Name: Detecção de variantes raras genômico de Seqüenciamento combinados usando SPLINTER (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Aprenda a detectar variantes raras genômicas usando o algoritmo SPLINTER em amostras de DNA em pool. Este método computacional permite identificar mutações funcionais raras em grandes populações com alta precisão e baixo custo.

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Este trabalho foi financiado pelo Discovery das Crianças Instituto concessão MC-II-2006-1 (RDM e TED), o NIH Epigenetics Roteiro concessão [1R01DA025744-01 e 3R01DA025744-02S1] (RDM e FLMV), U01AG023746 (SC), o Saigh Foundation (FLMV e TED), 1K08CA140720-01A1 e Alex Lemonade Stand &quot;A&quot; apoio Award (TED). Agradecemos ao Centro do Genoma Acesso à Tecnologia do Departamento de Genética da Washington University School of Medicine de ajuda com a análise genômica. O Centro é parcialmente financiado pelo NCI Cancer Support Center Grant P30 CA91842 # para o Centro de Câncer Siteman e pela ICTS / CTSA Grant # UL1RR024992 do National Center for Research Resources (NCRR), um componente do National Institutes of Health (NIH), e NIH Roadmap for Medical Research. Esta publicação é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do NCRR ou NIH.

<ol><li>Vallania, F. L. M., Druley, T. E., Ramos, E., Wang, J., Borecki, I., Province, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+discovery+of+rare+insertions+and+deletions+in+large+cohorts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput discovery of rare insertions and deletions in large cohorts.</a> Genome Research. 20, 1391-1397 (2010).</li>
<li>Shendure, J., Mitra, R., Varma, C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+Sequencing+Technologies%3A+Methods+and+Goals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Advanced Sequencing Technologies: Methods and Goals.</a> Nature Reviews of Genetics. 5, 335-344 (2004).</li>
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<li>Manolio, T. A., Collins, F. S., Cox, N. J., Goldstein, D. B., Hindorff, L. A., Hunter, D. J., McCarthy, M. I., Ramos, E. M., Cardon, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+missing+heritability+of+complex+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Finding the missing heritability of complex diseases.</a> Nature. 461, 747-753 (2009).</li>
<li>Reich, D. E., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+allelic+spectrum+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">On the allelic spectrum of human disease.</a> Trends Genet. 17, 502-510 (2001).</li>
<li>Cohen, J. C., Kiss, R. S., Pertsemlidis, A., Marcel, Y. L., McPherson, R., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+rare+alleles+contribute+to+low+plasma+levels+of+HDL+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiple rare alleles contribute to low plasma levels of HDL cholesterol.</a> Science. 305, 869-872 (2004).</li>
<li>Ji, W., Foo, J. N., O'Roak, B. J., Zhao, H., Larson, M. G., Simon, D. B., Newton-Cheh, C., State, M. W., Levy, D., Lifton, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+independent+mutations+in+renal+salt+handling+genes+contribute+to+blood+pressure+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Rare independent mutations in renal salt handling genes contribute to blood pressure variation.</a> Nat. Genet. 40, 592-599 (2008).</li>
<li>Ahituv, N., Kavaslar, N., Schackwitz, W., Ustaszewska, A., Martin, J., Hebert, S., Doelle, H., Ersoy, B., Kryukov, G., Schmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+sequencing+at+the+extremes+of+human+body+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Medical sequencing at the extremes of human body mass.</a> Am. J. Hum. Genet. 80, 779-791 (2007).</li>
<li>Druley, T. E., Vallania, F. L., Wegner, D. J., Varley, K. E., Knowles, O. L., Bonds, J. A., Robison, S. W., Doniger, S. W., Hamvas, A., Cole, F. S., Fay, J. C., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+rare+allelic+variants+from+pooled+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of rare allelic variants from pooled genomic DNA.</a> Nat. Methods. 6, 263-265 (2009).</li>
<li>Mitra, R. D., Butty, V., Shendure, J., Housman, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Genotyping+and+Haplotyping+with+Polymerase+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Digital Genotyping and Haplotyping with Polymerase Colonies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 5926-5931 (2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Existe uma evidência crescente que a incidência e resposta terapêutica de comuns, fenótipos complexos e doenças tais como a obesidade 8, hipercolesterolemia 4, hipertensão 7 e outros podem ser moderadas por perfis pessoais de variação rara. Identificar os genes e as vias onde essas variantes agregadas em populações afetadas terão profundas implicações diagnósticas e terapêuticas, mas analisando separadamente os indivíduos afetados pode ser o tempo e custo proibitivo. De base populacional análise oferece um método mais eficiente para o levantamento da variação genética em locos múltiplos. Apresentamos um novo reunidas DNA-protocolo sequenciação emparelhado com o pacote de software SPLINTER desenhados para identificar este tipo de variação genética através de populações. Demonstramos a precisão deste método na identificação e quantificação alelos menores dentro de uma grande população combinada de 947 indivíduos, incluindo as variantes raras que eramchamado de novo a partir da sequência reunidas e validado por pyrosequencing individual. A nossa estratégia principalmente difere de outros protocolos pela incorporação de um positivo e um controlo negativo dentro de cada experiência. Isso permite que SPLINTER para conseguir uma precisão muito maior e de energia em comparação com outras abordagens 1. A cobertura óptima de 25 vezes por alelo é fixado de forma independente do tamanho da piscina, tornando a análise de agrupamentos de grandes viável como este requisito apenas as escalas linearmente com o tamanho da piscina. A nossa abordagem é muito flexível e pode ser aplicado a qualquer fenótipo de interesse, mas também para amostras que são naturalmente heterogénea, tais como as populações de células mistas e biópsias de tumores. Dado o interesse cada vez maior na seqüência combinada de regiões-alvo de grande porte como o exome ou genoma, a nossa biblioteca de preparação e análise SPLINTER é compatível com o costume de captura e de todo o exome seqüenciamento, mas o utilitário de alinhamento no pacote SPLINTER não foi projetado para grandesequências de referências. Portanto, temos utilizado com sucesso o alinhador de programação dinâmica, Novoalign, para genome-wide alinhamentos seguido de variante ligando a amostra conjunta (Ramos et al., Submetido). Assim, nossa estratégia de seqüenciamento de pool pode escalar com sucesso para piscinas maiores, com quantidades crescentes de sequência alvo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Seção </td></tr><tr><td> PfuUltra Alta Fidelidade </td><td> Agilent </td><td> 600384 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> Betaína </td><td> SIGMA </td><td> B2629 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> M13mp18 ssDNA vector </td><td> NEB </td><td> N4040S </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> pGEM-T Easy </td><td> Promega </td><td> A1360 </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> Quinase de polinucleótido T4 </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> Ligase de T4 </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> Polietileno Glicol 8000 MW </td><td> SIGMA </td><td> P5413 </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> Sonicador Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200-TS</td><td> 2,3 </td></tr></tbody></table>

detecção de variantes raras genômico de seqüenciamento combinados usando splinter

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Como tecnologia de seqüenciamento de DNA foi marcadamente avançou nos últimos anos 2, tornou-se cada vez mais evidente que a quantidade de variação genética entre dois indivíduos é maior do que se pensava anteriormente 3. Em contraste, uma matriz baseada em genotipagem falhou para identificar uma contribuição significativa de variantes da sequência de comuns para a variabilidade fenotípica de doença comum 4,5. Tomados em conjunto, essas observações levaram à evolução da doença comum / variante rara hipótese sugerindo que a maioria da &quot;herdabilidade perdido&quot; em fenótipos comuns e complexas, em vez disso, devido ao perfil pessoal de um indivíduo de variantes raras de DNA ou privada 6-8 . No entanto, caracterizando como rara variação impacta fenótipos complexos requer a análise de muitos indivíduos afetados em muitos loci genômicos, e está idealmente comparado a uma pesquisa similar em uma coorte afetados. Apesar do poder de sequenciação oferecida pelas plataformas de hoje, umainquérito de base populacional de loci genômicos muitos e posterior análise computacional requerido continua proibitivo para muitos investigadores. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos uma abordagem conjunta seqüenciamento 1,9 e um pacote de software para a detecção de um romance variante de alta precisão rara a partir dos dados resultantes. A capacidade de genomas piscina de populações inteiras de indivíduos afetados e levantamento do grau de variação genética em várias regiões-alvo em uma biblioteca de sequenciamento único proporciona excelentes economias em custo e tempo com a metodologia tradicional seqüenciamento amostra única. Com uma cobertura média por sequenciação do alelo de 25 vezes, o algoritmo personalizado, lasca, utiliza uma variante interna estratégia de controlo de chamada para chamar inserções, deleções e substituições até quatro pares de bases de comprimento, com elevada sensibilidade e especificidade de pools de até 1 alelo mutante em 500 indivíduos. Descrevemos aqui o método para a preparação do s reunidasequencing biblioteca seguido passo-a-passo sobre como usar o pacote SPLINTER para análise da sequenciação agrupada ( <a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a> ). Nós mostramos uma comparação entre sequenciamento combinada de 947 indivíduos, os quais também foram submetidos genome-wide array, em mais de 20kb de seqüenciamento por pessoa. Concordância entre genotipagem de marcado e novas variantes chamadas na amostra composta foram excelentes. Este método pode ser facilmente dimensionada para qualquer número de loci genómicas e qualquer número de indivíduos. Ao incorporar os controles internos amplicon positivos e negativos em proporções que imitam a população em estudo, o algoritmo pode ser calibrado para um ótimo desempenho. Esta estratégia pode também ser modificados para utilização com captura de hibridação ou indivíduo específicos códigos de barras e pode ser aplicado para a sequenciação de amostras naturalmente heterogéneos, tais como o DNA do tumor.

Seqüenciamento de DNA pool é uma estratégia rápida e de custo eficaz para detectar variantes raras associadas com fenótipos complexos em grandes grupos. Aqui descrevemos a análise computacional de pool, o seqüenciamento da próxima geração de 32 genes relacionados ao câncer, utilizando o pacote de software SPLINTER. Este método é escalável, e aplicável a qualquer fenótipo de interesse.

Detecção de variantes raras genômico de Seqüenciamento combinados usando SPLINTER

À medida que a tecnologia de sequenciamento de DNA avançou marcadamente nos últimos anos2, tornou-se cada vez mais evidente que a quantidade de variação genética entre quaisquer...

O objetivo geral deste procedimento é identificar genes dentro de uma população de indivíduos que apresentam uma predominância de variação funcional rara. Isso é realizado primeiramente reunindo uma população de amostras de DNA. O segundo passo é criar e sequenciar uma biblioteca de sequenciamento de próxima geração.Em seguida, realiza-se o alinhamento das leituras à sequência de referência e a criação de um modelo de erro. O passo final é a análise computacional utilizando o algoritmo splinter. Em última instância, a análise splinter de sequenciamento em massa de próxima geração é utilizada para identificar genes dentro de populações que apresentam uma predominância de variação funcional rara, demonstrando o procedimento.Hoje será Francesco Vilania, que é aluno de pós-graduação no laboratório do meu orientador e colaborador, Rob Mitra, e ele será acompanhado por Enrique Ramos, um aluno de pós-graduação no meu laboratório. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como genótipos individuais únicos, é que ela permite detectar com grande precisão variantes de sequência raras em uma população mista de moléculas de DNA, sem exigir qualquer informação prévia. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de genética e genômica, como determinar a frequência de variantes raras que causam doenças em estudos de grandes coortes.Cada experimento de fragmentação requer a presença de um controle negativo e positivo para obter precisão ideal; prepare a mistura de reação de PCR utilizando a DNA polimerase PFU ultra high fidelity. O controle negativo é um produto de PCR de qualquer sequência de DNA conhecida por não apresentar variação genética, como um vetor clonado.Aqui, é utilizado um amplicon de 1.934 pares de bases do vetor M13 MP18. O controle positivo pode ser qualquer conjunto de variantes de sequência previamente validadas, presentes em toda a população. Se esses dados não estiverem disponíveis, este laboratório projetou um controle positivo artificial, consistindo em um produto de PCR de 331 pares de bases a partir de uma mistura de sequências modificadas clonadas no vetor PGMT easy, conforme listado nesta tabela.Essas sequências são combinadas para simular diversas frequências alélicas menores de variantes verdadeiras dentro do grupo de pacientes. Após a amplificação por PCR das amostras, conforme discutido no protocolo escrito que acompanha este vídeo, purifique cada produto de PCR dos primers em excesso utilizando a purificação rápida em coluna Kyogen Kayak ou placas-filtro de 96 poços com manifold a vácuo para limpeza em larga escala. Após a purificação, quantifique cada produto de PCR utilizando técnicas padrão.Prepare-se para combinar todos os produtos de PCR e controles em um pool normalizado pelo número de moléculas. O agrupamento por concentração resultará na super-representação de amplicons pequenos em relação aos produtos maiores. Em vez disso, una um número normalizado de moléculas por amplicon.Escolha números arbitrários que sejam grandes o suficiente para manter a precisão durante a pipetagem. Retire os produtos de PCR e os controles. A ligação dos produtos de PCR é necessária porque a fragmentação de pequenos produtos de PCR provavelmente causará um viés na representação em direção às suas extremidades.Por esse motivo, ligamos os produtos de PCR de encolhimento em um vetor grande antes de sua fragmentação. Prepare a mistura para ligação de extremidades rombas utilizando T four Ligase, T four PNK e PEG conforme listado no protocolo. Incube a reação a 22 graus Celsius por 17 horas.Em seguida, incubar a 65 graus Celsius por 20 minutos e manter a quatro graus Celsius. Depois disso, verifique a ligação carregando 50 nanogramas da amostra em um gel de agarose. Uma ligação bem-sucedida resultará em uma banda de alto peso molecular presente na trilha.Prepare-se para a fragmentação do DNA por meio de uma estratégia de sonicação aleatória diluindo a amostra em uma proporção de 10 para 1 no Buffer Qiagen PB para torná-la menos viscosa. Em seguida, fragmente o grande cone de produtos de PCR utilizando um bio-ruptor com nó diagonal de 24 amostras, sonique em alta potência durante 25 minutos com 40 segundos ligados e 20 segundos desligados por minuto. Verifique os resultados da fragmentação do DNA em um gel de agarose e prossiga com o sequenciamento iluminoso conforme descrito no texto.Para iniciar o sequenciamento, faça o alinhamento das leituras. Converta os arquivos brutos de sequenciamento, leituras, para o formato scarf ou comprima-os. A compressão é opcional.Economiza tempo e espaço para as etapas subsequentes de análise sem perder nenhuma informação relevante. Utilizando a ferramenta de alinhamento incluída, alinhe as leituras brutas à sequência de referência anotada mais rápida. Específicos das regiões direcionadas incluem as reações de PCR, bem como os controles positivo e negativo.O formato de entrada deve estar no formato scarf ou comprimido. Em seguida, realize a marcação de arquivos conforme descrito no texto. Cada execução gera um perfil único de erro de sequenciamento a ser caracterizado para chamada precisa de variantes, a fim de modelar os erros para cada execução.Um controle interno conhecido por apresentar variação de sequência é incluído em cada biblioteca de amostras em pool. A partir do arquivo marcado alinhado, gere um arquivo de modelo de erro utilizando a ferramenta incluída com a sequência de referência do controle negativo; todas as sequências do controle negativo podem ser usadas, ou, alternativamente, apenas um subconjunto, quando especificado pelas extremidades cinco prima e três prima. Leituras únicas e contagens pseudos devem ser sempre aplicadas.A ferramenta gerará três arquivos nomeados conforme o parâmetro do nome do arquivo de saída, terminando com zero, um ou dois. Esses arquivos correspondem respectivamente a um modelo de erro de ordem zero, primeira e segunda ordem para chamada de variantes com splinter. O modelo de erro de segunda ordem deve sempre ser utilizado para a visualização do perfil de taxa de erro da execução.O script Pearl utilizado para gerar o gráfico do modelo de erro pode ser empregado para criar um gráfico de erro em PDF a partir do arquivo do modelo de erro de ordem zero. O arquivo de gráfico revelará tendências específicas de erros por execução e poderá ser utilizado para inferir o número máximo de bases lidas para a análise. A seção a seguir demonstrará como executar o splinter no arquivo alinhado utilizando o modelo de erro para detectar variantes de sequência raras.O primeiro passo na análise é executar o splinter no arquivo alinhado utilizando a sequência de referência e o modelo de erro. Bases individuais de leitura podem ser excluídas da análise se forem identificadas como defeituosas. O valor de corte de P determina o quão rigorosa será a análise de chamada de variantes.Um valor mínimo de corte de menos 1,301 é um bom ponto de partida. A opção de tamanho do grupo otimiza a discriminação sinal-ruído do algoritmo ao eliminar a variância potencial com frequências de alelos menores do que a de um único alelo no grupo real. A opção de tamanho do grupo deve ser definida para o valor mais próximo que seja maior do que o número real de alelos analisados no experimento.A variância detectada em frequências mais baixas será ignorada como ruído. Após inserir todos os parâmetros e nomes de arquivos, execute o splinter. Este arquivo retorna todos os acertos estatisticamente significativos ao longo da amostra, com uma descrição da posição e do tipo de variante.Valor de P por frequência de fita de DNA da variante e cobertura total por fita de DNA. O frasco da lista é usado pelo splinter para normalizar a cobertura entre as amostras. O primeiro campo indica o amplicon de interesse, enquanto o segundo campo indica a posição na qual a mutação está presente.N indica que o restante da sequência não contém nenhuma mutação. Uma normalização, a análise do controle positivo é fundamental para maximizar a sensibilidade e a especificidade de uma corrida específica. Isso é importante porque muito provavelmente o valor inicial de corte de menos 1,301 não será suficiente para eliminar todos os falsos positivos.Cada análise de fragmentos mostrará o valor P real para cada variante identificada, o qual não poderia ser previsto previamente. No entanto, toda a análise pode ser repetida utilizando o valor P menos rigoroso exibido na saída inicial para as posições de bases verdadeiras positivas conhecidas. Isso servirá para reter todos os verdadeiros positivos, excluindo a maioria, senão todos, os falsos positivos, que normalmente apresentam valores P muito menos significativos em comparação com os verdadeiros positivos.Para automatizar este processo, pode-se usar o script do testador de corte. O script do testador de corte requer um arquivo de saída do Splinter e uma lista de hits de controle positivo no formato de um arquivo delimitado por tabulação, como o utilizado para normalização. A saída resultante será uma lista de pontos de corte que progressivamente atingem o ideal.A última linha representa o corte mais ideal para a execução e pode, portanto, ser usada para análise de dados. O resultado ideal é alcançar sensibilidade e especificidade iguais a um. No entanto, se isso não for alcançado, a análise de fragmentos pode ser otimizada alterando o número de bases de leitura incorporadas.O corte final pode ser aplicado aos dados usando o script cutoff cut, que filtrará o arquivo de saída splinter, removendo os resultados abaixo do valor de corte ótimo. Esta etapa gerará o arquivo final de saída splinter, que conterá os snips e indels presentes na amostra. Observe que a saída para inserções é ligeiramente diferente daquela para substituições ou deleções.A precisão em função da cobertura para um único alelo em uma amostra agrupada é visualizada neste tipo de gráfico. A precisão é estimada pela área sob a curva, abreviada como AUC (área sob a curva característica de operação do receptor), e varia de uma precisão aleatória de 0,5 a uma precisão perfeita de 1,0. Neste exemplo, a AUC é representada em função da cobertura por alelo para a detecção de alelos mutantes únicos em grupos de 200 a 501.000 alelos.Aqui, uma UC é representada como uma função do total de inserções, deleções e substituições. Este gráfico de erro mostra a probabilidade de incorporação de uma base incorreta em uma posição específica. O perfil de erro revela taxas baixas de erro com uma tendência crescente em direção à extremidade três prima da leitura de sequenciamento.Nucleotídeos de referência notavelmente diferentes exibem diferentes probabilidades de erro. Este gráfico revela a precisão do splinter na estimativa da frequência alélica para posições que tiveram cobertura superior a 25 vezes por alelo. Uma comparação entre as frequências alélicas de DNA em pool estimadas pelo splinter e as contagens alélicas medidas por estudos de associação genômica ampla ou resultados de GWAS.Em uma correlação muito alta, uma população de 974 indivíduos foi selecionada e direcionada para sequenciamento em mais de 20 quilobases. O programa Splinter foi aplicado para a detecção de variantes raras. Após o protocolo padrão, cada indivíduo teve seu genotipagem previamente realizado por concordância gwas entre a genotipagem de variantes marcadas e novas variantes.As chamadas na amostra agrupada foram excelentes. Três variantes, das quais duas eram raras na população, foram identificadas como *de novo* a partir dos resultados do sequenciamento e foram validadas por meio de pirosequenciamento individual; as frequências do alelo minoritário ou a concordância matemática entre o pirosequenciamento e o sequenciamento agrupado foram excelentes. Após concluir a identificação de suas variantes raras na amostra agrupada, muitas pessoas desejam saber quais são as consequências funcionais das variantes que identificaram.Assim, a anotação da sua variância torna-se a próxima etapa do processo após um desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de sequenciamento de DNA estudarem variantes raras de forma rápida e econômica, possibilitando a caracterização de variantes raras em estudos com grandes populações. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como detectar variantes de sequência raras em uma amostra de DNA em pool utilizando o splinter.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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