Triagem para Funcional não-codificante variantes genéticas Usando eletroforética Mobilidade Mudança Assay (EMSA) e DNA afinidade Precipitation Assay (DAPA)

O objetivo geral desta estratégia experimental é investigar a funcionalidade de variantes não codificantes associadas a doenças. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em genômica, como como variantes genéticas que não alteram a sequência de aminoácidos ainda contribuem para o fenótipo da doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um processo simplificado para avaliar a variância genética para a atividade da função e fornece informações sobre proteínas regulatórias e vias afetadas.

Essa técnica pode beneficiar a investigação de qualquer doença com uma variante causal candidata. Porque o procedimento para analisar essas variantes é universal, independentemente do fenótipo que está sendo estudado. Embora esse método possa fornecer informações sobre doenças humanas, ele também pode ser aplicado a mutações em qualquer organismo.

Os lisados nucleares serão preparados a partir de células linfoblastóides B neste experimento, no entanto este procedimento pode ser aplicado à maioria das linhagens celulares. Depois de contar as células usando um hemocitômetro, diminua o número desejado de células para lisagem. Aspire o meio, adicione 10 mililitros de PBS gelado e gire as células novamente.

Lave as células uma segunda vez com PBS e remova o PBS após a centrifugação. Ressuspenda o palato celular em PBS gelado usando um mililitro de PBS por 10 elevado à sétima célula. Alíquota de um mililitro da suspensão celular para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro, de modo que cada tubo contenha 10 elevado à sétima célula em PBS.

Centrifugue durante dois minutos e aspire o PBS. Adicione a um estoque de trabalho de tampão CE, um ditiotreitol milimolar, ou DTT, inibidor de fosfatase 1X e fluoreto de fenilmetanossulfonil 0,5 milimolar, ou PMSF. Ressuspenda cada paleta de células com 400 microlitros desse tampão e incube no gelo por 15 minutos.

Adicione 25 microlitros de 10% Nonidet P-40 a cada tubo de microcentrífuga e misture por pipetagem. Centrifugue a quatro graus Celsius e velocidade máxima por três minutos. Transvasar e rejeitar o sobrenadante.

Em seguida, adicione a um estoque de trabalho de tampão NE, um DTT milimolar, inibidor de fosfoaase 1X e um PMSF milimolar. Ressuspenda cada palato celular com 30 microlitros desse tampão e misture por vórtice. Incubar a 4 graus Celsius, em um rotador de tubo, por 10 minutos.

Centrifugue por dois minutos. Colete o sobrenadante claro, que é o lisado nuclear. Aliquotar o lisado nuclear antes de armazenar a 80 graus Celsius negativos para evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento que podem degradar a proteína.

Comece este procedimento preparando um estoque de trabalho de 50 nanomolares do oligonucleotídeo, conforme descrito no texto do protocolo. Coloque os oligos em um bloco de calor a 90 graus Celsius por cinco minutos. Após cinco minutos, desligue o bloco de calor e deixe os oligos esfriarem lentamente até a temperatura ambiente por pelo menos uma hora antes do uso.

Em seguida, prepare o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética ou gel EMSA. Remova a lâmina de um gel pré-moldado, tris-borato-EDTA ou TBE a seis por cento e enxágue em água deionizada várias vezes para remover qualquer tampão dos poços. Monte o aparelho de eletroforese em gel e verifique se há vazamentos enchendo a câmara interna com tampão TBE 0.5X.

Se nenhum tampão vazar para a câmara externa, encha a câmara externa, aproximadamente, dois terços do caminho. Pré-execute o gel a 100 volts por 60 minutos. Quando a pré-execução estiver concluída, lave cada poço com 200 microlitros de tampão TBE 0,5X.

Prepare uma mistura mestre de buffer de associação. Em um tubo de microcentrífuga, misture esses reagentes que são comuns a todas as reações. Tampão de ligação 10X, polissorbato DTT, Poli (dI-dC) e DNA de esperma de salmão.

Para configurar as reações EMSA, adicione água livre de nuclease a cada tubo de microcentrífuga, de modo que o volume final, após a adição de todos os reagentes, seja de 20 microlitros. Adicione a quantidade apropriada de master mix a cada tubo de microcentrífuga. Adicionar oito microgramas de lisado nuclear aos tubos de microcentrífuga adequados.

Incluir tubos contendo o oligo, sem extracto nuclear, como controlos negativos. Adicione 50 femtomoles de oligo aos tubos de microcentrífuga apropriados e agite para misturar. Gire brevemente o conteúdo para o fundo do tubo.

Incube todos os tubos, por 20 minutos, em temperatura ambiente. Em seguida, adicione dois microlitros de corante de carregamento laranja 10X a cada tubo de microcentrífuga. Pipete para cima e para baixo para misturar.

Carregue as amostras no gel TBE de seis por cento pré-corrida, pipetando para cima e para baixo para misturar e, em seguida, expelindo cada amostra para um poço separado. Execute o gel a 80 volts por aproximadamente 60 a 75 minutos, até que o corante laranja tenha migrado de dois terços a três quartos do gel. Quando a execução estiver concluída, use uma faca de gel para abrir o de plástico.

Remova o gel do e coloque-o em um recipiente com 0,5% de tampão TBE para evitar que seque. Coloque o gel na superfície de um sistema de imagem infravermelha e de quimioluminescência. Elimine quaisquer bolhas ou contaminantes que possam perturbar a imagem.

Digitalize o gel usando o software do sistema de varredura conforme descrito no texto do protocolo. Para iniciar este procedimento, prepare um estoque de trabalho oligo de cinco micromolares, conforme descrito no texto do protocolo. Coloque os oligos em um bloco de calor a 95 graus Celsius por cinco minutos.

Após cinco minutos, desligue o bloco de calor e deixe os oligos esfriarem lentamente até a temperatura ambiente antes de usar. Aqueça os seguintes tampões à temperatura ambiente: tampão de ligação, tampão de lavagem de baixa rigidez, tampão de lavagem de alta frieza e tampão de eluição. Preparar as misturas de ligação para cada variante.

Misturar um volume de lisado nuclear com dois volumes de tampão de ligação. Adicione 1X inibidor de fosfatase, 0,5 milimolar PMSF e 1X intensificador de ligação. Adicione 10 microlitros de cinco DNA de captura biotinilada micromolar a cada mistura de ligação.

Misture sacudindo o tubo várias vezes. Incube as misturas de ligação por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 100 microlitros de estreptavidina MicroBeads a cada mistura de ligação.

Incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Para cada sonda oligo que está sendo testada, coloque uma coluna de ligação no separador magnético. Certifique-se de que as colunas estejam rotuladas com a variante oligo que foi usada na mistura de ligação.

Coloque um tubo de microcentrífuga diretamente sob cada coluna de ligação e aplique 100 microlitros de tampão de ligação para enxaguar a coluna. Pipetar o conteúdo de cada mistura de ligação em colunas separadas. Deixe o líquido fluir completamente através da coluna para o tubo de microcentrífuga.

Aplique 100 microlitros de tampão de lavagem de baixa rigidez na coluna e espere até que o reservatório da coluna esteja vazio. Aplique 100 microlitros de tampão de lavagem de baixa rigidez na coluna novamente. Aplique 100 microlitros de tampão de lavagem de alta rigidez na coluna e aguarde até que o reservatório da coluna esteja vazio.

Aplique 100 microlitros de tampão de lavagem de alta rigidez na coluna novamente. Adicione 30 microlitros de tampão de eluição nativo à coluna e deixe descansar por cinco minutos. Por fim, adicione mais 50 microlitros de tampão de eluição nativo para eluir os fatores de transcrição ligados.

A fim de explorar a reprodutibilidade dos resultados da EMSA e as consequências dos ciclos de congelamento e descongelamento, oligos contendo o alelo de referência ou não referência de uma variante genética foram usados para sondar a mesma preparação de extrato nuclear de linfócitos B após vários ciclos de congelamento e descongelamento. A seta azul indica a sonda livre. A ligação dos fatores de transcrição ao oligo é vista como uma banda na metade superior do gel, indicada pela seta vermelha.

Esses resultados indicam que congelar e descongelar esse extrato nuclear específico até cinco vezes não tem, aparentemente, nenhum efeito sobre a integridade das proteínas. Também é importante otimizar a relação sinal-ruído para a EMSA. Várias concentrações de oligos foram usadas para sondar uma única preparação de lisado nuclear.

Observou-se um aumento na intensidade da banda, até 100 femtomoles de oligo. Resultados representativos de um estudo de um alelo de risco associado ao lúpus são mostrados aqui. O fator de transcrição, STAT 1, foi identificado pela primeira vez por DAPA seguido de análise proteômica.

Um western blot DAPA confirmou a identidade do STAT 1 e a maior ligação da forma fosforilada do STAT 1 ao oligo de risco lúpico. Após esse procedimento, outras técnicas, como espectrometria de massa e western blot, podem ser realizadas. Isso nos ajudará a identificar a proteína reguladora que mostra a ligação dependente do alelo.

Ensaios repórter como a luciferase também podem ser usados para investigar mudanças na expressão gênica em função do alelo.