Reação em Cadeia da Polimerase: Protocolo Basic Plus Estratégias de solução de problemas e otimização

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar as etapas envolvidas na reação em cadeia da polimerase ou PCR, que é usada para produzir um amplo suprimento de um segmento específico de DNA a partir de uma pequena quantidade de material de partida. Primeiro, monte os reagentes e materiais a serem usados na reação de PCR e, em seguida, configure a mistura de reação, incluindo os quatro ribonucleotídeos desoxi, o molde de DNA, os primers e a DNA polimerase. Em seguida, programe-se as condições de ciclagem térmica e execute a reação de PCR.

Depois disso. Verifique os resultados para determinar se a reação foi bem-sucedida. Em última análise, uma reação em cadeia da polimerase deve produzir um amplicon específico do tamanho desejado do produto.

Geralmente, os indivíduos novos neste protocolo terão um pouco de dificuldade para configurar os cálculos de cada um dos reagentes variáveis e, às vezes, têm problemas com a pipetagem, os volumes corretos, especialmente com a polimerase que tem glicerol. Comece o experimento com um balde de gelo recém-cheio. Use luvas para evitar contaminar a reação.

Mistura e reagentes. Disponha os componentes de PCR no gelo para descongelar completamente. Estes incluem os primers de molde de DNA, tampão de reação DNA polimerase 10 x com ou sem cloreto de magnésio, desoxinucleotídeos, água estéril e cloreto de magnésio.

O cloreto de magnésio é necessário se estiver usando o tampão sem cloreto de magnésio. Coloque uma placa de 96 poços em um balde de gelo como suporte para os tubos de PCR de paredes finas de 0,2 mililitros. Agora equipe a bancada com tubos e tampas de PCR.

Um suporte para tubos de PCR, um marcador resistente ao etanol e um conjunto de micropipetadores. Sempre crie uma tabela de reagentes detalhando a mistura de reação com água destilada estéril quântica para obter o volume final de 50 microlitros. Por exemplo, usando cinco microlitros de um tampão sem magnésio, um microlitro de NTPs DN de 10 milimolares e um magnésio milimolar otimizado de 4,0 milimolares.

Um microlitro de cada 20 primers micromolares, 0,5 microlitros de um modelo de dois nanogramas por microlitro. E 0,5 microlitros de polimerase exigiriam apenas 33 microlitros de água estéril. Adicione cloreto de magnésio se não estiver presente no tampão 10 x ou se necessário para otimização de PCR.

Prossiga para rotular os tubos de PCR com um marcador resistente ao etanol para cada tubo de reação. Primeiro, adicione as quantidades calculadas de água estéril e, em seguida, adicione 10 x tampão e 10 NTPs de DN milimolar. Para esta reação, estamos realizando uma titulação com cloreto de magnésio.

Como a concentração de magnésio não será constante, o cloreto de magnésio é adicionado aos tubos de PCR individualmente e o volume é normalizado para 10 microlitros com água estéril, de modo que 40 microlitros da mistura master final sejam adicionados a cada tubo de PCR. Para completar a reação de 50 microlitros e cloreto de magnésio, continue a adicionar o molde de DNA e os primers. Finalmente, adicione 0,5 a 2,5 unidades de DNA polimerase por reação de 50 microlitros em um tubo de microfuga de 1,8 mililitro.

Prepare uma solução de mistura principal o suficiente para acomodar os controles, bem como a perda de transferência de pipetas. Defina um micropipetador para cerca de metade do volume total da solução e misture suavemente pipetando. Para cada amostra de teste, a mistura mestre eloquente no tubo de PCR.

Agora, para o controle negativo sem DNA molde, adicione todos os reagentes e use água estéril para compensar o volume de DNA ausente. Em seguida, para o controle positivo, use um conjunto de DNA molde e primers que amplificam um fragmento conhecido nas mesmas condições das amostras experimentais de PCR. Os termocicladores de PCR aquecem e resfriam rapidamente a mistura de reação, permitindo a desnaturação induzida pelo calor do duplex, o ajoelhamento de DNAA de primers nas fitas positivas e negativas do molde de DNA e o alongamento do produto de PCR.

Os tempos de ciclo são baseados no tamanho do modelo e no conteúdo de GC do DNA para a fórmula geral. Comece com uma desnaturação inicial do modelo e, em seguida, inicie 25 a 35 rodadas de um programa de ciclo de temperatura de três etapas. O primeiro passo desses ciclos é desnaturar o molde de DNA.

Em seguida, programe para o ideal, um ajoelhar de primers cerca de cinco graus Celsius abaixo da temperatura aparente de fusão dos primers, seguido pela etapa de alongamento para trazer a polimerase ao molde de DNA e sintetizar o produto de PCR. Agora insira o número de ciclos. Próximo programa.

Uma etapa de alongamento estendida para a conclusão da síntese de amplicons. Por fim, inclua uma etapa de terminação, resfriando a mistura a quatro graus Celsius. Se as condições de PCR padrão não produzirem o amplicon desejado, a otimização da PCR é necessária para obter melhores resultados.

Portanto, se as reações não funcionaram na primeira vez, você deve tentar solucionar o problema da reação. E então, primeiro, você quer ter certeza de que o problema não foi erro humano. E isso pode acontecer se você tiver um erro de pipetagem ou se você, se esqueceu de adicionar um reagente ao teste, um dos tubos de ensaio.

Em seguida, você pode tentar alterar alguns dos rigores da condição para alterar a configuração do termociclador ou alterar a concentração de magnésio é outro método alternativo. Você também pode tentar adicionar alguns aditivos ao reagente para solucionar os problemas. Como alternativa, considere a PCR de início a quente como uma modificação versátil na qual o tempo inicial de desnaturação é aumentado drasticamente.

A eletroforese em gel AROS é então usada para resolver a PCR do gene GAL três do DNA genômico de S seia para determinar a concentração ideal de íons de magnésio para este conjunto de reagentes, observe, Um produto de PCR do tamanho esperado. 2098 pares de bases aparecem começando em uma concentração de magnésio de 2,5 milimolares com uma concentração ideal de quatro milimolares em diferentes amplificação de modelo de DNA do produto de PCR desejado, pois uma banda discreta requer dois magnésio milimolar. Reduzir o rigor da reação a condições de amplificação efetivamente abaixo do ideal produz uma mancha de produtos não específicos.

Além disso, com o rigor geral da redução da reação, uma quantidade menor de íon magnésio é necessária para formar um ícone de amplicon. Assim, otimizar a PCR enquanto está atento às variáveis pode produzir o produto desejado discreto. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar e preparar uma reação em cadeia da polimerase.

O objetivo é entender as variáveis de cada PCR e como elas podem ser manipuladas para criar o amplicon desejado.