Correlacionando DNA Alterações metilação específico do gene com expressão e transcrição Atividade de astrocítica

O objetivo geral deste procedimento é avaliar o status de metilação do DNA do gene KCNJ10 em uma população enriquecida de astrócitos e correlacionar as alterações na metilação do DNA do promotor com a atividade transcricional opcional. Isso é realizado primeiramente isolando uma população enriquecida de astrócitos corticais a partir do cérebro inteiro de roedores por meio de triagem celular, em seguida o DNA é isolado da população enriquecida de astrócitos. Então, o status de metilação do DNA do KCNJ10 é avaliado utilizando a análise de dissociação de alta resolução sensível à metilação, ou MS.HRMA.

Por fim, o promotor KCNJ10 é hipermetilado e o ensaio de luciferase é utilizado para correlacionar alterações na metilação do DNA do promotor com a atividade transcricional. Em última análise, MS.HRMA e o ensaio de luciferase são usados para medir o estado de metilação do DNA de KCNJ10 e correlacionar alterações na metilação do promotor com a atividade transcricional do gene. O procedimento será demonstrado. Um pesquisador pós-doutorando do meu laboratório manipulou todos os animais de acordo com as Diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde, e o Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade do Alabama em Birmingham aprovou o uso de animais.

Todos os tampões e reagentes foram preparados de acordo com o protocolo descrito no texto. Após dissecar os córtices da cabeça de um animal eutanasiado, de acordo com o protocolo descrito no texto, corte ou use uma dremel para fazer um orifício no topo de um tubo cônico de 50 mililitros, permitindo que uma tubulação seja inserida no tubo. Em seguida, adicione a solução de papaina ao tubo.

Coloque os córtices dissecados em uma placa de cultura de 10 milímetros contendo meio de dissociação equilibrado a 95%O₂ e 5%CO₂ e use uma lâmina de barbear limpa para picar o tecido em pedaços de um por um milímetro quadrado. Com uma pipeta de 10 mililitros, transfira o tecido para o tubo de 50 mililitros contendo a solução de pepanase. Deixe o tecido sedimentar no fundo da pipeta antes de transferi-lo.

Para minimizar a quantidade de meio de dissociação carreado sem provocar formação de bolhas na solução de pepanase, aplique um fluxo constante de 95%O₂ para 5%CO₂ por meio de troca gasosa na superfície durante a incubação em banho-maria a 37 graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, utilize uma pipeta de transferência de 10 mililitros para agitar lentamente o tecido 10 vezes, centrifugue a suspensão celular turva a 300 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Equilibre a solução inibidora de albúmina de DNA por meio de troca gasosa na superfície e ressuspenda as células em pelote em três mililitros da solução.

Em seguida, prepare um gradiente de densidade descontínuo comercial seguindo as instruções do fabricante. Gire o gradiente de densidade descontínuo a 70 G durante seis minutos. Em seguida, isole as células dissociadas da parte inferior do tubo utilizando uma pipeta para aspirar o meio.

Utilize dois a três mililitros de DPBS com 0,02% de albúmina sérica bovina e um miligrama por mililitro de DNA ou meio de preferência. Para reutilizar, suspenda as células dissociadas. Passe as células através de um filtro de 40 microgramas antes de realizar a triagem de fatores e a extração de DNA ou RNA de acordo com o protocolo descrito.

Após projetar primers contra uma sequência de DNA convertida por bisulfito e amplificar o DNA de acordo com o protocolo descrito, converta com bisulfito de 500 a 1000 nanogramas de DNA de cada amostra e de padrões de DNA metilado variando de zero a 100%, provenientes da mesma espécie animal, utilizando uma DNA polimerase preferencial e primers a cinco micromolares. Prepare reações de 20 microlitros para amplificação por Ms HRM. De acordo com esta tabela, execute todas as amostras, incluindo DNA de controle e padrões metilados, em triplicata, dependendo do software de análise, com parâmetros pré e pós-iniciais e finais ajustados ao redor das transições da curva de dissociação.

Defina os parâmetros de início e término da pré-fusão. A diferença entre os dois deve ser de 0,2 a 0,5 graus Celsius. Defina da mesma forma o início e término da pós-fusão e extraia os dados da diferença de temperatura de pico para cada amostra utilizando padrões de metilação percentual e suas respectivas diferenças de temperatura de pico.

Gere uma equação de regressão linear. Utilize esta equação de regressão linear para estimar o status de metilação de amostras desconhecidas após identificar ilhas CPG de interesse e amplificar e clonar a ilha CPG Luke dois plasmídeos de acordo com o protocolo descrito no texto. Utilize o software Preferred Cutter para verificar os sítios de digestão por restrição, evitando cortes duplos, e linearize 30 microgramas do plasmídeo uma vez que a amostra tenha sido digerida com as enzimas apropriadas.

Inative as enzimas pelo calor na temperatura e duração apropriadas em reações de 50 microlitros. Utilize cinco unidades de metilase CPG para metilar 700 microgramas de plasmídeos linearizados a 30 graus Celsius por 13 a 19 horas.

Após a purificação do DNA conforme descrito no protocolo textual, realize uma dupla digestão com a enzima de restrição HPA em amostras de um micrograma de DNA metilado, incubando a 37 graus Celsius por uma hora. Após a purificação do DNA, execute as amostras em um gel de agarose 1%, a 100 volts, por 45 minutos para visualização. Em seguida, submeta plasmídeos metilados e não metilados à digestão dupla com enzimas de restrição apropriadas, durante a noite, para liberar o vetor completo Luke dois e os fragmentos da ilha CPG.

Inative as enzimas pelo calor após a digestão. Execute as amostras digeridas em duplicado em um gel de agarose 1% a 100 volts durante uma hora para separar o vetor e o inserto; em seguida, utilizando proteção contra luz UV, coloque o gel sob luz negra e, com lâminas cirúrgicas limpas, recorte os insertos metilados e não metilados. Após extrair o DNA conforme o protocolo descrito, use a DNA ligase T4 e uma proporção de um para quatro de vetor para inserto para ligar os insertos metilados e não metilados em um vetor não metilado. Incube a menos 20 graus Celsius ou sobre gelo durante a noite após a ligação.

Limpe o DNA e verifique a religação realizando amostras em um gel de agarose de DNA a 1%, e avalie a concentração do plasmídeo religado. Semente células CD54 em uma placa de 12 poços com 140.000 células por poço. Após 24 horas, utilize um reagente de transfeção comercial para transfectar as células com concentrações iguais de plasmídeo não metilado CPG loop dois mais RAN vanilla ou outro vetor controle ferroso, ou plasmídeo metilado cpg Luke dois mais ELLA ou outro vetor controle luciferase. Incube as células para transfeção por 24 horas antes de realizar o ensaio de luciferase.

De acordo com as instruções do fabricante, use um luminômetro para ler cada poço em triplicata. Calcule a razão entre a atividade da luciferase de vagalume e a luciferase de ranilla ou outro controle. Atividade da luciferase.

Normalize a atividade da luciferase de controle metilada pela atividade da luciferase de controle não metilada dividindo a atividade metilada pela atividade da luciferase metilada. Como demonstrado aqui, uma população enriquecida de astrócitos foi obtida por meio de triagem por fax de animais transgênicos E-G-F-P-S 100 beta. Uma população selecionada foi direcionada com base no espalhamento para frente e lateral, e uma população de células viáveis foi determinada usando um indicador de células mortas com brometo; os dados de seleção apresentados aqui são imagens representativas de astrócitos positivos para EGFP após dissociação, mas antes da triagem, bem como após a triagem. Esta figura mostra uma população isolada de células positivas para EGFP que demonstrou um aumento de 40 vezes no mRNA para o marcador específico de astrócito.

Uma LDH uma L uma. Além disso, apesar da expressão compartilhada de S100 beta e OPCs NG2 positivos e astrócitos, observou-se uma redução quatro vezes maior no mRNA de NG2, um marcador para células precursoras de oligodendrócitos, indicando o isolamento de uma população celular astrócita enriquecida. Esta tabela lista o RNA e DNA totais, isolados de idades e números variados de animais, e é apresentada como referência para o rendimento esperado de moléculas moleculares após os fatos.

Finalmente, um ensaio de luciferase dual foi utilizado para avaliar a atividade transcricional de regiões hipermetiladas do gene de interesse após a transferência do inserto metilado para um vetor não metilado. A enzima HPA II, que digere apenas DNA não metilado, foi usada para verificar o estado de metilação do plasmídeo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar uma população enriquecida de astrócitos utilizando FACS, bem como de como medir a metilação de DNA de um gene e correlacionar alterações na metilação de DNA do promotor com a atividade transcricional, utilizando respectivamente a análise de dissociação de alta resolução sensível à metilação e o ensaio de luciferase.