Detecção de variantes raras genômico de Seqüenciamento combinados usando SPLINTER

O objetivo geral deste procedimento é identificar genes dentro de uma população de indivíduos que mostram uma preponderância de rara variação funcional. Isso é feito primeiro reunindo uma população de amostras de DNA. A segunda etapa é criar e sequenciar uma biblioteca de sequenciamento de próxima geração.

Isso é seguido pelo alinhamento das leituras com a sequência de referência e a criação de um modelo de erro. A etapa final é a análise computacional usando o algoritmo de fragmentação. Em última análise, a análise fragmentada do sequenciamento de próxima geração agrupado é usada para mostrar genes dentro de populações que abrigam uma preponderância de rara variância funcional Demonstrando o procedimento.

Hoje será Francesco Vilania, que é um estudante de pós-graduação no laboratório do meu mentor e nosso colaborador, Rob Mitra, e ele será acompanhado por Enrique Ramos, um estudante de pós-graduação no meu laboratório. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como genótipos individuais únicos, é que ela permite detectar com muita precisão variantes de sequências raras em uma população mista de moléculas de DNA sem exigir nenhuma informação prévia. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da genética e da genômica, como determinar a frequência de novas doenças que causam variantes raras em grandes estudos de coorte.

Cada experimento de lascas requer a presença de um controle negativo e positivo para obter a precisão ideal, prepare a mistura de reação de PCR usando PFU de ultra alta fidelidade. DNA polimerase. O controle negativo é um produto de PCR de qualquer sequência de DNA conhecida por não ter variação genética, como uma estrutura de vetor clonado.

Aqui, um amplicon de 1.934 pares de bases do vetor M 13 MP 18 é usado. O controle positivo pode ser qualquer conjunto de variantes de sequência previamente validadas presentes em toda a população. Se esses dados não estiverem disponíveis, este laboratório projetou um controle positivo artificial que consiste em uma base 331 por produto de PCR a partir de uma mistura de sequências projetadas clonadas no vetor fácil PGMT, conforme listado nesta tabela.

Essas sequências são combinadas para imitar várias frequências de alelos menores de variantes verdadeiras dentro do grupo de pacientes. Após a amplificação de PCR de amostras, conforme discutido no protocolo escrito que acompanha este vídeo, limpe cada produto de PCR do excesso de primers usando a purificação rápida de coluna de caiaque kyogen ou placas de filtro de 96 poços com coletor de vácuo para limpeza em larga escala. Uma vez purificado, quantifique cada produto de PCR usando técnicas padrão.

Prepare-se para combinar todos os produtos e controles de PCR em um pool normalizado pelo número de moléculas. O agrupamento por concentração resultará em super-representação de pequenos amplicons em relação a produtos maiores. Em vez disso, agrupe um número normalizado de moléculas por amplicons.

Escolha números arbitrários que sejam grandes o suficiente para manter a precisão durante a pipetagem. Puxe os produtos e controles de PCR. A ligação dos produtos de PCR é necessária porque a fragmentação de pequenos requerentes de PCR provavelmente influenciará a representação em direção a seus fins.

Por esse motivo, ligamos os produtos de PCR de tração em grande controle antes de sua fragmentação. Prepare a mistura para ligadura sem corte usando T quatro Ligase, T quatro PNK e PEG conforme listado no protocolo. Incube a reação a 22 graus Celsius por 17 horas.

Siga com a incubação a 65 graus Celsius por 20 minutos e mantenha a quatro graus Celsius. Verifique a ligação carregando 50 nanogramas de amostra em um gel de ressurgimento. A ligadura bem-sucedida resultará em uma faixa de alto peso molecular presente na pista.

Prepare-se para a fragmentação do DNA por meio de uma estratégia de sonicação aleatória, diluindo a amostra de 10 para um no Qiagen PB Buffer para torná-la menos viscosa. Em seguida, fragmente o grande cone de produtos de PCR usando uma biorruptura de nó diagonal de 24 amostras, sonice em alta potência ao longo de 25 minutos com 40 segundos ligados e 20 segundos desligados por minuto. Verifique os resultados da fragmentação do DNA em um agrogel e prossiga com o sequenciamento luminoso conforme descrito no texto.

Para iniciar o sequenciamento, leia alinhamento. Converta o sequenciamento bruto, leia os arquivos em formato scarf ou compacte-os. A compactação é opcional.

Economiza tempo e espaço para as etapas de análise subsequentes sem perder nenhuma informação relevante. Usando a ferramenta de alinhamento incluída, alinhe as leituras brutas à sequência de referência mais rápida anotada. Específicos para as regiões-alvo incluem as reações de PCR, bem como os controles positivos e negativos.

O formato de entrada deve estar em formato de cachecol ou compactado. Em seguida, execute a marcação de arquivos conforme descrito no texto. Cada execução gera um perfil exclusivo de erro de sequenciamento a ser caracterizado para chamada de variante precisa para modelar erros para cada execução.

Um controle interno conhecido por ser implantado da variação de sequência é incluído em cada biblioteca de exemplo de pool do arquivo marcado alinhado. Gere um arquivo de modelo de erro usando a ferramenta incluída com a sequência de referência de controle negativo, toda a sequência de controle negativo pode ser usada ou, alternativamente, apenas um subconjunto quando especificado por suas cinco extremidades principais e três principais. Leituras exclusivas e pseudocontagens devem sempre ser aplicadas.

A ferramenta gerará três arquivos nomeados como o parâmetro de nome do arquivo de saída terminando com zero, um ou dois. Esses arquivos correspondem a um modelo de erro zero de primeira e segunda ordem, respectivamente, para chamadas variantes com fragmentação. O modelo de erro de segunda ordem deve sempre ser usado para visualização do perfil de taxa de erro de execução.

O script Pearl usado para plotar o gráfico do modelo de erro pode ser empregado para gerar um gráfico de erro PDF no arquivo de modelo de erro de ordem zero. O arquivo de plotagem revelará tendências de erro específicas de execução e pode ser utilizado para inferir o número máximo de bases de leitura para a análise. A seção a seguir demonstrará como executar o splinter no arquivo alinhado usando o modelo de erro para detectar variantes de sequência raras.

A primeira etapa da análise é executar a fragmentação no arquivo alinhado usando a sequência de referência e o modelo de erro. Bases de leitura única podem ser excluídas da análise se forem consideradas defeituosas. O limite do valor P determina o quão rigorosa será a análise de chamada de variante.

Um corte mínimo de menos 1,301 é um bom começo. A opção de tamanho do pool otimiza o sinal do algoritmo para a discriminação de ruído, eliminando a variação potencial com frequências de alelos menores que as de um único alelo no pool real. A opção de tamanho do pool deve ser definida como o valor mais próximo que seja maior que o número real de alelos analisados no experimento.

A variância chamada em frequências mais baixas será ignorada como ruído. Depois de inserir todos os parâmetros e nomes de arquivo, execute o splinter. Esse arquivo retorna todas as ocorrências estatisticamente significativas na amostra com uma descrição da posição do tipo de variante da variante.

Valor de p por fita de DNA, frequência da variante e cobertura total por fita de DNA. O frasco de lista é usado por splinter para normalizar a cobertura em toda a amostra. O primeiro campo indica o amplicon de interesse, enquanto o segundo campo indica a posição em que a mutação está presente.

N indica que o resto da sequência não contém nenhuma mutação. Uma normalização, a análise do controle positivo é fundamental para maximizar a sensibilidade e especificidade para uma determinada corrida. Isso é importante porque provavelmente o corte inicial de menos 1,301 não será suficiente para eliminar todos os falsos positivos.

Cada análise de lascas mostrará o valor P real para cada variante chamada, que não pôde ser prevista como prioridade. No entanto, toda a análise pode ser repetida usando o valor P menos rigoroso exibido na saída inicial para as posições de base positivas verdadeiras conhecidas. Isso servirá para reter todos os verdadeiros positivos, excluindo a maioria, se não todos, os falsos positivos, que normalmente têm valores de P muito menos significativos em comparação com os verdadeiros positivos.

Para automatizar esse processo, o script do testador de corte pode ser usado. O script do testador de corte requer um arquivo de saída de fragmentação e uma lista de ocorrências de controle positivo na forma de um arquivo delimitado por tabulação como o usado para normalização. A saída resultante será uma lista de cortes que atingem progressivamente o ideal.

A última linha representa o corte ideal para a execução e, portanto, pode ser usada para análise de dados. O resultado ideal é alcançar a sensibilidade e especificidade de um. No entanto, se não for alcançada, a análise de lascas pode ser otimizada alterando o número de bases de leitura incorporadas.

O corte final pode ser aplicado aos dados usando o script de corte de corte, que filtrará o arquivo de saída de lasca de ocorrências abaixo do corte ideal. Esta etapa gerará o arquivo de saída de fragmentação final, que conterá recortes e indels presentes no exemplo. Observe que a saída para inserções é ligeiramente diferente da de substituições ou exclusões.

A precisão em função da cobertura de um único alelo em uma amostra agrupada é visualizada neste tipo de gráfico. A precisão é estimada como a área sob a curva abreviada como UC de uma curva do operador receptor e varia de uma precisão aleatória de 0,5 a uma precisão perfeita de 1,0. Neste exemplo, um UC é plotado como uma função de cobertura por alelo para a detecção de alelos mutantes únicos em pools de 200 501.000 alelos.

Aqui, um UC é plotado como uma função do total para inserções, exclusões e substituições. Este gráfico de erro mostra a probabilidade de incorporar uma base errônea em uma determinada posição. O perfil de erro mostra baixas taxas de erro com uma tendência crescente em direção às três extremidades principais da leitura de sequenciamento.

Notavelmente, diferentes nucleotídeos de referência exibem diferentes probabilidades de erro. Este gráfico revela a precisão do splinter na estimativa da frequência do alelo para posições que tiveram cobertura superior a 25 vezes por alelo. Uma comparação entre frequências de alelos de DNA agrupadas estimadas por lasca com contagens de alelos medidas por estudos de associação ampla do genoma ou resultados GWAS.

Em uma correlação muito alta, uma população de 974 indivíduos foi puxada e direcionada a mais de 20 quilobases para sequenciamento. Splinter foi aplicado para a detecção de variantes raras. Seguindo o protocolo padrão, cada indivíduo teve genotipagem previamente realizada por concordância gwas entre genotipagem de variantes marcadas e novas.

Chamados na amostra agrupada foram excelentes. Três variantes, duas das quais eram raras na população, foram chamadas de denovo a partir dos resultados do sequenciamento e foram validadas por sequenciamento piro individual, frequências alélicas menores ou concordância matemática entre o sequenciamento pirotécnico e o sequenciamento puxado foi excelente. Depois de terminar de encontrar sua variação rara em sua amostra agrupada, muitas pessoas querem saber quais são as consequências funcionais da variação que identificaram.

Portanto, a anotação de sua variação torna-se a próxima etapa no processo após um desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do sequenciamento de DNA estudarem variantes raras de maneira rápida e econômica para caracterizar variantes raras em grandes estudos populacionais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como detectar variantes de sequência raras em um pool, amostra de DNA usando lasca.