Name: Gradiente de densidade de várias camadas de polimerização (DGMP): uma nova técnica para a criação de multi-compartimento, Andaimes customizáveis para Engenharia de Tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Aprenda a criar andaimes multicamadas para cultura celular usando polimerização por UV com gradiente de densidade. Esta técnica simples e econômica permite estudar migração e diferenciação celular sem equipamentos caros.

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Os autores agradecem o apoio de novos prêmios NIH Director Innovator (1DP2 OD006499-01 a AA e 1DP2 OD006460-01 a AJE), e Abdulaziz King City para a Ciência e Tecnologia (UC San Diego Centro de Excelência em Nanomedicina). Gostaríamos de agradecer a Sra. Jessica Moore por seus comentários críticos sobre o manuscrito.

1. Síntese de acriloílo marcado por fluorescência-PEG-RGDS <ol><li> Reagir o péptido RGDS com éster carboximetil acriloil-PEG-succinimidil (APEG-SCM, PEG MW: 3400 g / mol) e di-isopropiletilamina NN (DIPEA) em razões molares 1.2:1:2 em sulfóxido de dimetilo (DMSO) sob atmosfera de árgon à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Confirmar conjugação por laser assistida por matriz tempo de dessorção / ionização de voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa. Adicionar 1 ml de APEG-RGDS solução de reacção a uma mancha de amostra no alvo MALDI e seco. Prepara-se uma solução saturada de Universal MALDI Matrix em tetra-hidrofurano (THF) e agitar em vortex durante 1 min. Adicionar ~ pi 1 desta solução à mancha mesma amostra. Repita o procedimento para APEG-SCM para comparação. Carregar e analisar. O peso molecular de APEG-RGDS deve ser superior a APEG-SCM (Figura 2). </li><li> Para conjugar o fluoróforo, adicionar uma quantidade equimolar de Alexa Fluor 350 carboxílico (éster succinimydyl), dissolvidosnum volume mínimo de DMSO, a solução de reacção APEG-RGDS de 1,1 e reagir sob atmosfera de árgon à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Purificar APEG-RGDS-350 por diálise (PM 3500 Da) contra DI O 2-H, a 4 ° C, durante 48 horas à razão volumétrica 1.000:1, trocando dialisado pelo menos duas vezes por dia. </li><li> Congelar a secar purificado APEG-350-RGDS em um Labconco Freezone Plus ou sistema equivalente congelamento seco e armazenar a -20 ° C. </li></ol> 2. Preparação de um Molde de 2D e fabricação de um gel 2D com PEG-350 RGDS alternada Camadas <ol><li> Preparar lâminas de vidro hidrofóbicas. Colocar as lâminas de vidro limpas em um prato de vidro num forno de vácuo. Aquecer a 80 ° C durante 30 minutos para secar completamente as superfícies. Lugar prato com lâminas em um exaustor e adicionar 250 ul Sigmacote a cada slide, balançando suavemente por 30 segundos para a superfície revestimento inteiro. Enxaguar bem as lâminas revestidas com 100% de metanol, seguido de lavagem em água destilada, duas vezes por imersão durante 5 minutos em em least de 10 ml. </li><li> Cortar espaçadores de silicone (0,8 mm de espessura), com 10 milímetros de biópsia perfuradores. </li><li> Autoclavar os espaçadores de silicone e slides Sigmacote tratados com vidro. </li><li> Formular soluções para cada respectiva camada, em tubos de microcentrífuga individuais, de mistura de PEG diacrilato (PEGda) precursor (concentração final de 15% w / v) com quantidades diferentes de iodixanol (solução-mãe a 60% em água), para se obterem diferentes concentrações finais (por exemplo, 40%, 30%, 20% e 10%), completando o volume restante com tampão fosfato salino (PBS) para obter soluções de densidades calibradas. De uma maneira semelhante, por camadas alternadas, mistura APEG-RGDS-350 (concentração final de 8 mM) com PBS e iodixanol, para se obter várias concentrações (por exemplo, 35%, 25% e 15%). </li><li> Adicionar fotoiniciador (2-hidroxi-4&#39;-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona, estoque 333mg/ml em N-vinil-pirrolidona) a cada solução por várias camadas (10 ul de solução de reserva por ml de cada solução de camada). Fotoiniciador is adicionados no final para evitar a polimerização antes estratificação dos géis no molde, uma vez que é sensível à luz. </li><li> Etapas subseqüentes deste protocolo será realizado em uma cabine de segurança biológica para assegurar a esterilidade. </li><li> Filtra-esterilizar cada solução utilizando uma seringa estéril ml e um filtro de 0,2 um. Montar a configuração do molde por ensanduichando o espaçador entre duas lâminas de vidro tratadas com Sigmacore e seguras com grampos colocação, conforme ilustrado na Figura 1. </li><li> Converter os géis em camadas, adicionando a solução mais denso (por exemplo PEGda com iodixanol 40%) em primeiro lugar, seguido por uma solução de menor densidade (por exemplo, APEG-RGDS-350 com iodixanol 35%). Repita as camadas alternadas de atingir várias camadas de composição desejada e densidades, como mostrado na Figura 1. </li><li> Irradiar o molde com luz de 365 nm, durante 3 min usando um portátil UVR-9000 da lâmpada. Permitir que os géis polimerizados curar durante 5 min. Remova os grampos, em seguida, levantar delicadamente a parte superior de vidroslides e do molde, os géis dGMP estratificadas permanecerá nos slides. Usando uma espátula estéril, colocar cuidadosamente os géis em tubo de 50 ml de PBS estéril contendo meio de cultura ou para a lavagem. </li><li> Lavar os géis polimerizados em PBS a 1.000:1 razão volumétrica, a troca de tampão de pelo menos duas vezes por dia, para remover o modificador de densidade, fotoiniciador, e um polímero que não reagiu. Alternativamente, PBS pode ser trocado com meio de crescimento celular. Armazenar os géis dGMP em PBS ou meio de crescimento para a cultura de células de ensaio descrito no Passo 3. </li><li> Para visualizar camadas alternadas, organizar DGMP gel (esses géis não poderá ser usado para cultura de células) ao longo de uma régua na bandeja de amostra de uma unidade de documentação de gel VersaDoc. Expor o gel em 350 nm, o tempo de exposição pode variar, dependendo da concentração do fluoróforo. Alternando bandas escuras e azul no hidrogel DGMP demonstrar a formação de camadas discretas da composição química diferente (Figura 3). </li></ol><ol><li> Para geles incorporando péptido RGDS, utilização de células dependentes da aderência, tais como mioblastos C2C12. </li><li> Insira cuidadosamente géis dGMP (armazenadas em PBS) nas cavidades de placas de 48 poços de cultura de células, utilizando um raspador de células estéril numa câmara de biossegurança. </li><li> Pré-aquecer o meio de crescimento (meio de Dulbecco modificado por Eagle ou DMEM suplementado com 10% v / v de soro fetal de bovino e de v / v de 1% 100x solução de penicilina-estreptomicina) e PBS num banho de água regulado a 37 ° C. </li><li> Lavar a placa de 60% confluentes (10 mm) de células C2C12 três vezes com PBS. Aspirar PBS e as células de colheita por adição de 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA e incubado a 37 ° C durante 2 min. Ressuspender as células em meio de crescimento e células de contagem. Semente da DGMP gel contendo a cultura de células bem com mioblastos C2C12 (20.000 células / cm 2). Incubar as células a 37 ° C em 5% CO2 / 95% de humidade relativa. Gentilmente meio de troca, após 4 horas, cuidado para não voltarmover levemente células aderidas. </li><li> Após 24 h, a fixação de mioblastos C2C12 sobre as camadas que contêm RGDS de géis dGMP pode ser confirmado por epifluorescência e microscopia de contraste de fase (Zeiss Axiovert 200). </li></ol>

<ol><li>Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+in+biomaterials+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Complexity in biomaterials for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).</li>
<li>Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein+and+cell+adhesivity+using+PEO-terminated+triblock+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers.</a> J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).</li>
<li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+zonal+organization+into+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage.</a> Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).</li>
<li>Hahn, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+patterning+of+polyethylene+glycol+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels.</a> Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).</li>
<li>Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+formation+of+covalently+bonded+hydrogel+multilayers+through+surface+initiated+photopolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization.</a> Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).</li>
<li>Harley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+multiphase+osteochondral+scaffold.+II.+Fabrication+of+a+mineralized+collagen-glycosaminoglycan+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).</li>
<li>Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+microfluidic+PEGDA+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Multilayer microfluidic PEGDA hydrogels.</a> Biomaterials. 31, 5491-5497 (2010).</li>
<li>Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+protein+concentration+gradients+mediated+by+density+differences+of+poly%28ethylene+glycol%29+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres.</a> Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).</li>
<li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+properties+of+laminated+alginate+gels+for+tissue+engineering+of+layered+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).</li>
<li>Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+gradient+multilayer+polymerization+for+creating+complex+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue.</a> Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).</li>
<li>Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+attachment+activity+of+fibronectin+can+be+duplicated+by+small+synthetic+fragments+of+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule.</a> Nature. 309, 30-33 (1984).</li>
<li>Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+Situ+Mechanical+Analysis+of+Myofibrillar+Perturbation+and+Aging+on+Soft%2C+Bilayered+Drosophila+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)"> In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium.</a> Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesses para divulgar.

DGMP é uma estratégia simples para a preparação de geles de várias camadas que não contam com a instrumentação dispendiosa. Este protocolo pode ser adaptado para a criação de andaimes que utilizam outros materiais biocompatíveis, como o colagénio e ácido hialurónico. Pequenas moléculas bioactivas, por exemplo a promoção de adesão celular de péptidos RGDS, pode ser amarrado à matriz polimérica para impedir a mistura de sinais entre as camadas. As proteínas podem ser encapsuladas em camadas distintas, sem a necessidade de conjugação química à medida que, dependendo do tamanho da malha da matriz, são menos propensas a se difundir através hidrogéis 10. Aqui foi utilizado iodixanol (Nycoprep), um modificador de densidade inerte, que tenha sido previamente utilizado para aplicações de células viáveis. Outros modificadores da densidade tais como a sacarose e dextrose pode também ser usado. Ao variar o tempo de sedimentação (t s), pode-se ajustar as interfaces entre duas camadas para produzir transições suaves ou afiado como necessário (tempo de sedimentação dá transições mais suaves) &lt;sup&gt; 10. Por exemplo, as transições suaves entre as camadas de gel dGMP poderia ser usado para gerar um gradiente contínuo de um sinal biológico para estudar processos celulares, tais como a quimiotaxia. O efeito do modificador de densidade na rigidez do gel é apresentado na Figura 5 para um 15% aPEGda gel; uma caracterização mais completa de rigidez e porosidade como uma função da concentração de iodixanol PEGda e está actualmente a ser avaliada. Embora a concentração PEGda neste exemplo é relativamente alta, observou-se um módulo de elasticidade de 60% maior do elástico em géis com iodixanol 30% em relação aos géis sem. A alteração na rigidez de gel pode ser ajustada para a concentração por modulação de macrómero a densidade de reticulação ou. Temos também aplicada a técnica de criar DGMP 3D utilizando géis de poliacrilamida de multicamadas e de precursores de PEG 10. Variando a concentração ou do grau de reticulação do polímero permite a variação estrutural noandaimes, os quais podem ser usados ​​para investigar o comportamento de células, tais como o crescimento e migração polarizada em 3D. Em resumo, DGMP é uma técnica flexível que pode ser aplicado para o fabrico de andaimes de 2D e 3D a partir de uma variedade de materiais biocompatíveis para uma ampla gama de aplicações de pesquisa biomédica e básica.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente ou Instrumento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Polietileno glicol succinimydyl carboximetilcelulose (a-PEG-SCM) </td><td> Laysan </td><td> 120-64 </td></tr><tr><td> Polyethelyene glicol diacrilato (PEGda) </td><td> Dajac Labs </td><td> 9359 </td></tr><tr><td> Arginina-glicina-ácido aspártico-serina (RGDS) </td><td> American Peptide </td><td> 49-01-4 </td></tr><tr><td> N, N - diisopropiletilamina (DIPEA) </td><td> Sigma </td><td> D125806 </td></tr><tr><td> Dimetil-sulfóxido (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2438 </td></tr><tr><td> N, N-dimetilformamida (DMF) </td><td> Pescador </td><td> D119-4 </td></tr><tr><td> Tetrahidrofurano (THF) </td><td> Pescador </td><td> T397 </td></tr><tr><td> Cassete de diálise (3500Da) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66330 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 350 carboxílico succinimydyl </td><td> Life Technologies </td><td> A-10168 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma </td><td> SL2 </td></tr><tr><td> Espaçadores de silicone </td><td> Grainger </td><td> 1MWA4 </td></tr><tr><td> Biópsia socos </td><td> Acuderm </td><td> P1025 (10 mm) P850 (8 mm) </td></tr><tr><td> Fosfato de Dulbecco tamponado salino (DPBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30028 </td></tr><tr><td> Iodixanol (NycoPrep) </td><td> Pescador </td><td> NC9388846 </td></tr><tr><td> Ácido 2-hidroxi-4&#39;-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona </td><td> Sigma </td><td> 410896 </td></tr><tr><td> Meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) </td><td> Life Technologies </td><td> 11054 </td></tr><tr><td> De soro fetal bovino </td><td> Life Technologies </td><td> 10082 </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Life Technologies </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> Mioblastos C2C12 </td><td> ATCC </td><td> CRL-1772 </td></tr><tr><td> MALDI </td><td> Bruker </td><td> N / A </td></tr><tr><td> RUV-9000 </td><td> Bayco </td><td> RUV-9000 </td></tr><tr><td> VersaDoc </td><td> Bio-Rad </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

gradiente de densidade de várias camadas de polimerização (dgmp): uma nova técnica para a criação de multi-compartimento, andaimes customizáveis ​​para engenharia de tecidos

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Matrizes de tecido complexos de cultura, em que os tipos e concentrações de estímulos biológicos (por exemplo, factores de crescimento, inibidores, ou moléculas pequenas) ou a estrutura de matriz (por exemplo, composição, concentração, ou rigidez da matriz) variar ao longo do espaço, de permitir uma vasta gama de investigações sobre a forma como estas variáveis ​​afetam a diferenciação celular, migração e outros fenômenos. O desafio importante na criação de matrizes de camadas é a manutenção da integridade estrutural de interfaces de camada sem difusão dos componentes individuais a partir de cada uma das camadas 1. Metodologias atuais para alcançar este incluem photopatterning 2-3, litografia 4, functionalization5 seqüencial, liofilização 6, microfluídica 7, 8 ou centrifugação, muitos dos quais exigem instrumentação sofisticada e habilidades técnicas. Outros dependem de ligação sequencial de camadas individuais, que podem levar à delaminação das camadas 9 </sup&gt;. DGMP supera estes problemas por meio de um modificador de densidade inerte tal como o iodixanol para criar camadas de diferentes densidades de 10. Uma vez que o modificador de densidade pode ser misturado com o pré-polímero ou qualquer molécula bioactiva, DGMP permite que cada camada de andaime para ser personalizado. Simplesmente variando a concentração do modificador de densidade impede a mistura das camadas adjacentes, enquanto eles permanecem aquosa. Polimerização único passo subsequente dá origem a uma estruturalmente contínuo multicamada de andaime, em que cada camada tem química distinta e propriedades mecânicas. O modificador de densidade pode ser facilmente removido com a lavagem suficiente sem perturbação das camadas individuais ou os seus componentes. Esta técnica é, portanto, bem adequado para a criação de hidrogéis de várias dimensões, formas e materiais. Um protocolo para a fabricação de um polietileno glicol 2D-gel (PEG), em que as camadas alternadas incorporar RGDS-350, está descrito a seguir. Usamos PEG bomo é biocompatível e inerte. RGDS, a adesão de células de péptido 11, é utilizado para demonstrar a restrição espacial de um sinal biológico, e a conjugação de um fluoróforo (Alexa Fluor 350) permite-nos distinguir visualmente as diversas camadas. Este procedimento pode ser adaptado para outros materiais (por exemplo, colagénio, ácido hialurónico, etc) e pode ser estendido para o fabrico de geles de 3D ​​10 com algumas modificações.

MALDI-TOF análise confirma a conjugação do péptido RGDS de acriloil-PEG (Figura 2). Gel de imagem revela alternada RGDS-350 (azul) as camadas após a fotopolimerização (Figura 3A). Como mostrado na Figura 3A, 2D tamanho DGMP gel pode ser variada em função do diâmetro dos moldes de silicone (10 mm, esquerda, 8 mm, para a direita), e, portanto, são facilmente adaptável para utilização em ensaios múltiplos - neste caso, para se ajustar um 48 placas de cultura de células bem (Figura 3B). Epifluorescência e microscopia de contraste de fase de mioblastos C2C12 cultivados sobre um gel DGMP mostra ligação selectiva em RGDS-350-camadas contendo PEG (Figura 4), ​​demonstrando a compartimentalização do peptídeo de adesão celular (RGDS). <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1highres.jpg"/> Figura 1. Molecular Weight análise por MALDI-TOF comparando APEG-SCM de APEG-RGDS obtidos após a conjugação do péptido RGDS. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2highres.jpg"/> Figura 2. Representação esquemática da fabricação DGMP gel. Após os gradientes são em camadas, que pode ser deixado em repouso por períodos de tempo variáveis ​​(t s) para criar interfaces graduados, seguidos por fotopolimerização. Géis estratificadas dGMP pode ser facilmente extraído do molde para uso posterior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50018/50018fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3 a.) 2D géis de multicamadas obtidas após fotopolimerização fotografada usando 350 nm e brancas canais de luz de VersaDoc unidade de documentação de gel. Escala cinza revela camadas alternadas contendo RGDS em branco. B) Inserção de gel DGMP em 48 pratos de cultura de células bem. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Contraste de fase Incorporada e imagem epifluorescência de mioblastos C2C12 cultivados em DGMP géis (barra de escala 50 mm). <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Efeito de iodixanol na superfície do gel. Elasticidade medições de força atômica microscopia de amostras de substratos estáticos PEG reticuladas utilizando métodos previamente estabelecidos com uma força de disparo 2 nN 12. * P &lt;0,05 e ** p &lt;0,01.

Aqui descrevemos uma estratégia única para a criação de biocompatíveis, matrizes em camadas com interfaces contínuas entre camadas distintas para engenharia de tecidos. Tal um andaime poderia proporcionar um ambiente ideal para modular o comportamento personalizável célula por vários estímulos químicos, biológicos ou mecânicos

Gradiente de densidade de várias camadas de polimerização (DGMP): uma nova técnica para a criação de multi-compartimento, Andaimes customizáveis ​​para Engenharia de Tecidos

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

O objetivo geral deste procedimento é criar um andaime de cultura de células em várias camadas. Este vídeo demonstrará como produzir uma matriz de cultura de células 2D, incorporando o peptídeo de adesão RGDS em camadas alternadas para separar regiões de C e duas células C 12. Isso é feito primeiro amarrando o peptídeo RGDS a uma macro acro leal.A combinação de macropeptídeos é então marcada com o corante LOR para permitir a visualização do peptídeo contendo camadas dos géis multicamadas. O segundo passo é formar os moldes cortando-os de uma folha de silicone e imprensando-os entre duas lâminas de vidro logo após o pré-impressão, misturando componentes individuais de cada camada. Soluções de peg di acrl e peg di acrl com PEG RGDS Alexa três 50 são alternativamente colocadas em camadas dentro dos moldes.Os géis são polimerizados por irradiação UV. A etapa final é semear C duas células C 12 em géis multicamadas 2D para examinar como a composição da matriz afeta o crescimento e a fixação das células. Em última análise, a microscopia de campo claro e fluorescência é usada para visualizar o crescimento seletivo de C duas células C 12 nos andaimes.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que é um método simples e econômico para criar matrizes de cultura de células 2D e 3D de várias camadas. Não depende da necessidade de instrumentação cara. Enquanto as interfaces entre as camadas são contíguas e estruturalmente integrais.Não há mistura entre componentes de camadas individuais. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave, como como as células migram e polarizam em resposta a pistas biológicas, químicas e mecânicas padronizadas. Este método pode fornecer uma visão suave sobre a migração e diferenciação celular e pode ser aplicado a outros sistemas, como direcionar o crescimento e a sinaptogênese de células-tronco neuronais.Para iniciar este procedimento, combine o peptídeo RGDS e o éster metílico de succinil carbo de óleo acro em uma proporção molar de um para dois para um em DMSO seco sob Argonne. Em seguida, adicione NN diop, propilmetilamina ou D-I-P-E-A a uma proporção molar de dois para um em relação ao aquilo PEG SCM para ajudar a facilitar a reação, confirme a conjugação da molécula de aquilo PEG RGDS usando espectrometria de massa TOF mofada. Para isso separadamente, adicione um microlitro da solução de reação AQUILO PEG RGDS e um microlitro de ONG não reativoDeixe os dois secarem. Em seguida, prepare uma solução saturada de matriz mofada universal em vórtice THF por um minuto e adicione um microlitro aos mesmos dois pontos. Deixe os dois secarem.Em seguida, carregue as amostras. Realize análises resistentes e mofadas com um laser de 60 hertz a aproximadamente 19% de potência usando os algoritmos SAVIS gole smoothing, top hat, baseline subtraction e OID peak detection. O peso molecular do acro PEG RGDS deve ser deslocado para a direita, correspondendo à mudança na massa devido ao peptídeo ligado covalentemente.O próximo passo é conjugar o Fluor adicionando uma quantidade equimolar de LOR três ácido carboxílico 50 suga em um éster médio em relação ao aquilo PEG SCM dissolvido em um volume mínimo de DMSO à solução de reação aquilo PEG RGDS Sob argônio incubar durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, purifique o pino de óleo acro RGD S3 50 dialisando contra água de corante a quatro graus Celsius usando um de diálise de corte de peso molecular de 3.500 DAU. Continue dialisando por 48 horas usando uma proporção volumétrica de 1001, trocando o dialisado frio pelo menos duas vezes por dia.O produto é ainda purificado por esterilização por filtro através de filtro de seringa de 0,22 mícron. Finalmente, em um ambiente estéril, alíquota do pino de óleo acro purificado estéril RGD S3 50 em tubos de microcentrífuga pré-pesados estéreis. Sele os tubos de microcentrífuga abertos dentro do tubo de respiro estéril.Liofilize as amostras e armazene cada uma selada com filme de parafina a menos 20 graus Celsius. A pré-lavagem é feita em 100% de metanol e seca no forno a 80 graus Celsius até que o líquido evapore. Em seguida, coloque um prato contendo as lâminas de vidro em uma capela e adicione 250 microlitros de camada sigma a cada lâmina.Balance suavemente as lâminas por 30 segundos para revestir toda a superfície. Em seguida, enxágue bem as lâminas revestidas com 100% de metanol, seguido de lavagem e água destilada, mergulhando-as duas vezes por cinco minutos em pelo menos 10 mililitros de água. Depois de enxaguadas, deixe as lâminas secarem ao ar.Prepare espaços de silicone de 0,8 milímetro de espessura aparando uma folha de silicone nas mesmas dimensões das lâminas de vidro. Em seguida, usando punções de biópsia, faça furos de 10 milímetros ou oito milímetros no silicone para segurar os andaimes usando uma lâmina de barbear. Faça canais de cerca de dois milímetros na parte superior do molde para permitir a adição do material do andaime.Em seguida, autoclave os espaços de silicone e as lâminas de vidro tratadas com revestimento sigma para esterilizá-los. Esterilize também materiais adicionais para fundir os géis, como tubos einor e pinças. Em um filtro de capuz de cultura de tecidos, esterilize uma solução estoque de Peg di aquil usando uma seringa estéril de um mililitro e um filtro de 0,2 mícron.Comece formulando soluções de pré-polímero PEG na proporção de 15% peso / volume para cada camada respectiva em tubos de micro recusa âmbar individuais, combinando o acrl 50% PEG D com diferentes quantidades de solução estoque estéril 60% IO DAL PBS e iniciador fotográfico para produzir concentrações finais variáveis de 10% 20% 30% e 40% I oal misture completamente as soluções para preparar a solução pré-polímero 15% PEG marcada com fluorescência, combine 50%PEG di aquil e aquilo PEG RGD S3 50 a uma concentração final de oito milimolares com solução estoque IO Dal PBS e fotoiniciador em tubos Microview âmbar para produzir concentrações de 15%25%e 35%IO IAL misture bem as soluções. Em seguida, monte o molde colocado Depois que o molde estiver montado, molde um gel em camadas adicionando 10 microlitros da solução a 40% primeiro, seguido por 10 microlitros da solução a 35% marcada com fluorescência.Repita as camadas alternadas para obter várias camadas. Em seguida, irradie o molde com luz de 365 nanômetros por três minutos. Usando uma lâmpada portátil UVR 9.000, deixe os hidrogéis polimerizados curarem por cinco minutos.Em seguida, remova os grampos e levante suavemente a corrediça de vidro superior e o molde. O gradiente de densidade estratificado. A polimerização multi-aplicada ou os géis DG MP permanecerão nas lâminas.Usando uma espátula estéril, remova cuidadosamente os géis do molde e coloque-os em um tubo de 50 mililitros contendo DMEM estéril. Lave os géis polimerizados usando uma proporção volumétrica de 1000 para um de DMEM por 48 horas com duas trocas de tampão por dia. Isso removerá qualquer densidade, modificador, fotoiniciador e pré-polímero de reação.Em seguida, armazene os géis DGMP em DMEM suplementado com 1% de penicilina estreptomicina. Para visualizar camadas alternadas, organize o gel DGMP ao longo de uma régua na bandeja de amostra de uma unidade de documentação de gel. Em seguida, exponha e fotografe os géis usando Alexa, três 50 bandas escuras e azuis alternadas no hidrogel DGMP demonstram a formação de camadas discretas de composição química distinta.Para preparar os géis DGMP para cultura de células, insira-os suavemente nos poços de uma placa de cultura de células de 48 poços. Usando um raspador de células estéreis e enxágue três vezes em meio de cultura de células. Em seguida, colha C dois mioblastos C 12 de uma placa de cultura de células de 100 milímetros quando estiverem 60% confluentes.Para fazer isso, enxágue a placa três vezes com PBS pré-aquecido. Em seguida, adicione um mililitro de 0,25% de viagens em EDTA e incube a placa a 37 graus Celsius por dois minutos. Uma vez que as células tenham se desprendido, adicione um mililitro de meio de cultura pré-aquecido e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros para centrifugação.Depois que as células forem peletizadas, Pinte-as em meio de crescimento e conte as células vivas adicionando azul triam e usando um contador de células TC 10. Em seguida, semeie o andaime DG MP com C dois C 12 mioblastos e incube por 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Confirme a ligação de C dois mioblastos C 12 no RGDS contendo camadas de géis DGMP usando epifluorescência e microscopia de contraste de fase.As camadas alternadas de géis DGMP podem conter vários peptídeos, como o RGDS mostrado à direita, que suporta a ligação e o crescimento celular. A camada à esquerda, no entanto, não continha nenhum peptídeo de ligação celular e as células não sobreviveram nessa região. IO diol pode afetar a rigidez do gel.Aqui, o módulo de elasticidade foi medido usando microscopia de força atômica. Um aumento de 60% na rigidez foi observado ao usar 30% IAL nesta formulação de gel, o efeito IAL na rigidez do gel pode variar de acordo com os materiais usados Ao tentar este procedimento, é importante lembrar a sequência das camadas. A camada que contém a maior quantidade de IEX nulo estará na parte inferior, enquanto a camada com a menor quantidade de IEX nulo estará na parte superior.Lembre-se sempre de adicionar o iniciador de fotos no final para evitar a polimerização da luz ambiente. Com nossos colaboradores, estamos adaptando essa técnica para organizar o crescimento de neuritos em 3D. Isso permitirá comparações de células neuroprogenitoras derivadas de indivíduos saudáveis e de pacientes com distúrbios do neurodesenvolvimento.Não se esqueça de que trabalhar com luz ultravioleta pode ser perigoso. Use óculos de proteção UV ao executar a etapa de reticulação.

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