Gradiente de densidade de várias camadas de polimerização (DGMP): uma nova técnica para a criação de multi-compartimento, Andaimes customizáveis ​​para Engenharia de Tecidos

O objetivo geral deste procedimento é criar um andaime de cultura de células em várias camadas. Este vídeo demonstrará como produzir uma matriz de cultura de células 2D, incorporando o peptídeo de adesão RGDS em camadas alternadas para separar regiões de C e duas células C 12. Isso é feito primeiro amarrando o peptídeo RGDS a uma macro acro leal.

A combinação de macropeptídeos é então marcada com o corante LOR para permitir a visualização do peptídeo contendo camadas dos géis multicamadas. O segundo passo é formar os moldes cortando-os de uma folha de silicone e imprensando-os entre duas lâminas de vidro logo após o pré-impressão, misturando componentes individuais de cada camada. Soluções de peg di acrl e peg di acrl com PEG RGDS Alexa três 50 são alternativamente colocadas em camadas dentro dos moldes.

Os géis são polimerizados por irradiação UV. A etapa final é semear C duas células C 12 em géis multicamadas 2D para examinar como a composição da matriz afeta o crescimento e a fixação das células. Em última análise, a microscopia de campo claro e fluorescência é usada para visualizar o crescimento seletivo de C duas células C 12 nos andaimes.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que é um método simples e econômico para criar matrizes de cultura de células 2D e 3D de várias camadas. Não depende da necessidade de instrumentação cara. Enquanto as interfaces entre as camadas são contíguas e estruturalmente integrais.

Não há mistura entre componentes de camadas individuais. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave, como como as células migram e polarizam em resposta a pistas biológicas, químicas e mecânicas padronizadas. Este método pode fornecer uma visão suave sobre a migração e diferenciação celular e pode ser aplicado a outros sistemas, como direcionar o crescimento e a sinaptogênese de células-tronco neuronais.

Para iniciar este procedimento, combine o peptídeo RGDS e o éster metílico de succinil carbo de óleo acro em uma proporção molar de um para dois para um em DMSO seco sob Argonne. Em seguida, adicione NN diop, propilmetilamina ou D-I-P-E-A a uma proporção molar de dois para um em relação ao aquilo PEG SCM para ajudar a facilitar a reação, confirme a conjugação da molécula de aquilo PEG RGDS usando espectrometria de massa TOF mofada. Para isso separadamente, adicione um microlitro da solução de reação AQUILO PEG RGDS e um microlitro de ONG não reativo

Deixe os dois secarem. Em seguida, prepare uma solução saturada de matriz mofada universal em vórtice THF por um minuto e adicione um microlitro aos mesmos dois pontos. Deixe os dois secarem.

Em seguida, carregue as amostras. Realize análises resistentes e mofadas com um laser de 60 hertz a aproximadamente 19% de potência usando os algoritmos SAVIS gole smoothing, top hat, baseline subtraction e OID peak detection. O peso molecular do acro PEG RGDS deve ser deslocado para a direita, correspondendo à mudança na massa devido ao peptídeo ligado covalentemente.

O próximo passo é conjugar o Fluor adicionando uma quantidade equimolar de LOR três ácido carboxílico 50 suga em um éster médio em relação ao aquilo PEG SCM dissolvido em um volume mínimo de DMSO à solução de reação aquilo PEG RGDS Sob argônio incubar durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, purifique o pino de óleo acro RGD S3 50 dialisando contra água de corante a quatro graus Celsius usando um de diálise de corte de peso molecular de 3.500 DAU. Continue dialisando por 48 horas usando uma proporção volumétrica de 1001, trocando o dialisado frio pelo menos duas vezes por dia.

O produto é ainda purificado por esterilização por filtro através de filtro de seringa de 0,22 mícron. Finalmente, em um ambiente estéril, alíquota do pino de óleo acro purificado estéril RGD S3 50 em tubos de microcentrífuga pré-pesados estéreis. Sele os tubos de microcentrífuga abertos dentro do tubo de respiro estéril.

Liofilize as amostras e armazene cada uma selada com filme de parafina a menos 20 graus Celsius. A pré-lavagem é feita em 100% de metanol e seca no forno a 80 graus Celsius até que o líquido evapore. Em seguida, coloque um prato contendo as lâminas de vidro em uma capela e adicione 250 microlitros de camada sigma a cada lâmina.

Balance suavemente as lâminas por 30 segundos para revestir toda a superfície. Em seguida, enxágue bem as lâminas revestidas com 100% de metanol, seguido de lavagem e água destilada, mergulhando-as duas vezes por cinco minutos em pelo menos 10 mililitros de água. Depois de enxaguadas, deixe as lâminas secarem ao ar.

Prepare espaços de silicone de 0,8 milímetro de espessura aparando uma folha de silicone nas mesmas dimensões das lâminas de vidro. Em seguida, usando punções de biópsia, faça furos de 10 milímetros ou oito milímetros no silicone para segurar os andaimes usando uma lâmina de barbear. Faça canais de cerca de dois milímetros na parte superior do molde para permitir a adição do material do andaime.

Em seguida, autoclave os espaços de silicone e as lâminas de vidro tratadas com revestimento sigma para esterilizá-los. Esterilize também materiais adicionais para fundir os géis, como tubos einor e pinças. Em um filtro de capuz de cultura de tecidos, esterilize uma solução estoque de Peg di aquil usando uma seringa estéril de um mililitro e um filtro de 0,2 mícron.

Comece formulando soluções de pré-polímero PEG na proporção de 15% peso / volume para cada camada respectiva em tubos de micro recusa âmbar individuais, combinando o acrl 50% PEG D com diferentes quantidades de solução estoque estéril 60% IO DAL PBS e iniciador fotográfico para produzir concentrações finais variáveis de 10% 20% 30% e 40% I oal misture completamente as soluções para preparar a solução pré-polímero 15% PEG marcada com fluorescência, combine 50%PEG di aquil e aquilo PEG RGD S3 50 a uma concentração final de oito milimolares com solução estoque IO Dal PBS e fotoiniciador em tubos Microview âmbar para produzir concentrações de 15%25%e 35%IO IAL misture bem as soluções. Em seguida, monte o molde colocado Depois que o molde estiver montado, molde um gel em camadas adicionando 10 microlitros da solução a 40% primeiro, seguido por 10 microlitros da solução a 35% marcada com fluorescência.

Repita as camadas alternadas para obter várias camadas. Em seguida, irradie o molde com luz de 365 nanômetros por três minutos. Usando uma lâmpada portátil UVR 9.000, deixe os hidrogéis polimerizados curarem por cinco minutos.

Em seguida, remova os grampos e levante suavemente a corrediça de vidro superior e o molde. O gradiente de densidade estratificado. A polimerização multi-aplicada ou os géis DG MP permanecerão nas lâminas.

Usando uma espátula estéril, remova cuidadosamente os géis do molde e coloque-os em um tubo de 50 mililitros contendo DMEM estéril. Lave os géis polimerizados usando uma proporção volumétrica de 1000 para um de DMEM por 48 horas com duas trocas de tampão por dia. Isso removerá qualquer densidade, modificador, fotoiniciador e pré-polímero de reação.

Em seguida, armazene os géis DGMP em DMEM suplementado com 1% de penicilina estreptomicina. Para visualizar camadas alternadas, organize o gel DGMP ao longo de uma régua na bandeja de amostra de uma unidade de documentação de gel. Em seguida, exponha e fotografe os géis usando Alexa, três 50 bandas escuras e azuis alternadas no hidrogel DGMP demonstram a formação de camadas discretas de composição química distinta.

Para preparar os géis DGMP para cultura de células, insira-os suavemente nos poços de uma placa de cultura de células de 48 poços. Usando um raspador de células estéreis e enxágue três vezes em meio de cultura de células. Em seguida, colha C dois mioblastos C 12 de uma placa de cultura de células de 100 milímetros quando estiverem 60% confluentes.

Para fazer isso, enxágue a placa três vezes com PBS pré-aquecido. Em seguida, adicione um mililitro de 0,25% de viagens em EDTA e incube a placa a 37 graus Celsius por dois minutos. Uma vez que as células tenham se desprendido, adicione um mililitro de meio de cultura pré-aquecido e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros para centrifugação.

Depois que as células forem peletizadas, Pinte-as em meio de crescimento e conte as células vivas adicionando azul triam e usando um contador de células TC 10. Em seguida, semeie o andaime DG MP com C dois C 12 mioblastos e incube por 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Confirme a ligação de C dois mioblastos C 12 no RGDS contendo camadas de géis DGMP usando epifluorescência e microscopia de contraste de fase.

As camadas alternadas de géis DGMP podem conter vários peptídeos, como o RGDS mostrado à direita, que suporta a ligação e o crescimento celular. A camada à esquerda, no entanto, não continha nenhum peptídeo de ligação celular e as células não sobreviveram nessa região. IO diol pode afetar a rigidez do gel.

Aqui, o módulo de elasticidade foi medido usando microscopia de força atômica. Um aumento de 60% na rigidez foi observado ao usar 30% IAL nesta formulação de gel, o efeito IAL na rigidez do gel pode variar de acordo com os materiais usados Ao tentar este procedimento, é importante lembrar a sequência das camadas. A camada que contém a maior quantidade de IEX nulo estará na parte inferior, enquanto a camada com a menor quantidade de IEX nulo estará na parte superior.

Lembre-se sempre de adicionar o iniciador de fotos no final para evitar a polimerização da luz ambiente. Com nossos colaboradores, estamos adaptando essa técnica para organizar o crescimento de neuritos em 3D. Isso permitirá comparações de células neuroprogenitoras derivadas de indivíduos saudáveis e de pacientes com distúrbios do neurodesenvolvimento.

Não se esqueça de que trabalhar com luz ultravioleta pode ser perigoso. Use óculos de proteção UV ao executar a etapa de reticulação.