Isolamento de DNA genômico de Tails rato

Então, este é um filhote de camundongo de 10 dias e eu vou fazer uma biópsia da cauda e depois vou extrair DNA genômico de sua cauda. Então, o que vou fazer é cortar um pouco de sua cauda, cerca de três milímetros, e então colocarei o pedaço de cauda em um tubo einor e colocarei o tubo einor em gelo seco. Agora, para evitar a contaminação de um mouse para outro, costumo marcar a lâmina de barbear na parte em que fiz o último corte.

Dessa forma, para o próximo mouse, usarei um pedaço limpo de lâmina de barbear para fazer a próxima biópsia da cauda. Para distinguir entre os diferentes ratos em sua ninhada, você precisará de uma maneira de identificar os ratos. Uma maneira de fazer isso é fazer um furo em seus ouvidos usando um perfurador de orelha mostrado aqui.

Gentilmente, pegue o mouse pela nuca, então vire-o e aperte o rabo entre os dedos. Pegue o furo da orelha com a outra mão e faça um corte rápido na orelha do mouse. Veja como isso foi indolor?

Ok, agora você pode ver que eu tenho alguns pedaços de cauda nesses tubos einor e agora vou adicionar as soluções que os ajudarão a digerir. Primeiro vou adicionar 720 microlitros de solução STE e depois vou adicionar 30 microlitros de proteína. Ace K.So aqui está uma olhada no pedaço de cauda que cortamos antes da digestão.

Agora vou colocar as peças da cauda em um bloco de aquecimento de 55 graus. Muitos protocolos exigem movimento contínuo balançando a 55 graus, mas para meus propósitos isso não será necessário porque estarei fazendo vórtice nas peças da cauda. Agora vou fazer um vórtice no pedaço de cauda por dois segundos.

Um, dois. Então, após o vórtice, aqui está uma olhada no que resta dentro do tubo einor aqui, e você pode ver que o pedaço de cauda foi completamente dissolvido e ativar a proteinase K a 70 graus Celsius por cinco minutos. Tempere no gelo por cinco minutos.

Gire as peças da cauda em uma microcentrífuga por 10 minutos em velocidade máxima. Nesta microcentrífuga, a velocidade máxima é de 13.000 RPMs. Enquanto as caudas digestivas estão girando, rotule alguns tubos einor e encha os tubos einor com 750 microlitros de isopropanol.

Depois de girar as caudas digeridas, o cabelo e o material não digerido formarão uma pelota na parte inferior do decantador do tubo. A solução contendo o material digerido, STE e proteinase K no tubo einor contendo o DNA de isopropanol começará a sair da solução, parecerá fantasmagórica e parecida com uma pena, e ali mesmo nadando em torno dessa bolha está o DNA genômico que foi isolado da cauda do camundongo. Depois de misturar a solução de isopropanol e STE, o DNA genômico sairá da solução e aparecerá como esta bolinha aqui, girando o DNA genômico precipitado por cinco minutos a toda velocidade em uma microcentrífuga.

Lá, no fundo do tubo, há uma olhada em nosso DNA genômico peletizado. Agora vou aspirar a solução dentro do tubo, deixando apenas o pellet de DNA genômico para trás. Cada vez que aspiro outro tubo, troco o tubo.

Ponta para animais de estimação na ponta deste aspirador. Depois de aspirar o STE e o isopropanol, adicionarei um mililitro de etanol a 70% para lavar o pellet de DNA genômico. Como o pellet de DNA genômico geralmente adere ao lado de um tubo de micro fuga e é difícil de sair para lavá-lo completamente no etanol de 70%, você precisará varrê-lo pelo rack de tubo de micro fuga que tenho aqui.

Você pode fazer isso assim. Então, aqui está uma olhada no DNA genômico depois de ter sido peletizado e lavado em etanol a 70%. Vou girar isso novamente a toda velocidade por cinco minutos e, em seguida, aspirar o giro de 70% de etanol pelos grânulos de DNA genômico depois de lavados.

Seu etanol 70% cinco minutos a toda velocidade, vai aspirar o etanol 70% e deixar o DNA secar por cinco minutos. Há uma olhada no pellet de DNA genômico na parte inferior do tubo, e isso é o mais seco que você deseja obter. Então, sequei as pelotas de DNA genômico das caudas dos camundongos e agora vou adicionar cem microlitros de triss de 40 milimolares em pH oito.

Então, eu tenho o DNA genômico a 50 graus Celsius, onde ele entrará em solução mais rapidamente do que adicionar a temperatura ambiente. Depois de cerca de uma hora ou mais a 50 graus, vou congelá-lo ou colocá-lo a quatro graus até que eu queira executar minhas reações de PCR para realmente descobrir quais camundongos são positivos para o meu transgene.