Name: Isolamento de DNA genômico de Tails rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprenda a realizar biópsia de cauda em filhotes de camundongo de 10 dias para extração de DNA genômico. Este método demonstra técnicas essenciais de identificação e prevenção de contaminação.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol style="margin-top: 0in"><li> Cortar pedaços da cauda (3mm) e as orelhas marca. </li><li> Adicionar 720 m l STE e 30 m l Proteinase K (10 ações mg / ml). </li><li> Incubar a 55 ° C em bloco de aquecimento e vortex a cada hora durante 3 horas a velocidade máxima por 10 segundos. </li><li> Inativar proteinase K a 70 ° C por 5 minutos. </li><li> Saciar em gelo durante 5 minutos. </li><li> Centrífuga DNA da cauda por 10 minutos na velocidade máxima. </li><li> Decantar em novo tubo contendo 720 m l Isopropanol. &nbsp; </li><li> DNA precipitar invertendo o tubo ou vórtex. </li><li> Spin down DNA por 5 minutos na velocidade máxima. Remover o sobrenadante. </li><li> Lavar pellet com etanol 70%. </li><li> Spin down DNA genômico 5 minutos à velocidade máxima. Remover o sobrenadante. </li><li> Permitir DNA para secar por 1-2 minutos. </li><li> Ressuspender DNA no 100-200 l m dependendo do tamanho do pellet. </li><li> Coloque o tubo a 55 ° C por 1 hora para facilitar a dissolução do DNA. &nbsp; </li></ol>

<table><tbody><tr><td>STE</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>100 mm Tris; pH 8,5 /5 mM EDTA /0,2% SDS /200 mM NaCl / em H2O</td></tr><tr><td>TE</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris; pH 5,0 /1 mM EDTA /10 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

isolamento de dna genômico de tails rato

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolamento de DNA genômico de Tails rato

Este é um filhote de camundongo com 10 dias de idade e vou coletar uma biópsia da cauda para, em seguida, extrair o DNA genômico a partir dela. O que farei é cortar um pequeno pedaço da cauda, aproximadamente três milímetros, e então colocarei o fragmento da cauda em um tubo einor e o tubo einor sobre gelo seco. Agora, para evitar contaminação de um camundongo para outro, costumo marcar a lâmina de barbear na parte onde fiz o último corte.Dessa forma, para o próximo camundongo, terei o cuidado de usar uma lâmina de barbear limpa para coletar a próxima biópsia da cauda. Para distinguir entre os diferentes camundongos da sua ninhada, você precisará de um método para identificá-los. Uma maneira de fazer isso é perfurando um furo em suas orelhas usando um furador de orelha, como o mostrado aqui.Segure suavemente o camundongo pela nuca, vire-o e pinçe a cauda entre os dedos. Com a outra mão, segure o orifício da orelha, faça um corte rápido na orelha do camundongo nesse local. Perceba como foi indolor?Ok, agora você pode ver que tenho alguns pedaços de cauda nestes tubos de eppendorf e agora vou adicionar as soluções que irão ajudar na digestão. Primeiro, vou adicionar 720 microlitros de solução STE e, em seguida, vou adicionar 30 microlitros de proteína Ace K. Aqui está uma visão do pedaço de cauda que cortamos antes da digestão.Agora vou colocar os fragmentos da cauda em um bloco aquecedor a 55 graus. Muitos protocolos exigem agitação contínua a 55 graus, mas para os meus propósitos isso não será necessário, pois vou vortexar os fragmentos da cauda. Agora vou vortexar o fragmento da cauda por dois segundos.Um, dois. Após a vórtex, veja como está o interior do tubo eppendorf, onde é possível observar que o pedaço de cauda foi completamente dissolvido. Ative a proteinase K a 70 graus Celsius por cinco minutos. Interrompa a reação em gelo por cinco minutos.Centrifugue os peda&ccedil;os das caudas em uma microcentr&iacute;fuga por 10 minutos em velocidade m&aacute;xima. Nesta microcentr&iacute;fuga, a velocidade m&aacute;xima &eacute; de 13.000 RPM. Enquanto as caudas digestivas est&atilde;o sendo centrifugadas, rotule alguns tubos einor e preencha os tubos einor com 750 microlitros de isopropanol.Após centrifugar as caudas digeridas, os pelos e o material não digerido formarão um pellet no fundo do tubo decantado. A solução contendo o material digerido, STE e proteinase K será transferida para o tubo einor contendo o DNA em isopropanol, que começará a sair da solução, apresentando-se com aparência fantasmagórica e semelhante a penas, e bem ali, flutuando ao redor da bolha, está o DNA genômico isolado da cauda do camundongo. Após misturar a solução de isopropanol e STE, o DNA genômico sairá da solução e aparecerá como esta pequena esfera bem aqui; centrifugue o DNA genômico precipitado por cinco minutos em velocidade máxima em uma microcentrífuga.Aqui, na base do tubo, está o nosso DNA genômico em pellet. Agora vou aspirar a solução dentro do tubo, deixando apenas o pellet de DNA genômico para trás. Cada vez que aspirar outro tubo, trocarei a pipeta.Dica profissional: na ponta deste aspirador. Após aspirar o STE e o isopropanol, adicionarei um mililitro de etanol 70% para lavar o pellet de DNA genômico. Como o pellet de DNA genômico geralmente adere à parede do tubo de microcentrífuga e é difícil removê-lo para lavá-lo completamente no etanol 70%, será necessário arrastá-lo sobre o suporte para tubos de microcentrífuga que tenho aqui.Você pode fazer isso da seguinte maneira. Aqui está uma visão do DNA genômico após ter sido pelotizado e lavado em etanol a 70%. Vou centrifugar novamente por cinco minutos em velocidade máxima e, em seguida, aspirar o etanol a 70%, centrifugando novamente os pellets de DNA genômico após a lavagem.Adicione 70% de etanol, agite por cinco minutos em velocidade máxima, aspire o etanol a 70% e deixe o DNA secar por cinco minutos. Observe o pellet de DNA genômico no fundo do tubo, que deve estar aproximadamente tão seco quanto desejado. Assim, sequei os pellets de DNA genômico provenientes das caudas de camundongo e agora vou adicionar cem microlitros de triss 40 milimolar em pH oito.Então, tenho o DNA genômico a 50 graus Celsius, temperatura na qual ele se solubilizará mais rapidamente do que à temperatura ambiente. Após cerca de uma hora a 50 graus, vou congelá-lo ou armazená-lo a quatro graus até que eu deseje realizar minhas reações de PCR para determinar quais camundongos são positivos para meu transgene.

isolation-of-genomic-dna-from-mouse-tails

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A genotipagem completa de uma amostra da cauda do rato, incluindo a digestão do tecido e leitura de PCR, é feito em uma hora e meia utilizando SYBR Sigma Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

A genotipagem rápida de tecido Mouse Usando Extract-N-Amp Tissue Sigma PCR Kit

Nós demonstramos uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) para identificar as interações fator em tecido-específicos genes durante ou após o início da tecido-específicos de expressão gênica em camundongos tecido embrionário. Este protocolo deve ser amplamente aplicáveis ​​para o estudo do tecido-específicos ativação do gene como ocorre durante o desenvolvimento embrionário normal.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina Genes Tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato

Nós apresentamos um método de amostragem não invasiva para coletar amostras de cabelo de forma eficiente a partir elusive pequenos mamíferos, como mostrado para o pika americano. Demonstramos a utilidade deste método por extração de DNA de amostras de cabelo e ampliando vários tipos de marcadores moleculares usados ​​em estudos de ecologia da vida selvagem e conservação.

A técnica de amostragem não invasiva cabelo obter DNA de alta qualidade a partir de Elusive Pequenos Mamíferos

Neste vídeo, demonstramos um procedimento de corte de cauda em um modelo de camundongo para coletar sangue periférico. O sangue coletado é posteriormente submetido à centrifugação para separar o plasma, que pode ser usado para experimentos posteriores.

Um procedimento de recorte de cauda de camundongo para coleta de sangue periférico e isolamento de plasma

Nós descrevemos um procedimento experimental simples e rápida para a geração de fibroblastos primários dos ouvidos e caudas de camundongos. O processo não requer a formação especial animal e pode ser utilizado para a geração de culturas de fibroblastos de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias.

Culturas de geração primária de fibroblastos de rato orelha e da cauda Tecidos

A microinjecção de oócitos de rato é comumente utilizada tanto para a transgênese clássica ( ou seja, a integração aleatória de transgenes) e a segmentação de genes mediada por CRISPR. Este protocolo analisa os últimos desenvolvimentos em microinjeção, com ênfase particular no controle de qualidade e estratégias de genotipagem.

Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos

Descreveremos um protocolo detalhado para o ensaio de mutação de cII Lambda selecione em culturas de células de roedores transgênicos ou correspondentes animais tratados com um agente químico/físico de interesse. Esta abordagem tem sido amplamente utilizada para testes de mutagenicidade de substâncias cancerígenas em células de mamíferos.

O Lambda selecione cII sistema de deteção de mutação

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar rapidamente núcleos de alta qualidade do tecido fresco ou congelado para a sequenciação do ARN maciçamente paralelo a jusante. Inclui opções de Lise rompimento e célula tecido detergente-mecânica e hipotônica-mecânico, ambos dos quais podem ser usados para isolamento dos núcleos.

Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo

O presente protocolo descreve uma única mutação M213L em Gja1 que retém a geração Connexin43 em comprimento completo, mas impede a tradução do isoforme traduzido internamente GJA1-20k.

Remoção de um local de início de tradução interna do mRNA enquanto retém a expressão da proteína de comprimento completo

Este protocolo fornece um método de isolamento de DNA simples e econômico para a análise de alterações da microbiota intestinal murina durante o desenvolvimento de doenças autoimunes.

Análise da dinâmica da microbiota fecal em camundongos propensos a lúpus usando um método de isolamento de DNA simples e econômico

Desenvolvemos uma abordagem oncogenômica comparativa entre espécies utilizando análises genômicas e telas genômicas funcionais para identificar e comparar alvos terapêuticos em tumores surgidos em modelos de camundongos geneticamente modificados e o tipo de tumor humano correspondente.

Perfil Genético e Triagem de Abandono em Escala Genômica para Identificar Alvos Terapêuticos em Modelos Murinos de Tumor Maligno de Bainha de Nervo Periférico

Aprenda a realizar biópsia de cauda em filhotes de camundongo de 10 dias para extração de DNA genômico. Este método demonstra técnicas essenciais de identificação e prevenção de contaminação.

Isolamento de DNA genômico de Tails rato

Explorar mais vídeos