Engenharia de um hidrogel de camada dupla para controlar a diferenciação ASC

O objetivo geral deste procedimento é criar uma matriz composta feita de biomateriais naturais que possam ser usados para fornecer e diferenciar células-tronco para auxiliar na cicatrização de feridas. Isso é feito isolando primeiro as células-tronco derivadas do tecido adiposo ou um SC de um animal de teste. Em seguida, o A SC é carregado em microesferas de quitosana pré-fabricadas.

Em seguida, o gel de colágeno FIBRILADO é fundido e os grânulos ASC são colocados em camadas sobre o gel de colágeno. Finalmente, o gel de fibrina PEG é fundido sobre o gel de colágeno ASC e o meio é adicionado. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a migração simultânea bidirecional de A SC do cordão CSM para as matrizes de colágeno e fibrina PEG.

Por meio desse procedimento, uma única fonte de células-tronco pode receber pistas diferenciais dos microambientes de colágeno e fibrina PEG e ser estimulada diferencialmente para produzir fatores pleiotrópicos e formar uma rede de estruturas pré-vasculares. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como compósitos de material único ou substitutos da pele descelularizada, é que esses outros produtos não abordam ativamente a revascularização do produto pelo hospedeiro. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando notamos que o RAD A SE isolado tem a propensão de se diferenciar para um fenótipo vascular quando cultivado em uma matriz de fibrina de porco.

Essa observação despertou a noção de que uma única fonte de células-tronco poderia ser utilizada simultaneamente em um sistema que consistia em diferentes biomateriais. Depois de isolar e cultivar células-tronco derivadas de tecido adiposo ou ASCs, preparar microesferas de quitosana ou CSMs e carregar as ASCs nos CSMs, prepare polietilenoglicol, hidrogel de fibrina dissolvendo o granulo modificado com derate de glut de succinil em quatro mililitros de solução salina tamponada com tris. Pouco antes do experimento, use um filtro de 0,22 mícron para esterilizar a solução.

Em um poço de cultura de uma mistura de placas de seis poços, 500 microlitros de estoque de fibrinogênio e 250 microlitros de estoque de PEG incubam por 20 minutos em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Em seguida, misture 250 microlitros de A-S-C-C-S-M previamente preparado com a solução de fibrinogênio peguilado, adicione imediatamente um mililitro de solução estoque de trombina e, usando uma pipeta, trirate rapidamente uma ou duas vezes, coloque imediatamente a mistura de gel celular em uma placa de 12 poços e incube em uma câmara umidificada de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, lave a fibrina de peg resultante duas vezes com HBSS e incube com meio essencial mínimo alfa suplementado com 10% de FBS em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius usando técnicas padrão de microscopia de luz durante um período de 11 dias.

Observe a migração de células do CSM para a mistura de gel, A-S-C-C-S-M com colágeno tipo um extraído dos tendões da cauda de rato usando dois hidróxido de sódio normal. Ajuste o pH para 6,8 e fibrile. Adicione a mistura de colágeno fibrilado, ASCCM, a uma placa de 12 poços e incube em uma incubadora umidificada com dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Depois de verificar se a fibrilação está completa, incube os géis de colágeno A-S-C-C-S-M por até 11 dias em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Observe a migração de células do CSM para o gel durante um período de 11 dias usando técnicas de microscopia padrão para desenvolver a construção da bicamada para estudar as propriedades migratórias e de co-indução de uma única fonte de células-tronco. Usando dois andaimes biológicos.

Prepare os géis de colágeno e de fibrina PEG com as seguintes pequenas modificações, prepare um mililitro de 7,5 miligramas por mililitro de colágeno. Em seguida, transfira a mistura para uma inserção de cultura de tecidos de seis poços e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a fibrilação completa, coloque sobre a superfície do colágeno, 200 microlitros de cinco miligramas de A-S-C-C-S-M em meio de cultura.

Depois que as microesferas se assentarem sobre o gel, prepare o gel de fibrina PEG usando 250 microlitros de meio de cultura de células. Em seguida, coloque a solução de trombina de fibrinogênio peguilado sobre as camadas de colágeno ASCCM. Depois de concluído, incube as construções por 30 minutos em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono para obter a conclusão.

Finalmente, coloque um mililitro de meio na câmara superior sobre a construção e três mililitros de meio na câmara inferior. A caracterização de um SC embutido neste andaime revelou que um CSMs carregado com SC pode ser imprensado entre uma camada de colágeno e fibrina de pino simultaneamente e diferencialmente receber dicas de ambos os ambientes extracelulares para prosperar sob suas novas condições. Como mostrado aqui, o colágeno apoiou a capacidade das ASCs de permanecerem células-tronco, como foi demonstrado por sua expressão de stro um em verde, bem como sua morfologia semelhante a fibroblastos.

Em contraste, a fibrina PEG induziu as ASCs a se diferenciarem em direção ao fenótipo avascular, como é demonstrado por sua morfologia em forma de tubo mostrada aqui, completa com lúmen e sua expressão específica de células endoteliais da marca e fator de von Willow mostrados aqui em vermelho. Além disso, como demonstrado aqui, esses fenótipos observados pareciam ocorrer no início da cultura e foram mantidos por 11 dias. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células-tronco derivadas de tecido adiposo de rato, carregá-las em chito e microesferas e incorporá-las em um hidrogel de bicamada usando biomateriais aprovados pela FDA.

Não se esqueça de que os biomateriais e células utilizados neste protocolo são derivados de animais e humanos e podem ser extremamente perigosos se estiverem contaminados com patógenos de seu hospedeiro. E precauções como equipamentos de proteção individual e técnicas de cultura de células assépticas devem sempre ser tomadas durante a realização desses procedimentos.