Name: Gradiente de pressão Chip para estimulantes comportamentos celulares em hidrogel de célula-carregado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Aprenda a criar um chip de deformação gradiente para investigar comportamentos celulares em hidrogéis carregados com células. Este método permite aplicar tensões estáticas variadas em microambientes consistentes para engenharia de tecidos.

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Este projecto foi apoiado pela graduação aluno estudo no exterior programa (NSC-101-2917-I-007-010); o programa de Engenharia Biomédica (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); e o programa nacional de nanotecnologia (NSC-101-2120-M-007-001-), Conselho Nacional de ciência, do R.O.C, Taiwan. Os autores gostaria de agradecer a Prof Ali Khademhosseini, Gulden Camci-Unal, Arghya Paul e Ronglih Liao na Harvard Medical School para compartilhar a tecnologia de encapsulamento de hidrogel e célula.

1. Síntese de GelMA
<ol>
	<li>Pese 10 g de gelatina em pó e adicione-o a um frasco de vidro com 100 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS). Coloque uma barra de agitação magnética no frasco e coloque-o em uma placa quente de agitação.</li>
	<li>Cubra o frasco com papel alumínio para evitar a evaporação da água. Ajuste a temperatura da placa de aquecimento para 50-60 °C e o agitador a 100 rpm por 1 h para dissolver bem a gelatina em pó.</li>
	<li>Depois que a gelatina se dissolver, adicione 8 mL de anidrido metacrílico muito lentamente (uma gota por segundo) usando uma pipeta. Deixar reagir a 60 °C durante 3 h.</li>
	<li>Adicionar DPBS pré-aquecido (40 °C) ao balão até obter um volume final de 500 ml e deixar esta mistura bem durante 15 minutos para interromper a reação.</li>
	<li>Enquanto isso, corte uma membrana de diálise (peso molecular de corte de 14 kDa) em vários tubos de 25 cm de comprimento. Mergulhe-os em água deionizada (DI) por 15 min e faça um nó para fechar uma extremidade dos tubos de diálise.</li>
	<li>Carregue a quantidade apropriada (30 - 60 mL) da solução de polímero nos tubos de diálise e feche a outra extremidade. Coloque-os em um copo de plástico de 5 L com água DI por uma semana. Renove a água DI duas vezes ao dia e mantenha a solução a 40 - 50 °C durante o processo de diálise.</li>
	<li>Colete a solução do tubo em um frasco de vidro de 500 mL. Despeje ~ 450 - 500 mL de solução em um copo de filtro de 500 mL (tamanho de poro de 0,22 μm) e aplique um vácuo no copo do filtro para forçar a solução a passar pela membrana do filtro para esterilização.</li>
	<li>Transfira o polímero esterilizado para vários tubos esterilizados de 50 mL e armazene-os em um freezer a -80 ° C por 3 a 5 dias.</li>
	<li>Liofilize o polímero a -80 °C por 1 semana usando um liofilizador para formar GelMA. Armazene o GelMA em um freezer a -80 °C.</li>
</ol>
2. Modificação do metacrilato de propila 3-(trimetoxissilil) (TMSPMA)
<ol>
	<li> Corte as lâminas de vidro comerciais em dois pedaços pequenos (25 mm x 37,5 mm) e mergulhe-os em solução de NaOH 0,5 M por 4 h. Lave as lâminas com uma grande quantidade de água DI.</li>
	<li>Coloque a lâmina em uma grade dentro de um recipiente de vidro com etanol a 95% e limpe usando um ultrassônico a 43 kHz por 15 min. Seque a lâmina de vidro ao ar.</li>
	<li>Mergulhe as lâminas de vidro em TMSPMA a 5% em etanol a 99,5% por 1 h.</li>
	<li>Lave as lâminas em etanol a 95%, seque as lâminas ao ar e recoza o revestimento TMSPMA em um forno a 80 ° C por 2 h.</li>
</ol>
3. Fabricação de chips
<ol>
	<li>Pegue uma placa de polimetilmetacrilato (PMMA) de 2 mm e uma de 0,3 mm de espessura, aplique fita dupla-face em um lado da superfície do PMMA e solte o revestimento de um lado. Deixe duas placas de PMMA de 2 mm de espessura e uma placa de 1 mm de espessura sem fita dupla-face.</li>
	<li>Corte a laser uma placa de PMMA de 2 mm de espessura sem fita dupla-face em 42 mm x 30 mm para fazer a placa inferior. Corte uma placa de PMMA de 2 mm de espessura com fita dupla-face para fazer a moldura de limite, com dimensões externas de 42 mm x 30 mm e dimensões internas de 37,5 mm x 25 mm.</li>
	<li>Corte a laser a placa de PMMA de 0,3 mm de espessura com fita dupla-face em um círculo central de 12 mm com dois canais de fluxo de 2 mm de largura e 8 mm de comprimento em lados opostos do círculo (Figura 1a).</li>
	<li>Para preparar o molde de PMMA para fundir a tampa PDMS, monte as três peças de componentes de PMMA das etapas 3.2 a 3.3 (Figura 1b) usando fita dupla face.</li>
	<li>Corte a laser uma placa de PMMA de 2 mm de espessura com fita dupla-face em uma peça de 5 cm x 5 cm com uma matriz de 3 x 3 retângulos ocos de 8,5 mm x 8,5 mm. Corte outro pedaço de 5 cm x 5 cm com uma matriz de 3 x 3 de círculos ocos de 4 mm. Corte a laser uma placa de PMMA de 1 mm de espessura sem fita dupla-face em uma placa inferior de PMMA de 5 cm x 5 cm.</li>
	<li>Prepare o molde de PMMA para fundir o plugue PDMS montando as três peças de componentes de PMMA da etapa 3.5 (Figura 1c) usando fita dupla face.</li>
	<li>Preparar a tampa e a tampa PDMS misturando correctamente 30 g de elastómero PDMS e 3 g de agente de cura PDMS; desgaseificar a mistura numa câmara de vácuo durante 1 h.</li>
	<li>Moldar 1,8-2,0 g da mistura no molde de PMMA para a tampa do PDMS e usar a quantidade apropriada para preencher cada cavidade do molde de PMMA para o plugue PDMS. Moldar 10 g de mistura de PDMS não curada em uma placa plástica em branco de 10 cm. Coloque esses moldes em uma câmara de vácuo para desgaseificar por 30 min.</li>
	<li>Catalise o PDMS por 2 h a 80 °C. Depois de resfriar o PDMS curado no molde, solte as tampas do PDMS e os plugues do PDMS dos moldes de PMMA.</li>
	<li>Faça dois furos com diâmetros de cerca de 3 mm nas extremidades dos canais de fluxo das tampas PDMS.</li>
	<li>Corte a folha PDMS moldada a partir da placa de plástico de 10 cm em vários cubos de 1 cm x 1 cm e faça um furo de 3 mm em cada cubo PDMS. Cole dois cubos PDMS não curados de 1 cm x 1 cm nas aberturas da tampa PDMS (para servir como reservatórios médios e para auxiliar no processo de cura dos padrões circulares de hidrogel gradiente) e catalise por 1 h a 80 °C.</li>
	<li>Cole as tampas do PDMS com os dois reservatórios do PDMS em uma lâmina revestida com TMSPMA, pré-tratando o lado de ligação da tampa do PDMS e a lâmina revestida com TMSPMA sob uma máquina de plasma de oxigênio (potência de RF de 30 W (modo alto) e ar comprimido de 600 mTorr) ou um gerador corona eletrônico de alta frequência (115 V, 50/60 Hz, 0.35 A) por 90 s de tratamento com plasma de O2.</li>
	<li>Entre em contato com a superfície tratada com plasma das tampas PDMS e da lâmina TMSPMA e pressione-as estreitamente para uma ligação permanente através da formação de uma ligação Si-O-Si. 
	NOTA: Colocar o chip em um forno a 80 °C por 1 h pode aumentar ainda mais a força de ligação.</li>
	<li>Após o resfriamento, mergulhe os cavacos em etanol a 95% por 15 min e seque ao ar. Em seguida, esterilize os cavacos sob irradiação UV por 1 h e guarde-os em uma caixa embrulhada em papel alumínio na coifa laminar.</li>
</ol>
4. Deformação de gradiente estático no hidrogel carregado de células
<ol>
	<li>Imprima e corte um pedaço de fotomáscara, de 25 mm x 37,5 mm, imprimindo o layout em Figura 2b em um filme transparente. Ajuste o tamanho impresso de Figura 2b para corresponder à dimensão em Figura 2a.</li>
	<li>Prepare 100 mL de meio DMEM com 10% de FBS, 1% de Pen-Strep e 250 mL de DPBS em banho-maria a 37 °C para usar como meio de cultura de células.</li>
	<li>Pesar 25 mg de GelMA liofilizado em 0,3 mL de meio de cultura celular pré-aquecido (37 ° C) em um tubo de microcentrífuga preto de 1,5 mL. Coloque o tubo de microcentrífuga em um agitador de laboratório/placa quente até que o GelMA se dissolva no meio.</li>
	<li>Pesar 50 mg de fotoiniciador em 1 ml de DPBS num tubo de microcentrífuga e colocá-lo numa estufa a 80 °C durante 15 minutos ou até que o fotoiniciador se dissolva.</li>
	<li>Pegue 25 μL do fotoiniciador a 10% da etapa 4.4 e adicione-o ao tubo de microcentrífuga da etapa 4.3. Pipete várias vezes para misturar bem.</li>
	<li>Conte 3 x 106 células NIH 3T3 usando um contador de células automatizado. Centrifugue a suspensão a 200 x g durante 5 min, elimine o sobrenadante e ressuspenda as células em 175 μL de meio de cultura celular.</li>
	<li>Adicione a solução celular da etapa 4.6 ao tubo de microcentrífuga da etapa 4.5 para obter uma solução celular de pré-polímero de 5% de GelMA, fotoiniciador de 0,5% e ~ 6x 10 6 células 3T3 / mL. Após a mistura, coloque 100 μL de pré-polímero celular em uma microseringa de 100 μL.</li>
	<li>Alinhe manualmente (consulte Figura 3a) um pedaço da fotomáscara na lâmina inferior do chip de cepa de gradiente esterilizado e simplesmente fixe a posição usando uma pequena gota de água DI no meio. Conecte a microseringa de 100 μL carregada com solução de célula de pré-polímero à entrada do chip.</li>
	<li>Coloque (consulte Figura 3b) 50 μL de solução de célula de pré-polímero no canal de fluxo usando a microseringa e, em seguida, conecte a saída usando um plugue PDMS. Injete 40 μL extras de solução para criar uma protuberância convexa na membrana circular do PDMS.</li>
	<li>Mova o chip com a fotomáscara (inferior), a microseringa (entrada) e o plugue PDMS (saída) da etapa 4.9 sob uma lâmpada UV (365 nm, 9 mW / cm2) e exponha-o por 30 a 45 s para reticular o hidrogel circular concêntrico na câmara fluídica.</li>
	<li>Remova o plugue PDMS e a microseringa para liberar a pressão do líquido (consulte Figura 3c). Use uma seringa de 1 mL carregada com DPBS pré-aquecido para lavar as resinas não reticuladas 3 vezes, lavando da entrada para a saída.</li>
	<li>Encha o canal de fluxo com cerca de 100 μL de meio de cultura celular.</li>
	<li>Colocar a aparas numa placa de cultura esterilizada e cultivar numa atmosfera de CO2 a 5% a 37 °C durante uma semana. Atualize o meio todos os dias.</li>
	<li>Tire imagens de três chips no dia 0 após 4 h de incubação, como grupo controle, e três chips no dia 3, como conjunto experimental, usando um microscópio com objetiva de 20X. Meça a largura da linha de cada hidrogel da linha 1 à linha 12 usando um software (por exemplo, ImageJ) para calcular as deformações de compressão ( Figura 4). 
	NOTA: A porcentagem de alongamento é calculada dividindo o valor da diferença de largura da linha entre 40 μL e 0 μL pela largura da linha a 40 μL.</li>
</ol>
5. Coloração de células para análise de alinhamento
<ol>
	<li>Use uma seringa para injetar paraformaldeído (PFA) a 4% em DPBS em RT no chip de fluxo por 15 min para a fixação do hidrogel carregado de células. 
	NOTA: Cuidado. O PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.</li>
	<li>Substitua a solução por solução de permeação da membrana celular a 0,5% em DPBS por 10 min para permeabilizar a membrana celular em RT.</li>
	<li>A PBS lava as amostras 3 vezes com intervalo de 5 a 10 minutos entre as lavagens (usando uma seringa carregada, como na etapa 5.1).</li>
	<li>Carregue a solução de BSA a 1% no canal fluídico por 45-60 min em RT (usando uma seringa carregada através da porta de entrada).</li>
	<li>Adicione 1,5 mL de metanol no frasco para injetáveis com Alexa Fluor 488 faloidina para obter uma concentração final de 6,6 μM de solução estoque.</li>
	<li>Pegue 5 μL de faloidina Alexa Fluor 488 da etapa 5.5 e dilua-os em 200 μL de DPBS com 0,1% de BSA para formar uma concentração final de 0,165 μM de faloidina Alexa Fluor 488.</li>
	<li>Adicionar 200 μl da solução da mistura ao canal fluídico com uma micropipeta e incubar a lasca a 37 °C durante 45 a 60 minutos para a coloração com actina. PBS lave (como acima) as amostras 3 vezes.</li>
	<li>Prepare 1 μg / mL DAPI em PBS, flua através do chip e core os núcleos das células a 37 ° C por 5 min.</li>
	<li>Pipetar o DPBS para o canal fluídico para lavar a solução de coloração e encher novamente a câmara fluídica com a solução PBS para obter imagens com um microscópio de fluorescência.</li>
	<li>Capture as imagens fluorescentes das células 3T3 nos hidrogéis usando um microscópio de fluorescência invertida sob ampliação de 40X com um detector CCD e conjuntos de filtros de ex/em a 488/520 nm e 358/461 nm para Alexa Fluor 488 faloidina (actina) e DAPI (núcleo), respectivamente.</li>
</ol>

<ol><li>Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsystems+for+biomimetic+stimulation+of+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells.</a> Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).</li>
<li>Aubin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+3D+cell+alignment+and+elongation+in+microengineered+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels.</a> Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).</li>
<li>Guan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stimulation+of+the+cardiac+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+in+tissue+constructs+that+mimic+myocardium+structure+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics.</a> Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste trabalho, relatamos sobre uma abordagem simples para comparar o comportamento de alinhamento de célula depois de hidrogel forma de orientação e de estiramento elástico. Uma membrana flexível de PDMS cria uma curvatura em forma de cúpula para a geração de diferentes alturas de hidrogel circulares concêntricos. Após liberar a pressão, a membrana PDMS aplica automaticamente a força para a micromodelados de hidrogel para formar o gradiente de tensão/alongamento, com um máximo no centro e um mínimo no limite do exterior...

Servindo como um material do bloco que imita um microambiente nativo, um hidrogel contendo a matriz extracelular (ECM) pode re-construir andaimes de tecido biomimético para apoiar o crescimento de células. Para possuir as funções de um tecido, o alinhamento da célula organizada é um requisito essencial. Vários 2D (isto é, células cultivadas sobre uma superfície) e 3D (i.e., células encapsuladas em um hidrogel) alinhamentos de células que foram alcançados pelo cultivo ou encapsular células em ou em substratos flexíveis com micro- ou nano-padrões1. Alinhamento da célula 3D na microarquitetura é mais atraente, como o microambiente aproxima-se do tecido nativo construção2,3,4. Uma abordagem comum para alinhamento de célula 3D é o cue geométrico de hidrogel forma2,3. Por causa do espaço restrito para proliferação celular na direção do eixo curto, células visam alinhar ao longo da direção do eixo longo em um hidrogel micromodelados. Outra abordagem é aplicar o estiramento elástico para o hidrogel para atingir o alinhamento da célula paralelo à direção de estiramento4,5.
Estimulação biofísica em hidrogel de ECM, tais como tensão compressiva ou um campo elétrico, pode regular funções de células de tecido adequada integração, proliferação e diferenciação1,2,3. Muita pesquisa tem sido feita para investigar o comportamento celular através da aplicação de uma condição de tensão de cada vez usando múltiplo controle mecânico unidades4,6,7,8,9. Por exemplo, o uso de motores de passo mecânico espremido ou esticada sobre um hidrogel de colágeno de célula encapsulada 3D tem sido comum uma abordagem7,10. No entanto, tal equipamento controlador requer espaço extra e enfrenta a questão da contaminação na incubadora7,9,11,12. Além disso, o grande instrumento não pode dar um ambiente de controle preciso para fornecer grande reprodutibilidade13.
Considerando que o hidrogel célula-carregado é normalmente utilizadas na microescala para aplicações biomédicas, é vantajoso combinar técnicas de MEMS para gerar uma gama de tensão/estiramento estimulação para investigar simultaneamente comportamentos de célula em 3D biomimetic construções em vitro2,14,15,16,17,18. Por exemplo, usando a pressão do gás a deformar-se a membrana PDMS em chips microfluídicos pode dar origem a várias cepas, dirigindo a diferenciação celular de linhagens diferentes9,16. No entanto, existem muitos desafios técnicos, tais como processos de fabricação de chip complicado em um quarto limpo e a integração de software controle de motores, bombas, válvulas e gases comprimidos.
Neste trabalho, vamos demonstrar uma abordagem simples para obter um chip de gradiente estático-estirpe microfluidic auto-sustentável, empregando-se um padrão de hidrogel circulares concêntricos e uma membrana flexível de PDMS. Ao contrário da maioria das abordagens existentes, a nossa plataforma é um dispositivo portátil e descartável em miniatura que podem ser fabricados fora um quarto amarelo e que possui a auto-geração de cepas gradientes em hidrogel concêntricos de célula encapsulada, sem equipamentos mecânicos externos durante a incubação. Comportamentos de células de fibroblastos 3T3 influenciaram por uma combinação de hidrogel forma e uma variedade de pistas de orientação estiramento elástico foram demonstradas durante a observação de alinhamento de célula dentro de ambientes 3D de ECM-mimética no chip gradiente de tensão para 3 dias.

<table><tbody><tr><td>Tubo de microcentrífuga preto de 1,5 mL</td><td>Argos Technologies&nbsp;</td><td>03-391-161</td><td>Este pode ser substituído por um tubo de cor neutra de 1,5 mL coberto com folha de alumínio</td></tr><tr><td>10x DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56064C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 faloidina&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A12379&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ponta de prova molecular</td><td>C1430</td> do<td>Calcein</td> de BSA Sigma A1595 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> para rotular o <tr><td>CCD</td><td>PCO das pilhas viáveis. Imagem</td><td>Pixelfly qe</td><td></td></tr><tr><td>Solução de permeação de membrana celular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>0,5% Triton X-100 para permear membrana celular</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>Coloração do núcleo celular</td></tr><tr><td>Membrana de diálise</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9527</td><td>Corte de peso molecular = 14.000</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Fita dupla face</td><td>3M</td><td>8003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>gel strength 300, tipo A, de pele suína</td></tr><tr><td>Gerador de corona eletrônico de alta frequência</td><td>Produtos eletrotécnicos</td><td>MODELO BD-20</td><td></td></tr><tr><td>Anidrido metacrílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685</td><td></td></tr><tr><td>Micro seringa</td><td>Hamilton</td><td>80501</td><td>50 &mu; L&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Inclui dois conjuntos de filtros: LF405 / LP-B-000 e LF488 / LP-C-000 da máquina de plasma de</td></tr><tr><td>oxigênio</td><td>Semrock Plasma</td><td>Harrick PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Para fixação de célula</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>DOW CORNING</td><td>Sylgard 184</td><td>Mistura para fabricação de moldagem por fundição de chips PDMS</td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>iniciador de penicilina / estreptomicina</td></tr><tr><td></td><td>CIBA</td><td>Irgacure 2959</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Para rotular células mortas</td></tr><tr><td>Copo de filtração estéril</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>TMSPMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Para imobilização de hidrogel</td></tr><tr><td>Ultrasonicator</td><td>Delta</td><td>D150H</td><td>150W, 43kHz</td></tr><tr><td>luz UV</td><td>DAIHAN</td><td>WUV-L10</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>FIRSTEK</td><td>150311025</td><td></td></tr><tr><td>NIH3T3 (fibroblasto)</td> <td>Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Indústria de Alimentos (FIRDI)</td> <td>08C0011</td><td></td></tr><tr><td>MOXI Z Mini Contador de Células Automatizado</td><td>ORFLO</td><td>MXZ001</td><td></td></tr></tbody></table>

gradiente de pressão chip para estimulantes comportamentos celulares em hidrogel de célula-carregado

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Orientação artificial para alinhamento celular é um tema quente no campo da engenharia de tecidos. A maioria da pesquisa anterior investigou único alinhamento celular induzida por tensão em um hidrogel célula carregada por meio de complexos processos experimentais e massa em sistemas de controlo, que são normalmente associados com problemas de contaminação. Assim, neste artigo, propomos uma abordagem simples para a construção de uma estirpe de estática gradiente usando um chip fluídico com uma tampa plástica de PDMS e um substrato de vidro transparente de UV para a estimulação do comportamento celular em um hidrogel 3D. Pré-polímero de célula foto-patternable sobrecarga na câmara fluídico pode gerar uma membrana PDMS curva convexa na capa. Após a reticulação de UV, através de um micropattern circular concêntrico sob a membrana PDMS curvada e tampão de lavagem, um microambiente para investigar célula comportamentos sob uma variedade de cepas de gradientes é self estabelecida em um único chip fluídico, sem instrumentos externos. NIH3T3 células foram demonstradas após observar a mudança da tendência de alinhamento celular sob orientação de geometria, em cooperação com a estimulação de estirpe, que variou entre 15-65% no hidrogel. Após uma incubação de 3 dias, a geometria de hidrogel dominou o alinhamento da célula sob baixa tensão compressiva, onde células alinhadas ao longo da direção de alongamento de hidrogel sob alta tensão compressiva. Entre estas, as células mostraram alinhamento aleatório devido a dissipação da orientação radical de alongamento de hidrogel e a orientação de geometria do hidrogel estampado.

Para comparar as variações mecânicas entre cada hidrogel circular no chip estimulação concluído gradiente de tensão, medimos as larguras de linha de cada hidrogel circular em dois dos chips mesmos, com volumes de injeção de 0 µ l (figura 4a) e 40 µ l (figura 4b), respectivamente. Os alongamentos por cento em cada círculo foram calculados dividindo os alongamentos no chip 40 µ l-injetado pelas larguras de linha do hidrogel corresp...

Este artigo apresenta uma abordagem simples para fornecer não-contínuo gradientes cepas estáticas em um hidrogel de célula-carregado concêntrico para regular o alinhamento da célula para a engenharia de tecidos.

Gradiente de pressão Chip para estimulantes comportamentos celulares em hidrogel de célula-carregado

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

O objetivo geral deste chip de deformação gradiente é fornecer uma abordagem simples para gerar deformações estáticas de gradiente não contínuo em um hidrogel 3D para a investigação do comportamento celular sob uma série de condições de deformação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da bioengenharia, como os estímulos de uma diferenciação de células-tronco e a regulação do alinhamento celular para o desenvolvimento de órgãos de tecidos artificiais. A principal vantagem desta técnica é que várias cepas podem ser aplicadas na camada celular e hidrogéis no mesmo microambiente para comparação do comportamento celular.A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de preparação do chip são difíceis de aprender, pois a luz deve ser concluída em três a quatro horas para que a base do experimento garanta alta variabilidade celular. Pese 10 gramas de gelatina em pó e adicione-o a um frasco de vidro com 100 mililitros de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, ou DPBS. Coloque uma barra de agitação magnética no frasco e coloque-o em uma placa quente de agitação.Cubra o frasco com papel alumínio para evitar a evaporação da água. Defina a temperatura da placa quente para 50 a 60 graus e o agitador a 100 RPM por uma hora para dissolver a gelatina em pó. Depois que a gelatina se dissolver, adicione oito mililitros de anidrido metacrílico muito lentamente usando uma pipeta.Deixe reagir a 60 graus Celsius por três horas. Em seguida, adicionar o DPBS pré-aquecido ao balão até obter um volume final de 500 ml. Deixe a solução misturar bem por 15 minutos para interromper a reação.Enquanto isso, corte uma membrana de diálise em vários tubos de 25 milímetros de comprimento. Mergulhe-os em água deionizada por 15 minutos. E faça um nó para fechar uma extremidade dos tubos de diálise.Carregue a quantidade apropriada da solução de polímero nos tubos de diálise e feche a outra extremidade. Em seguida, coloque os tubos cheios em um copo de plástico de cinco litros com água deionizada por uma semana. Renove a água deionizada duas vezes ao dia e mantenha a solução a 40 a 50 graus Celsius durante o processo de diálise.Após a diálise, colete a solução dos tubos em um frasco de vidro de 500 mililitros. Despeje aproximadamente 450 a 500 mililitros de solução em um copo de filtro de 500 mililitros. E aplique um vácuo para forçar a solução a passar pela membrana do filtro para esterilização.Em seguida, transfira o polímero esterilizado para vários tubos esterilizados de 50 mililitros. Transfira o polímero esterilizado para vários tubos esterilizados de 50 mililitros e armazene-os em um freezer de 80 graus Celsius negativos por três a cinco dias. Liofilize o polímero de 80 graus Celsius negativos por uma semana usando um liofilizador para formar GelMA, que pode ser armazenado em um freezer de 80 graus Celsius negativos.Para a fabricação do chip, primeiro prepare o polimetacrilato ou PMMA, tocado e moldado conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, prepare a tampa PTMS e o plugue PTMS misturando adequadamente 30 gramas de elastômero PTMS e três gramas de agente de cura PTMS. Desgaseifique a mistura em uma câmara de vácuo por uma hora.Moldar 1,8 a dois gramas da mistura no molde de PMMA para a tampa PTMS. Use também a quantidade apropriada para preencher cada cavidade do molde de PMMA para o plugue PTMS. Além disso, funda 10 gramas de mistura PTMS não curada em uma placa de plástico em branco de 10 centímetros.Coloque esses moldes em uma câmara de vácuo para desgaseificar por 30 minutos. Cure o PTMS por duas horas a 80 graus Celsius. Depois de resfriar o PTMS curado no molde, solte as tampas PTMS e os plugues PTMS dos moldes de PMMA.Em seguida, faça dois furos com diâmetros de cerca de três milímetros nas extremidades dos canais de fluxo das tampas PTMS. Corte a folha PTMS moldada da placa de plástico de 10 centímetros em muitos cubos de um centímetro por um centímetro. E faça um furo de três milímetros em cada cubo PTMS.Cole dois cubos PTMS não curados de um centímetro por um centímetro nas aberturas da tampa PTMS para servir como reservatórios médios e para auxiliar no processo de cura dos padrões de hidrogel circular gradiente. Em seguida, catalise por uma hora a 80 graus Celsius. Em seguida, cole as tampas PTMS com os dois reservatórios PTMS em uma lâmina revestida com TMSPMA.Para fazer isso, pré-trate o lado de colagem da tampa PTMS e a lâmina revestida com TMSPMA sob uma máquina de plasma de oxigênio por 90 segundos de tratamento com plasma de oxigênio. Entre em contato com a superfície tratada com plasma das tampas PTMS e da lâmina TMSPMA e pressione-as de perto para uma ligação permanente através da formação da ligação silício oxigênio silício. Imprima uma fotomáscara imprimindo o layout estabelecido em um filme transparente.Em seguida, corte a fotomáscara impressa em 25 milímetros por 37,5 milímetros de tamanho. Pese 25 miligramas de GelMA liofilizado em 0,3 mililitros de meio de cultura de células pré-aquecido em um tubo de microcentrífuga preto de 1,5 mililitro. Coloque o tubo de microcentrífuga em uma placa quente do agitador de laboratório até que o GelMA se dissolva no meio.Adicione 50 miligramas de fotoiniciador a um mililitro de DPBS em um tubo de microcentrífuga. E coloque-o em um forno a 80 graus Celsius por 15 minutos ou até que o fotoiniciador se dissolva. Adicione 25 microlitros do fotoiniciador de 10% ao tubo da microcentrífuga.Pipete várias vezes para misturar bem. Em seguida, conte três milhões de células NIH3T3 usando um contador de células automatizado. Após centrifugar a suspensão a 200 Gs durante cinco minutos, rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 175 microlitros de meio de cultura celular.Adicione a solução celular ao tubo de microcentrífuga para obter uma solução de célula pré-polímero de 5% GelMA, 0,5% fotoiniciador e cerca de seis milhões de células 3T3 por mililitro. Após a mistura, carregue 100 microlitros de pré-polímero celular em uma microsseringa de 100 microlitros. Alinhe manualmente um pedaço da fotomáscara na lâmina inferior do chip de cepa gradiente esterilizado.E simplesmente fixe a posição usando uma pequena gota de água deionizada no meio. Conecte a microsseringa de 100 microlitros, carregada com solução de célula de pré-polímero, à entrada do chip. Em seguida, coloque 50 microlitros de solução de célula de pré-polímero no canal de fluxo usando a microsseringa e tampe a saída usando um plugue PTMS.Injete 40 microlitros extras de solução para criar uma protuberância convexa na membrana PTMS circular. Mova o chip com a fotomáscara, a microsseringa e o plugue PTMS para baixo de uma lâmpada UV. E exponha por 30 a 45 segundos para reticular o hidrogel circular concêntrico na câmara fluídica.Após a reticulação, remova o plugue PTMS e a microsseringa para liberar a pressão do líquido. Use uma seringa de um mililitro carregada com DPBS pré-aquecido para lavar as resinas não reticuladas três vezes, lavando da entrada para a saída. Em seguida, encha o canal de fluxo com cerca de 100 microlitros de meio de cultura de células.Coloque o chip em um prato de cultura esterilizado e cultive em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma semana. Atualize o meio todos os dias. Tire imagens de três chips no dia zero após quatro horas de incubação como o grupo de controle.E três chips no terceiro dia como o conjunto experimental usando um microscópio com uma objetiva de 20 vezes. Meça a largura da linha de cada hidrogel da linha um à linha 12 usando um software para calcular as manchas de compressão. Aqui são mostrados resultados representativos de padrões de hidrogel com zero microlitro e 40 microlitros sobre injeção, após reticulação UV e incubação de quatro horas.A largura da linha do hidrogel 3D no controle de injeção não excessiva parece uniforme conforme o esperado. No entanto, os padrões de hidrogel com 40 microlitros sobre injeção fornecem uma largura de linha gradiente de hidrogéis diminuindo da linha um para a linha 12. Após três dias de incubação, as células do hidrogel se estendem em direções diferentes.As células da linha um se alinham ao longo da direção radial devido à estimulação do alongamento do hidrogel. Pelo contrário, as células da linha 12 se alinham ao longo da forma de hidrogel, onde a sugestão da geometria domina o alinhamento celular. Não há alinhamento celular específico na linha 7, onde as duas pistas de alinhamento celular da linha um e da linha 12 se equilibram.Uma vez que a medição do microambiente de cepas de gradiente em hidrogel 3D pode ser feita pelo chip de deformação de gradiente em duas horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de esterilizar o chip de deformação gradiente antes de carregar a solução de pré-polímero celular. Limpe também bem a superfície do chip com etanol 75% antes de colocá-los na incubadora de cultura de células.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão muito boa de como gerar um chip de deformação gradiente para investigar o comportamento das células sob diferentes cepas imperiais.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós descrevemos um protocolo para a microfabricação do dispositivo de geração de gradiente microfluídicos que pode gerar gradientes espaciais e temporais bem definidos em microambiente. Nesta abordagem, o dispositivo de geração de gradiente microfluídicos pode ser usado para estudar a migração celular dirigido, a embriogênese, cicatrização de feridas, e metástase de câncer.

Um dispositivo de geração de Gradient microfluídicos de Biologia Celular

Neste protocolo, demonstramos a fabricação de uma matriz microactuator de posts verticalmente deslocadas em que a tecnologia é baseada, e como essa tecnologia base pode ser modificado para conduzir alto rendimento de cultura de células mecanicamente dinâmica em ambos cultura bidimensional e tridimensional paradigmas.

Plataformas microfabricated para cultura de células mecanicamente dinâmico

A biossíntese da matriz extracelular cartilaginosa por condrócitos podem ser afectadas pela aplicação de estímulos mecânicos. Este método descreve a técnica de aplicação de dinâmicas tensões compressivas para condrócitos encapsulados em construções em 3D e de avaliação de alterações induzidas no metabolismo dos condrócitos.

A estimulação mecânica de condrócitos-agarose Hidrogéis

Dispositivos microfabricados integrados com componentes fluídicos fornecem uma plataforma in vitro para estudos celulares que imitam o microambiente in vivo. Desenvolvemos chips microfluídicos à base de polimetilmetacrilato para estudar as respostas celulares sob estímulos de estresse químico/elétrico/de cisalhamento únicos ou coexistentes.

Projetando microfluídicos para Estudar respostas celulares Sob único ou coexistindo Chemical / Elétrica / tensão de cisalhamento Estímulos

As forças mecânicas são importantes para controlar a migração celular. Este protocolo demonstra o uso de hidrogéis elásticos que podem ser deformados usando uma micropipeta de vidro e um micromanipulador para estimular as células com um gradiente de rigidez local para provocar mudanças na estrutura celular e migração.

Ensaio de Durotaxis de célula única para avaliar o controle mecânico do movimento celular e eventos de sinalização relacionados

O método apresentado envolve alongamento uniaxial de hidrogéis macios 3D embutidos na borracha de silicone, permitindo microscopia confocal ao vivo. Demonstra-se a caracterização das cepas de hidrogel externos e internos, bem como o alinhamento de fibras. O dispositivo e o protocolo desenvolvidos podem avaliar a resposta das células a vários regimes de tensão.

Tensão controlada de hidrogéis 3D sob imagem de microscopia ao vivo

Aqui, fornecemos um chip microfluido e um sistema microfluido de circulação de circulação automaticamente controlado e altamente eficiente que recapitula o microambiente inicial da neovascularização, permitindo que as células endoteliais (CE) sejam estimuladas pelo alto estresse da cisalhamento luminal, nível fisiológico de fluxo transendelial e distribuição de vários fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) simultaneamente.

Modelo microfluido para imitar evento inicial de neovascularização

Descrevemos melhorias em um método padrão para medir forças de tração celular, baseado na impressão de microcontatos com uma única etapa de padronização subtrativa de matrizes de pontos de proteínas de matriz extracelular em hidrogéis macios. Este método permite uma fabricação mais simples e consistente dos padrões da ilha, essenciais para controlar a forma do aglomerado celular.

Geração de Padrões para Microscopia de Tração de Micropattern

O presente protocolo descreve uma plataforma experimental para avaliar os efeitos de pistas mecânicas e bioquímicas sobre as respostas quimioterápicas de células glioblastoma derivadas pelo paciente em culturas mímicas de matriz 3D usando um dispositivo de iluminação UV feito sob medida facilitando o fotocrosslinking de alto rendimento de hidrogéis com características mecânicas incompáveis.

Matrizes de hidrogel permitem aumento de rendimento para efeitos de triagem de componentes matriciais e terapêuticos em modelos de tumor 3D

Descrevemos o isolamento de cardiomiócitos neonatal e na preparação das células para encapsulamento em construções de hidrogel de fibrina para engenharia de tecidos. Descrevemos métodos para analisar a engenharia de tecidos do miocárdio após o período de cultura, incluindo a força ativa gerada com a estimulação elétrica e viabilidade celular e coloração imuno.

Encapsulamento de Cardiomyocytes em um hidrogel de fibrina para engenharia de tecidos cardíacos

Aprenda a criar um chip de deformação gradiente para investigar comportamentos celulares em hidrogéis carregados com células. Este método permite aplicar tensões estáticas variadas em microambientes consistentes para engenharia de tecidos.

Gradiente de pressão Chip para estimulantes comportamentos celulares em hidrogel de célula-carregado

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