Name: Engenharia de um hidrogel de camada dupla para controlar a diferenciação ASC (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprenda a criar um hidrogel de camada dupla com colágeno, fibrina e quitosana para direcionar a diferenciação de células-tronco adiposas em aplicações de engenharia tecidual e cicatrização dérmica.

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SN foi apoiado por uma bolsa pós-doutorado da Iniciativa Engenharia de Tecidos Pittsburgh. DOZ é apoiado por uma subvenção concedida à Fundação de Genebra.

<ol><li>Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bilayer+construct+controls+adipose-derived+stem+cell+differentiation+into+endothelial+cells+and+pericytes+without+growth+factor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation.</a> Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).</li>
<li>Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+hydrogel+niches+that+promote+hMSC+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability.</a> Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).</li>
<li>Benoit, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-linked+kinase+production+prevents+anoikis+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells.</a> J Biomed Mater Res A. 81, 259-268 (2007).</li>
<li>Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+stem+cells+and+biomaterial+scaffolds+for+constructing+tissues+and+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery.</a> , (2008).</li>
<li>Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cell+delivery+into+collagen+gels+using+chitosan+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 1369-1384 (2010).</li>
<li>Bubnis, W. A., Ofner, M. C. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+epsilon-amino+groups+in+soluble+and+poorly+soluble+proteinaceous+materials+by+a+spectrophotometric+method+using+trinitrobenzenesulfonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).</li>
<li>Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PEGylated+fibrin+patch+for+mesenchymal+stem+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">A PEGylated fibrin patch for mesenchymal stem cell delivery.</a> Tissue Eng. 12, 9-19 (2006).</li>
<li>Bornstein, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+rattail+collagen+used+as+substrate+for+tissue+cultures+on+coverslips+in+Maximow+slides+and+roller+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes.</a> Lab Invest. 7, 134-137 (1958).</li>
<li>Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+differentiation+of+bone+marrow+stem+cells+is+directed+by+a+tunable+three-dimensional+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Vascular differentiation of bone marrow stem cells is directed by a tunable three-dimensional matrix.</a> Acta Biomater. 6, 3395-3403 (2010).</li>
<li>Rochon, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+epithelial+cells+regulate+the+size+and+morphology+of+tissue-engineered+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Normal human epithelial cells regulate the size and morphology of tissue-engineered capillaries.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 1457-1468 (2010).</li>
<li>Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+for+expansion+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).</li>
</ol>

Não há interesses conflitantes financeiros existem. Alerta As opiniões ou afirmações contidas neste documento são as opiniões pessoais dos autores e não devem ser interpretadas como oficial ou refletindo as opiniões do Departamento de Defesa ou o Governo dos EUA. Os autores são funcionários do governo dos EUA, e este trabalho foi elaborado como parte das suas funções oficiais. Todo o trabalho foi apoiado pelo EUA Pesquisa Médica do Exército e do Comando de Material. Este estudo foi realizado ao abrigo de um protocolo revisto e aprovado pelo Comitê de Ética Médica EUA Exército e do Comando de Material Conselho de Revisão Institucional e de acordo com o protocolo aprovado.

ASC são bem conhecidos pela sua facilidade de isolamento e capacidade de diferenciar para vários tipos de células. Com as técnicas descritas neste manuscrito, somos capazes de explorar a plasticidade da ASC por expor essas células para biomatrices múltiplos simultaneamente. Como as células migram para longe de sua base CSM e entrar no seu meio ambiente extracelular, as células tomar sugestão do andaime e pode manter &quot;stemness&quot; (colágeno) ou ser induzido a diferenciar os tipos de células para vasculares e vascu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14175 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Colagenase do Tipo II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6685 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> 70-iM filtro de rede de nylon </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> 100-iM filtro de rede de nylon </td><td> BD Biosciences </td><td> 352360 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> MesenPRO Sistema Meio de Crescimento </td><td> Invitrogen </td><td> 12746-012 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td&gt; <td> Gibco </td><td> 25030 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C8106 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> T75 frasco de cultura de tecidos </td><td> BD Biosciences </td><td> 137787 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Chitosan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448869 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Ácido Acético </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 320099 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> N-octanol </td><td> Acros Organics </td><td> 150630025 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Sorbitano-mono-oleato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6760 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Hidróxido de Potássio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1767 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Acetona </td><td> Fisher Scientific </td><td> L-4859 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270741 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Trinitro benzenossulfónico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2297 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Ácido clorídrico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 320331 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Éter etílico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 472-484 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> 8 m de tecido Placa Insere Cultura </td><td> BD Biosciences </td><td> 353097 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> 1,5 ml tubos de microcentrífuga </td><td> Pescador </td><td> 05-408-129 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Reagente MTT </td><td> Invitrogen </td><td> M6494 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8779 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Qtracker celular Labeling Kit (QRastreador 655) </td><td> Sondas moleculares </td><td> Q2502PMP </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Colágeno tipo 1 </td><td> Travigen </td><td> 3447-020-01 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Hidróxido de Sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8045 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> 12-Bem Cultura Pratos Tecido </td><td> BD Biosciences </td><td> 353043 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Fibrinogênio </td><td> Sigma </td><td> F3879 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Trombina </td><td> Sigma </td><td> T6884 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Derivada Benztriazole de Polietileno </td><td> Sunbio </td><td> DE-034GS </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Tampão de Tris Tablet (pH 7,6) </td><td> Sigma </td><td> T5030 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Centrifugar </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Equivolvimento </td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> New Brunswick Scienctific </td><td> C24 </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Incubadora de CO umidificado com Air-5 2% </td><td> Thermo Scientific </td><td> Modelo 370 </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Agitador </td><td> IKA </td><td> Visc6000 </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Agitador Magnético </td><td> Corning </td><td> PC-210 </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Exsicador de vácuo </td><td> - </td><td> - </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Analisador de Tamanho de Partícula </td><td> Malvern </td><td> STP2000 Spraytec </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Banho de água </td><td> Fisher Scientific </td><td> Isotemp210 </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Espectrofotômetro </td><td> Beckman </td><td> Beckman Coulter DU Espectrofotômetro 800UV/Visible </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Vórtice </td><td> Diagger </td><td> 3030a </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Leitora </td><td> Molecular Devices </td><td> Spectramax M2 </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Luz / microscópio de fluorescência </td><td> Olimpo </td><td> IX71 </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Olimpo </td><td> FV-500 Laser Scanning microscópio confocal </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Microscópio Eletrônico de Varredura </td><td> Carl Zeiss microfilmagem </td><td> Leo 435 VP </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Microscópio eletrônico de transmissão </td><td> JEOL </td><td> JEOL 1230 </td><td> Equipamento </td></tr></tbody></table>

engenharia de um hidrogel de camada dupla para controlar a diferenciação asc

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Polímeros naturais ao longo dos anos ganharam mais importância devido à sua biocompatibilidade hospedeiro e capacidade de interagir com células in vitro e in vivo. Uma área de investigação que tem a promessa em medicina regenerativa é o uso combinatória de novos biomateriais e células estaminais. Uma estratégia fundamental no campo da engenharia de tecidos é o uso de tridimensional andaime (por exemplo, descelularizados matriz extracelular, hidrogéis, micro / nano partículas) para dirigir a função da célula. Esta tecnologia tem evoluído a partir da descoberta de que as células precisam de um substrato sobre o qual podem aderir, proliferar, e expressar seu fenótipo diferenciado celular e função 2-3. Mais recentemente, tem sido também determinado que as células não só a utilização destes substratos para a adesão, mas também interagir e tomar pistas a partir do substrato da matriz (matriz, por exemplo, extracelular, ECM) 4. Portanto, as células e andaimes ter uma ligação recíproca queserve para controlar o desenvolvimento do tecido, organização e função final. As células-tronco adiposas (ASC) são mesenquimais, as células estaminais hematopoiéticas não-apresentar no tecido adiposo que podem exibir multi-linhagem diferenciação e servir como uma fonte prontamente disponível de células (isto é pré-vascular endotélio e pericitos). Nossa hipótese é que as células-tronco derivadas de tecido adiposo pode ser direcionado para diferentes fenótipos simultaneamente, bastando co-cultura-los em matrizes bifásicos 1. O nosso laboratório é focado sobre a cicatrização de feridas dérmica. Para este fim, foi criada uma única matriz composta a partir de os biomateriais naturais, fibrina, colagénio, quitosano e que pode imitar as características e funções de um ambiente de cicatrização da ferida dérmica específico ECM.

Este protocolo é focado na utilização a capacidade inerente de células estaminais para tomar cue a partir de sua matriz circundante extracelular e ser induzidas a diferenciar-se em múltiplos fenótipos. Este manuscrito métodos estende nossa descrição e caracterização de um modelo utilizando um hidrogel de camada dupla, composto de PEG-fibrina e colagénio, ao mesmo tempo, co-diferenciar células-tronco adiposas<sup&gt; 1</sup&gt;.

Engenharia de um hidrogel de camada dupla para controlar a diferenciação ASC

Ao longo dos anos, os polímeros naturais ganharam maior importância devido à sua biocompatibilidade com o hospedeiro e à capacidade de interagir com células in vitro e in ...

O objetivo geral deste procedimento é criar uma matriz composta feita de biomateriais naturais que possa ser usada para entregar e diferenciar células-tronco, auxiliando na cicatrização de feridas. Isso é realizado primeiramente isolando células-tronco derivadas de adipócitos ou a SC de um animal de teste. Em seguida, as a SC são carregadas em microesferas de quitosana pré-fabricadas.Em seguida, o gel de colágeno FIBRILADO é moldado, e as microesferas A-S-C-C-S-M são depositadas sobre o gel de colágeno. Por fim, o gel de fibrina PEG é moldado sobre o gel de colágeno A-S-C-C-S-M, e o meio é adicionado. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a migração simultânea bidirecional de A SC da microesfera CSM para as matrizes de colágeno e de fibrina PEG.Por meio deste procedimento, uma única fonte de células-tronco pode receber sinais diferenciais dos microambientes de colágeno e fibrina PEG, e ser diferencialmente estimulada a produzir fatores pleiotrópicos e formar uma rede de estruturas pré-vasculares. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como compósitos de material único ou substitutos dérmicos descelularizados, é que esses outros produtos não abordam ativamente a revascularização do produto pelo hospedeiro. Tivemos inicialmente a ideia para este método ao observar que o RAD A SE isolado tem a tendência de se diferenciar em direção a um fenótipo vascular quando cultivado em uma matriz de fibrina de porco.Essa observação despertou a ideia de que uma única fonte de células-tronco poderia ser utilizada simultaneamente em um sistema composto por diferentes biomateriais. Após o isolamento e cultivo de células-tronco derivadas de adipócitos ou ASCs, a preparação de microesferas de quitosana ou CSMs e o carregamento das ASCs nas CSMs, prepare o hidrogel de polietilenoglicol e fibrina dissolvendo o peg modificado com succinil glutarato em quatro mililitros de solução salina tamponada com tris. Imediatamente antes do experimento, utilize um filtro de 0,22 mícron para esterilizar a solução.Em um poço de cultura de uma placa de seis poços, misture 500 microlitros de solução estoque de fibrinogênio e 250 microlitros de solução estoque de PEG, e incube por 20 minutos em um incubador umidificado com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Em seguida, misture 250 microlitros de A-S-C-C-S-M previamente preparado com a solução de fibrinogênio pegilado, adicione imediatamente um mililitro de solução estoque de trombina e, usando uma pipeta, agite rapidamente uma ou duas vezes; imediatamente após, coloque a mistura de gel celular em uma placa de 12 poços e incube em câmara umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 10 minutos. A seguir, lave o fibrina peg resultante duas vezes com HBSS e incube com meio mínimo essencial alfa suplementado com 10% de soro bovino fetal em um incubador umidificado com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius, utilizando técnicas padrão de microscopia de luz ao longo de um período de 11 dias.Observe a migração de células do A-S-C-C-S-M para a mistura de gel, com colágeno tipo I extraído de tendões de cauda de rato utilizando dois hidróxidos de sódio normais. Ajuste o pH para 6,8 e realize a fibrilação. Adicione a mistura de colágeno fibrilado, A-S-C-C-S-M, a uma placa de 12 poços e incube em incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 30 minutos.Após verificar que a fibrilação está completa, incubar os géis de colágeno A-S-C-C-S-M por até 11 dias em uma estufa umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Observar a migração de células do CSM para o interior do gel ao longo de um período de 11 dias utilizando técnicas padrão de microscopia, a fim de desenvolver o constructo bicamada para estudar as propriedades migratórias e de coindução de uma única fonte de células-tronco. Utilizando dois bioescafolds.Prepare os géis de colágeno e de fibrina com PEG com as seguintes pequenas modificações: prepare um mililitro de colágeno a 7,5 miligramas por mililitro. Em seguida, transfira a mistura para um inserto de cultura tecidual de seis poços e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a completa fibrilação, sobreponha à superfície do colágeno 200 microlitros de cinco miligramas de A-S-C-C-S-M em meio de cultura.Após as microesferas se sedimentarem sobre o gel, prepare o gel de fibrina PEG utilizando 250 microlitros de meio de cultura celular. Em seguida, sobreponha a solução de fibrinogênio pegilado e trombina sobre as camadas de colágeno A-S-C-C-S-M. Após a conclusão, incube as construções por 30 minutos em um incubador úmido com 5% de dióxido de carbono para obter a ativação completa.Finalmente, adicione um mililitro de meio na câmara superior sobre o constructo e três mililitros de meio na câmara inferior. A caracterização de uma SC incorporada nesta estrutura revelou que CSMs carregadas com SC podem ser colocadas em sanduíche entre uma camada de colágeno e fibrina peg, simultaneamente, e receber sinais diferencialmente de ambos os ambientes extracelulares para prosperar em suas novas condições. Como mostrado aqui, o colágeno sustentou a capacidade das ASCs de permanecerem como células-tronco, conforme demonstrado pela expressão de stro um em verde, bem como por sua morfologia semelhante à de fibroblastos.Em contraste, o fibrina PEG induziu as ASCs a se diferenciarem em um fenótipo avascular, conforme demonstrado por sua morfologia semelhante a tubos, mostrada aqui, completa com lúmen e expressão específica de células endoteliais do fator de von Willebrand, mostrado aqui em vermelho. Além disso, conforme demonstrado aqui, esses fenótipos observados pareceram ocorrer precocemente em cultura e foram mantidos por 11 dias. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células-tronco derivadas de adipócitos de rato, carregá-las em microesferas de quitosana e incorporá-las em um hidrogel bicamada utilizando biomateriais aprovados pela FDA.Não se esqueça de que os biomateriais e células utilizados neste protocolo são derivados de animais e seres humanos e podem ser extremamente perigosos se estiverem contaminados com patógenos de seus hospedeiros. Precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual e técnicas de cultura celular assépticas, devem sempre ser adotadas ao realizar estes procedimentos.

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