regiões hipermetiladas do gene de interesse após a transferência do inserto metilado para um vetor não metilado. A enzima HPA II, que digere apenas DNA não metilado, foi usada para verificar o estado de metilação do plasmídeo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar uma população enriquecida de astrócitos utilizando FACS, bem como de como medir a metilação de DNA de um gene e correlacionar alterações na metilação de DNA do promotor com a atividade transcricional, utilizando respectivamente a análise de dissociação de alta resolução sensível à metilação e o ensaio de luciferase.

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Biologia

Um fluxo de trabalho simplificado para estudar a metilação do DNA e alterações de expressão gênica em início de vida estresse é mostrado. A partir de separação materno de ratos recém-nascidos e isolamento de tecidos cerebrais discretas, que representam um protocolo para simultaneamente isolar DNA e RNA de punções de tecido cerebral para a sequenciação bissulfito subsequente e RT-PCR.

Análise otimizado de metilação do DNA e expressão gênica de pequenas áreas anatomicamente definidos do Cérebro

A preparação de fatias cerebrais agudas de isolado hipocampo, assim como as gravações simultâneas electrofisiológicas de astrócitos e neurónios...

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Este estudo descreve os procedimentos de criação de um axônio neuronal e romance (astro) glia plataforma de co-cultura. Neste sistema de co-cultura, a manipulação da interacção directa entre um único axónio (e única célula glial) torna-se possível, permitindo a análise mecanicista do neurónio mútuo de sinalização gliais.

Análise de imagens de Neuron Glia para Interação em Plataforma Cultura microfluídicos (MCP) baseado Axon Neuronal e Sistema Glia co-cultura

Descrevemos aqui uma adaptação de protocolos utilizados para induzir plasticidade homeostático em neurónios para o estudo da plasticidade dos receptores acoplados à proteína G astrocíticos. Recentemente usado para examinar as mudanças no grupo I astrocitário mGluRs em ratos juvenis, o método pode ser aplicado para medir o dimensionamento de vários GPCRs astrocitárias, em tecidos de camundongos adultos in situ e in vivo, e para obter uma melhor apreciação da sensibilidade dos receptores...

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As propriedades e funções dos sinais intracelulares de Ca2+ dos astrócitos no estriado permanecem incompletamente exploradas. Descrevemos métodos para expressar indicadores de cálcio geneticamente codificados em astrócitos estriados usando vírus adeno-associados do sorotipo 2/5 (AAV2/5), bem como procedimentos para obter imagens confiáveis de sinais de Ca2+ em astrócitos estriados in situ.

Imagens intracelular Ca 2+ Sinais em estriado astrócitos de ratos adultos, através de indicadores de cálcio geneticamente codificados

O objetivo deste protocolo é usar a técnica de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) para classificar tipos específicos de células neurais para análise subsequente da expressão gênica específica do tipo de célula, marcadores epigenéticos e/ou expressão de proteínas.

Usando fluorescência celular ativado Classificando a Examine-Cell-tipo específico Expressão Gênica em Tissue cérebro de um rato

O objetivo deste relato é descrever o protocolo para a deteção de imuno-histoquímica robusto de marcadores epigenéticas, 5-metilcitosina (5mC) e 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) no desenvolvimento e postmitotic mouse retina.

Deteção de immunohistochemical da 5-metilcitosina e 5-Hidroximetilcitosina no desenvolvimento e Mouse Postmitotic Retina

Os astrócitos ladrilho o córtex cerebral uniformemente, tornando a análise de sua morfologia complexa desafiadora a nível celular. O protocolo aqui fornecido usa rotulagem multicolorida baseada na eletroporação uterónica para destacar os astrócitos corticais e analisar seu volume e morfologia com um pipeline de análise de imagem fácil de usar.

Em Utero Eletroporation de Marcadores de Cor Multiaddressable (MAGIC) para Individualizar Astrócitos de Ratos Cortical

Este artigo apresenta um protocolo para usar o DeepSpaceDB, um banco de dados dinâmico e interativo para transcriptômica espacial, oferecendo fluxos de trabalho de análise e exemplos para explorar a organização do tecido e a expressão gênica relacionada à doença.

Mineração de conjuntos de dados transcriptômicos espaciais usando o DeepSpaceDB

Esse protocolo fornece uma descrição abrangente de um método para o registro simultâneo de sinais de cálcio de neurônios e astrócitos em múltiplas regiões cerebrais relacionadas à memória e demonstra sua aplicação durante um paradigma de aprendizagem e comportamento da memória.

Um método de fotometria de fibra bicolorida para registrar a atividade dos neurônios dos astrócitos em múltiplas regiões cerebrais durante comportamentos de aprendizagem e memória

Aprenda a avaliar a metilação do DNA do gene KCNJ10 em astrocitos usando MS.HRMA e ensaio de luciferase. Este método correlaciona alterações epigenéticas com atividade transcricional em neurociência.

Correlacionando DNA Alterações metilação específico do gene com expressão e transcrição Atividade de astrocítica KCNJ10 (Kir4.1) (Vídeo) | JoVE Journal

Correlacionando DNA Alterações metilação específico do gene com expressão e transcrição Atividade de astrocítica

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