Correlacionando DNA Alterações metilação específico do gene com expressão e transcrição Atividade de astrocítica KCNJ10 (Kir4.1)

O objetivo geral deste procedimento é avaliar o estado de metilação do DNA de KCNJ 10 em uma população enriquecida de astrócitos e correlacionar as alterações de metilação do DNA do promotor com a atividade opcional transcricional. Isso é feito isolando primeiro uma população enriquecida de astrócitos corticais de todo o cérebro de roedores por meio da classificação de fatos: o próximo DNA é isolado da população enriquecida de astrócitos. Em seguida, o status de metilação do DNA de KC J 10 é avaliado usando análise de fusão de alta resolução sensível à metilação ou MS. HRMA.

Finalmente, o promotor KC J 10 é hipermetilado e o ensaio de lúciferes é utilizado para correlacionar mudanças na metilação do DNA do promotor com a atividade transcricional. Em última análise, MS. HRMA e o ensaio de luciferase são usados para medir o estado de metilação do DNA de KCNJ 10 e correlacionar mudanças na metilação do promotor e atividade transcricional do gene Demonstrando o procedimento será visto. Um pós-doutorando do meu laboratório, Todos os animais foram tratados de acordo com as Diretrizes do National Institutes of Health, o Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Alabama em Birmingham aprovou o uso de animais.

Todos os tampões e reagentes foram preparados de acordo com o protocolo de texto. Depois de dissecar os córtices da cabeça de um animal sacrificado, de acordo com o protocolo de texto, corte ou faça um orifício na parte superior de um tubo cônico de 50 mililitros para permitir que o tubo seja alimentado no tubo. Em seguida, adicione a solução de papina ao tubo.

Coloque os córtices dissecados em uma placa de cultura de 10 milímetros contendo meio de dissociação equilibrado a 95% de O2 a 5% de CO2 e use uma lâmina de barbear limpa para picar o tecido em pedaços de um por um milímetro quadrado. Com uma pipeta de 10 mililitros, os homens transferem o tecido para o tubo de 50 mililitros contendo a solução de pepane. Deixe o tecido assentar no fundo da pipeta de transferência antes de descarregar.

Para minimizar a quantidade de meio de dissociação transportado sem borbulhar a solução de pepane, aplique um fluxo constante de 95% de O2 a 5% de CO2 por meio de troca gasosa de superfície enquanto incuba em banho-maria a 37 graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, use uma pipeta de transferência de 10 mililitros para tatear lentamente o tecido 10 vezes centrifugue a suspensão de células turvas a 300 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Equilibre a solução inibidora de albumina do DNA por meio de trocas gasosas de superfície e ressuspenda as células peletizadas em três mililitros da solução.

Em seguida, prepare um gradiente de densidade descontínuo comercial seguindo as instruções do fabricante. Girar o gradiente de densidade descontínuo a 70 G durante seis minutos. Em seguida, isole as células dissociadas do fundo do tubo usando uma pipeta para aspirar o meio.

Use dois a três mililitros de DPBS com 0,02% de albumina de soro bovino e um miligrama por mililitro de DNA ou meio preferido. Para reus, suspenda as células dissociadas. Passar as células por um filtro de 40 microgramas antes de proceder à triagem dos factos e à extracção de ADN ou ARN de acordo com o protocolo de texto.

Depois de projetar primers contra uma sequência de DNA convertida em bissulfito e amplificar o DNA de acordo com o protocolo de texto por sulfito, converta 500 a 1000 nanogramas de DNA de cada amostra e padrões de DNA metilado variando de zero a 100% da mesma espécie animal usando uma DNA polimerase preferida e cinco primers micromolares. Configure reações de 20 microlitros para amplificação Ms HRM. De acordo com esta tabela, execute todas as amostras, incluindo fax, DNA e padrões metilados em triplicado, dependendo do conjunto de software de análise, parâmetros pré e pós-início e parada em torno das transições da curva de fusão.

Defina os parâmetros prem melt, start e prem melt stop. Portanto, a diferença entre os dois é de 0,2 a 0,5 graus Celsius. Defina pós-fusão, inicie e pare de forma semelhante e extraia os dados de diferença de temperatura de pico para cada amostra usando padrões de porcentagem metilada e suas diferenças de temperatura de pico correspondentes.

Gere uma equação de regressão linear. Use esta equação de regressão linear para estimar o status de metilação de amostras desconhecidas após identificar as ilhas CPG de interesse e amplificar e clonar o plasmídeo Lucas dois da ilha CPG de acordo com o protocolo de texto. Use o software de corte preferido para verificar os locais de digestão de restrição para evitar cortes duplos e linearizar 30 microgramas de plasmídeo assim que a amostra tiver sido digerida com as enzimas apropriadas.

Inativar enzimas por calor na temperatura e duração apropriadas em reações de 50 microlitros. Use cinco unidades de metilato de CPG para metilar. 700 microgramas de plasmídeos linearizados a 30 graus Celsius por 13 a 19 horas.

Depois de limpar o DNA conforme descrito no protocolo de texto, realizar uma digestão de restrição de dois HPA em amostras de um micrograma de DNA metilado incubando a 37 graus Celsius por uma hora. Depois de limpar as amostras de DNA, execute amostras em um gel de DNA a 100 volts por 45 minutos para visualização. Em seguida, os plasmídeos metilados e não metilados para digestão dupla com enzimas de restrição apropriadas durante a noite para liberar os fragmentos de dois vetores e ilhas CPG de comprimento total.

O calor inativa as enzimas após a digestão. Execute as amostras digeridas dobro em um gel dos agros 1%DNA em 100 volts por uma hora para separar o vetor e introduza então ao usar a proteção contra a luz UV, coloque o gel em uma luz preta e com lâminas cirúrgicas limpas, extirpe as inserções methylated e não methylated após o gel que extrai o ADN de acordo com o protocolo do texto, use T quatro DNA Ligase e uma proporção de um para quatro de vetor a ser inserido para relegar as inserções metiladas e não metiladas em um vetor não metilado. Incubar a 20 graus Celsius negativos ou no gelo durante a noite após a ligadura.

Limpe o DNA e verifique a religação executando amostras em um gel aros de 1% de DNA e avalie a concentração de células CD 54 de plasmídeo religadas em uma placa de 12 poços a 140.000 células por poço. 24 horas depois. Use um reagente de transfecção comercial para transfectar células com concentrações iguais de plasmídeo CPG loop dois não metilado mais RAN baunilha ou outro vetor feroso de controle ou metilado c pg Luke dois plasmídeos mais ELLA ou outro vetor de lúciferes de controle Deixe as células transfectarem por 24 horas antes de realizar um ensaio de lúciferes.

De acordo com as instruções do fabricante, use o luminômetro para ler cada poço em triplicado. Calcule a proporção da atividade dos lúciferes vaga-lumes para a baunilha executada ou outro controle. Atividade de Lúcifer.

Normalize a atividade de luciferase de controle de vaga-lumes metilada para a atividade de luciferase de controle de vaga-lumes não metilada, dividindo a atividade metilada pela atividade de luc metilada. Como demonstrado aqui, uma população enriquecida de astrócitos foi adquirida por meio de triagem por fax de animais transgênicos beta 100 EGFPS. Uma população fechada foi direcionada com base na dispersão direta e lateral, e uma população de células vivas foi determinada usando um indicador de células mortas de brometo e gating mostrado aqui são imagens representativas de astrócitos positivos para EGFP após a dissociação, mas antes da classificação, bem como após a classificação, esta figura mostra uma população isolada de células positivas para EGFP que demonstrou um aumento de 40 vezes no mRNA para o marcador específico do astrócitos.

Um LDH um L um. Além disso, apesar da expressão compartilhada de S 100 beta e NG dois OPCs e astrócitos positivos, uma redução de quatro vezes no NG dois mRNA, um marcador para células precursoras de oligodendrócitos foi observado, indicando o isolamento de uma população de células astrocíticas enriquecida. Esta tabela lista o RNA e o DNA totais, isolados de idades e números variados de animais, e é listada como referência para o rendimento esperado de moléculas moleculares após os fatos.

Finalmente, um ensaio de lúcifer duplo foi utilizado para avaliar a atividade transcricional de regiões hipermetiladas do gene de interesse após mover o inserto metilado para um vetor não metilado. O HPA dois, que digere apenas DNA não metilado, foi usado para verificar o status de metilação do plasmídeo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar uma população enriquecida de astrócitos usando fatos, bem como medir a metilação do DNA de um gene e correlacionar as mudanças na metilação do DNA do promotor com a atividade transcricional usando análise de fusão de alta resolução sensível à metilação e ensaio de luciferase, respectivamente.