Gradiente de pressão Chip para estimulantes comportamentos celulares em hidrogel de célula-carregado

O objetivo geral deste chip de deformação gradiente é fornecer uma abordagem simples para gerar deformações estáticas de gradiente não contínuo em um hidrogel 3D para a investigação do comportamento celular sob uma série de condições de deformação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da bioengenharia, como os estímulos de uma diferenciação de células-tronco e a regulação do alinhamento celular para o desenvolvimento de órgãos de tecidos artificiais. A principal vantagem desta técnica é que várias cepas podem ser aplicadas na camada celular e hidrogéis no mesmo microambiente para comparação do comportamento celular.

A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de preparação do chip são difíceis de aprender, pois a luz deve ser concluída em três a quatro horas para que a base do experimento garanta alta variabilidade celular. Pese 10 gramas de gelatina em pó e adicione-o a um frasco de vidro com 100 mililitros de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, ou DPBS. Coloque uma barra de agitação magnética no frasco e coloque-o em uma placa quente de agitação.

Cubra o frasco com papel alumínio para evitar a evaporação da água. Defina a temperatura da placa quente para 50 a 60 graus e o agitador a 100 RPM por uma hora para dissolver a gelatina em pó. Depois que a gelatina se dissolver, adicione oito mililitros de anidrido metacrílico muito lentamente usando uma pipeta.

Deixe reagir a 60 graus Celsius por três horas. Em seguida, adicionar o DPBS pré-aquecido ao balão até obter um volume final de 500 ml. Deixe a solução misturar bem por 15 minutos para interromper a reação.

Enquanto isso, corte uma membrana de diálise em vários tubos de 25 milímetros de comprimento. Mergulhe-os em água deionizada por 15 minutos. E faça um nó para fechar uma extremidade dos tubos de diálise.

Carregue a quantidade apropriada da solução de polímero nos tubos de diálise e feche a outra extremidade. Em seguida, coloque os tubos cheios em um copo de plástico de cinco litros com água deionizada por uma semana. Renove a água deionizada duas vezes ao dia e mantenha a solução a 40 a 50 graus Celsius durante o processo de diálise.

Após a diálise, colete a solução dos tubos em um frasco de vidro de 500 mililitros. Despeje aproximadamente 450 a 500 mililitros de solução em um copo de filtro de 500 mililitros. E aplique um vácuo para forçar a solução a passar pela membrana do filtro para esterilização.

Em seguida, transfira o polímero esterilizado para vários tubos esterilizados de 50 mililitros. Transfira o polímero esterilizado para vários tubos esterilizados de 50 mililitros e armazene-os em um freezer de 80 graus Celsius negativos por três a cinco dias. Liofilize o polímero de 80 graus Celsius negativos por uma semana usando um liofilizador para formar GelMA, que pode ser armazenado em um freezer de 80 graus Celsius negativos.

Para a fabricação do chip, primeiro prepare o polimetacrilato ou PMMA, tocado e moldado conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, prepare a tampa PTMS e o plugue PTMS misturando adequadamente 30 gramas de elastômero PTMS e três gramas de agente de cura PTMS. Desgaseifique a mistura em uma câmara de vácuo por uma hora.

Moldar 1,8 a dois gramas da mistura no molde de PMMA para a tampa PTMS. Use também a quantidade apropriada para preencher cada cavidade do molde de PMMA para o plugue PTMS. Além disso, funda 10 gramas de mistura PTMS não curada em uma placa de plástico em branco de 10 centímetros.

Coloque esses moldes em uma câmara de vácuo para desgaseificar por 30 minutos. Cure o PTMS por duas horas a 80 graus Celsius. Depois de resfriar o PTMS curado no molde, solte as tampas PTMS e os plugues PTMS dos moldes de PMMA.

Em seguida, faça dois furos com diâmetros de cerca de três milímetros nas extremidades dos canais de fluxo das tampas PTMS. Corte a folha PTMS moldada da placa de plástico de 10 centímetros em muitos cubos de um centímetro por um centímetro. E faça um furo de três milímetros em cada cubo PTMS.

Cole dois cubos PTMS não curados de um centímetro por um centímetro nas aberturas da tampa PTMS para servir como reservatórios médios e para auxiliar no processo de cura dos padrões de hidrogel circular gradiente. Em seguida, catalise por uma hora a 80 graus Celsius. Em seguida, cole as tampas PTMS com os dois reservatórios PTMS em uma lâmina revestida com TMSPMA.

Para fazer isso, pré-trate o lado de colagem da tampa PTMS e a lâmina revestida com TMSPMA sob uma máquina de plasma de oxigênio por 90 segundos de tratamento com plasma de oxigênio. Entre em contato com a superfície tratada com plasma das tampas PTMS e da lâmina TMSPMA e pressione-as de perto para uma ligação permanente através da formação da ligação silício oxigênio silício. Imprima uma fotomáscara imprimindo o layout estabelecido em um filme transparente.

Em seguida, corte a fotomáscara impressa em 25 milímetros por 37,5 milímetros de tamanho. Pese 25 miligramas de GelMA liofilizado em 0,3 mililitros de meio de cultura de células pré-aquecido em um tubo de microcentrífuga preto de 1,5 mililitro. Coloque o tubo de microcentrífuga em uma placa quente do agitador de laboratório até que o GelMA se dissolva no meio.

Adicione 50 miligramas de fotoiniciador a um mililitro de DPBS em um tubo de microcentrífuga. E coloque-o em um forno a 80 graus Celsius por 15 minutos ou até que o fotoiniciador se dissolva. Adicione 25 microlitros do fotoiniciador de 10% ao tubo da microcentrífuga.

Pipete várias vezes para misturar bem. Em seguida, conte três milhões de células NIH3T3 usando um contador de células automatizado. Após centrifugar a suspensão a 200 Gs durante cinco minutos, rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 175 microlitros de meio de cultura celular.

Adicione a solução celular ao tubo de microcentrífuga para obter uma solução de célula pré-polímero de 5% GelMA, 0,5% fotoiniciador e cerca de seis milhões de células 3T3 por mililitro. Após a mistura, carregue 100 microlitros de pré-polímero celular em uma microsseringa de 100 microlitros. Alinhe manualmente um pedaço da fotomáscara na lâmina inferior do chip de cepa gradiente esterilizado.

E simplesmente fixe a posição usando uma pequena gota de água deionizada no meio. Conecte a microsseringa de 100 microlitros, carregada com solução de célula de pré-polímero, à entrada do chip. Em seguida, coloque 50 microlitros de solução de célula de pré-polímero no canal de fluxo usando a microsseringa e tampe a saída usando um plugue PTMS.

Injete 40 microlitros extras de solução para criar uma protuberância convexa na membrana PTMS circular. Mova o chip com a fotomáscara, a microsseringa e o plugue PTMS para baixo de uma lâmpada UV. E exponha por 30 a 45 segundos para reticular o hidrogel circular concêntrico na câmara fluídica.

Após a reticulação, remova o plugue PTMS e a microsseringa para liberar a pressão do líquido. Use uma seringa de um mililitro carregada com DPBS pré-aquecido para lavar as resinas não reticuladas três vezes, lavando da entrada para a saída. Em seguida, encha o canal de fluxo com cerca de 100 microlitros de meio de cultura de células.

Coloque o chip em um prato de cultura esterilizado e cultive em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma semana. Atualize o meio todos os dias. Tire imagens de três chips no dia zero após quatro horas de incubação como o grupo de controle.

E três chips no terceiro dia como o conjunto experimental usando um microscópio com uma objetiva de 20 vezes. Meça a largura da linha de cada hidrogel da linha um à linha 12 usando um software para calcular as manchas de compressão. Aqui são mostrados resultados representativos de padrões de hidrogel com zero microlitro e 40 microlitros sobre injeção, após reticulação UV e incubação de quatro horas.

A largura da linha do hidrogel 3D no controle de injeção não excessiva parece uniforme conforme o esperado. No entanto, os padrões de hidrogel com 40 microlitros sobre injeção fornecem uma largura de linha gradiente de hidrogéis diminuindo da linha um para a linha 12. Após três dias de incubação, as células do hidrogel se estendem em direções diferentes.

As células da linha um se alinham ao longo da direção radial devido à estimulação do alongamento do hidrogel. Pelo contrário, as células da linha 12 se alinham ao longo da forma de hidrogel, onde a sugestão da geometria domina o alinhamento celular. Não há alinhamento celular específico na linha 7, onde as duas pistas de alinhamento celular da linha um e da linha 12 se equilibram.

Uma vez que a medição do microambiente de cepas de gradiente em hidrogel 3D pode ser feita pelo chip de deformação de gradiente em duas horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de esterilizar o chip de deformação gradiente antes de carregar a solução de pré-polímero celular. Limpe também bem a superfície do chip com etanol 75% antes de colocá-los na incubadora de cultura de células.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão muito boa de como gerar um chip de deformação gradiente para investigar o comportamento das células sob diferentes cepas imperiais.