Name: Reação em Cadeia da Polimerase: Protocolo Basic Plus Estratégias de solução de problemas e otimização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprenda a configurar e otimizar reações de PCR para amplificação de DNA específico. Este protocolo demonstra estratégias de solução de problemas e ajuste de variáveis para obter amplicons desejados com sucesso.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecimentos especiais a Kris Reddi na UCLA para a criação de reagentes e derramando géis e Erin Sanders na Universidade da Califórnia em busca de inspiração, orientação e apoio e revisão do manuscrito. Gostaria também de agradecer a Giancarlo Costaguta e S. Gregório Payne para o fornecimento do DNA genômico de levedura e primers para amplificar o gene GAL3. Gostaria também de agradecer Shah Bhairav ​​para fotografar o equipamento de laboratório e reagentes utilizados para fazer figuras de 2 a 4. O financiamento para este projeto foi fornecido pelo HHMI (HHMI Grant No. 52006944).

<ol><li>Albert, J., Fenyo, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+sensitive%2C+and+specific+detection+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+clinical+specimens+by+polymerase+chain+reaction+with+nested+primers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simple sensitive, and specific detection of human immunodeficiency virus type 1 in clinical specimens by polymerase chain reaction with nested primers.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 1560-1564 (1990).</li>
<li>Baskaran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+amplification+of+a+mixture+of+deoxyribonucleic+acids+with+varying+GC+content%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Uniform amplification of a mixture of deoxyribonucleic acids with varying GC content.</a> Genome Res. 6, 633-638 (1996).</li>
<li>Blanchard, M. M., Taillon-Miller, P., Nowotny, P., Nowotny, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+buffer+optimization+with+uniform+temperature+regimen+to+facilitate+automation%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">PCR buffer optimization with uniform temperature regimen to facilitate automation.</a> PCR Methods Appl. 2, 234-240 (1993).</li>
<li>Borer, P. N., Dengler, B., Tinoco, I. Jr, Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+ribonucleic+acid+double-stranded+helices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stability of ribonucleic acid double-stranded helices.</a> J. Mol. Biol. 86, 843-853 (1974).</li>
<li>Breslauer, K. J., Frank, R., Blocker, H., Marky, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+DNA+duplex+stability+from+the+base+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Predicting DNA duplex stability from the base sequence.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 3746-3750 (1986).</li>
<li>Chou, Q., Russell, M., Birch, D. E., Raymond, J., Bloch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+pre-PCR+mis-priming+and+primer+dimerization+improves+low-copy-number+amplifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications.</a> Nucleic Acids Res. 20, 1717-1723 (1992).</li>
<li>Coleman, W. B., Tsongalis, G. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aColeman%2C+WB+%22Diagnostics+for+the+clinical+laboration%22">Diagnostics for the clinical laboration</a>. , Humana Press. (2005).</li>
<li>D'Aquila, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+sensitivity+and+specificity+of+PCR+by+pre-amplification+heating%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating.</a> Nucleic Acids Res. 19, 3749(1991).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3, S30-S37 (1993).</li>
<li>Don, R. H., Cox, P. T., Wainwright, B. J., Baker, K., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Touchdown%27+PCR+to+circumvent+spurious+priming+during+gene+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4008(1991).</li>
<li>Erlich, H. A., Gelfand, D., Sninsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the polymerase chain reaction.</a> Science. 252, 1643-1651 (1991).</li>
<li>Frey, U. H., Bachmann, H. S., Peters, J., Siffert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-amplification+of+GC-rich+regions%3A+%27slowdown+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">PCR-amplification of GC-rich regions: 'slowdown PCR.</a> Nat. Protoc. 3, 1312-1317 (2008).</li>
<li>Haqqi, T. M., Sarkar, G., David, C. S., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+amplification+with+PCR+of+a+refractory+segment+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Specific amplification with PCR of a refractory segment of genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 16, 11844(1988).</li>
<li>Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaine+improves+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).</li>
<li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInnis%2C+MA+%22PCR+Protocols%3A+A+guide+to+methods+and+applications%22">PCR Protocols: A guide to methods and applications</a>. , Academic Press, Inc. San Diego. (1990).</li>
<li>King, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+N+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 630, Humana Press. (2010).</li>
<li>Kleppe, K., Ohtsuka, E., Kleppe, R., Molineux, I., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+polynucleotides.+XCVI.+Repair+replications+of+short+synthetic+DNA%27s+as+catalyzed+by+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases.</a> J. Mol. Biol. 56, 341-361 (1971).</li>
<li>Korbie, D. J., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touchdown+PCR+for+increased+specificity+and+sensitivity+in+PCR+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification.</a> Nat. Protoc. 3, 1452-1456 (2008).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+DNA+by+PCR%3A+standard+procedures+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Appendix 3, 1-14 (2001).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The polymerase chain reaction.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Appendix 4, Appendix 4J(2002).</li>
<li>Kreader, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relief+of+amplification+inhibition+in+PCR+with+bovine+serum+albumin+or+T4+gene+32+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).</li>
<li>Kwok, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+immunodeficiency+virus+sequences+by+using+in+vitro+enzymatic+amplification+and+oligomer+cleavage+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of human immunodeficiency virus sequences by using in vitro enzymatic amplification and oligomer cleavage detection.</a> J. Virol. 61, 1690-1694 (1987).</li>
<li>McConlogue, L., Brow, M. A., Innis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-independent+DNA+amplification+by+PCR+using+7-deaza-2%27-deoxyguanosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-independent DNA amplification by PCR using 7-deaza-2'-deoxyguanosine.</a> Nucleic Acids Res. 16, 9869(1988).</li>
<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unusual+origin+of+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Am%22%5BJournal%5D)">The unusual origin of the polymerase chain reaction.</a> Sci. Am. 262, 56-65 (1990).</li>
<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+amplification+for+DNA+analysis+by+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biol.+Clin.+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction.</a> Ann. Biol. Clin. (Paris). 48, 579-582 (1990).</li>
<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymerase+chain+reaction+in+an+anemic+mode%3A+how+to+avoid+cold+oligodeoxyribonuclear+fusion%29%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">The polymerase chain reaction in an anemic mode: how to avoid cold oligodeoxyribonuclear fusion).</a> PCR Methods Appl. 1, 1-4 (1991).</li>
<li>Mullis, K. B., Faloona, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+synthesis+of+DNA+in+vitro+via+a+polymerase-catalyzed+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.</a> Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).</li>
<li>Paabo, S., Gifford, J. A., Wilson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+sequences+from+a+7000-year+old+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain.</a> Nucleic Acids Res. 16, 9775-9787 (1988).</li>
<li>Rees, W. A., Yager, T. D., Korte, J., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaine+can+eliminate+the+base+pair+composition+dependence+of+DNA+melting%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Betaine can eliminate the base pair composition dependence of DNA melting.</a> Biochemistry. 32, 137-144 (1993).</li>
<li>Roux, K. H., Hecker, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+optimization+using+touchdown+and+stepdown+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">One-step optimization using touchdown and stepdown PCR.</a> Methods Mol. Biol. 67, 39-45 (1997).</li>
<li>Rychlik, W., Spencer, W. J., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+annealing+temperature+for+DNA+amplification+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).</li>
<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239, 487-491 (1988).</li>
<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+beta-globin+genomic+sequences+and+restriction+site+analysis+for+diagnosis+of+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230, 1350-1354 (1985).</li>
<li>Sambrook, J. A. R., David, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+JAR+%22Molecular+Cloning+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning A Laboratory Manual</a>. 2, 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Sarkar, G., Kapelner, S., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formamide+can+dramatically+improve+the+specificity+of+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Formamide can dramatically improve the specificity of PCR.</a> Nucleic Acids Res. 18, 7465(1990).</li>
<li>Smit, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+codon+12+mutations+occur+very+frequently+in+pancreatic+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KRAS codon 12 mutations occur very frequently in pancreatic adenocarcinomas.</a> Nucleic Acids Res. 16, 7773-7782 (1988).</li>
<li>Wilson, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+and+facilitation+of+nucleic+acid+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 3741-3751 (1997).</li>
<li>Wu, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWu%2C+R+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 218, Academic Press, Inc. San Diego. (1993).</li>
</ol>

Não tenho nada para revelar.

PCR tornou-se uma ferramenta indispensável no arsenal da ciência biológica. PCR alterou o curso da ciência permitindo biólogos para se obter o poder sobre genomas, e fazer genes híbridos com novas funções, permitindo específico e preciso testes clínicos, ganhando percepções do genoma e diversidade, bem como genes simplesmente de clonagem para a análise bioquímica adicional. Aplicação PCR é limitado apenas pela imaginação do cientista que exerce o seu poder. Há muitos livros e artigos que descrevem novos usos especializados de PCR, e muitos mais serão desenvolvidas durante a próxima geração da ciência biológica. No entanto, independentemente das abordagens previstas, o quadro fundamental continua o mesmo. PCR, em toda a sua grandeza, é uma aplicação in vitro para gerar grandes quantidades de um segmento específico de ADN. Projetando um experimento PCR requer pensamento e paciência. Os resultados mostrados na Figura 3 exemplificam um do ch grandeallenges ao projetar uma estratégia de otimização para a PCR. Isto é, como um parâmetro de PCR é alterado, ele pode ter impacto outro. Como um exemplo, se a PCR inicial foi realizada à temperatura de sub-óptima de recozimento (58 ° C) com um óptimo 2 + Mg concentração de 2,0 mM, então o resultado seria produzir um esfregaço como visto na Figura 3c. Uma tentativa para resolver o esfregaço pode envolver a criação de condições de PCR com reacções contendo 2,0 mM de MgCl2 e ajustando a temperatura de recozimento de 61 ° C. No entanto, como pode ser visto na Figura 3a, isto não produz qualquer produto. Por conseguinte, é aconselhável para titular os reagentes, em vez de adicionar uma concentração para uma reacção única, quando a resolução de resultados falsos. Além disso, os ajustes mais comuns que são necessários para a optimização de um experimento PCR são para alterar a concentração de Mg 2 + e para corrigir as temperaturas de recozimento. No entanto, se essas mudanças não minimizar ou anular os resultados aberrantes, a titulação de additives e / ou alterando os protocolos de ciclismo condição, como descrito nas Tabelas 2-6 pode aliviar o problema. Se tudo mais falhar, redesenhar os primers e tente, tente novamente.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Taq Polymeras </td><td> Sigma </td><td> D4545-25UN </td><td></td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Qiagen </td><td> 201225 </td><td></td></tr><tr><td> 0,2 ml de Parede Fina Tubos PCR tubos </td><td> Bio Rad </td><td> 223-9469 </td><td></td></tr><tr><td> 0,2 ml tampas de tubos de Parede Fina </td><td> Bio Rad </td><td> 223-9472 </td><td></td></tr><tr><td> TE Buffer: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EDTA sal dissódico dihidratado </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma-HCl </td><td> Sigma </td><td> T-3253 </td><td></td></tr><tr><td> Primer Phage personalizado </td><td> Invitrogen </td><td colspan="2"> 25441F_RL6_Contig2_68k TACTGCAACGCGATGTTGCG </td></tr><tr><td> Primer Phage personalizado </td><td> Invitrogen </td><td colspan="2"> 26007R_RL6_ Contig2_68k TCACCATCAATCGTGGCGGT </td></tr><tr><td> Primer fermento personalizado </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td colspan="2"> SacI-Gal3 (-256) ACCTGGAGCTCCTATTT TAACATGTGGATTTCTTGAAAGAATGAAATCG </td></tr><tr><td> Primer fermento personalizado </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td colspan="2"> Gal3 (1848)-SacI CGGATGGAGCTCGCGT GAAGGTAATTTTTTTTTATGTCTCCG </td></tr><tr><td> Termociclador </td><td> Bio Rad </td><td> 170-9703 </td><td> My Cycler </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> ISC BioExpress </td><td> E-3120-500 </td><td></td></tr><tr><td> A electroforese em gel </td><td> Hoeffer Scientific Instruments </td><td> Modelo HE33 </td><td></td></tr><tr><td> 1 Ladder DNA kb </td><td> New England Biolabs </td><td> N3232S </td><td></td></tr><tr><td> Bio Rad Power Pack </td><td> Bio Rad </td><td> 164-5050 </td><td> PowerPac básico </td></tr><tr><td> Gel Doc sistema </td><td> Fotodyne Incorporated </td><td colspan="2"> FOTO / Analista Investigador Workstation FX </td></tr></tbody></table>

reação em cadeia da polimerase: protocolo basic plus estratégias de solução de problemas e otimização

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

Nas ciências biológicas tem havido avanços tecnológicos que elevaram a disciplina em épocas de ouro da descoberta. Por exemplo, o campo da microbiologia foi transformada com o advento de microscópio Anton van Leeuwenhoek, que permitiu que os cientistas visualizar procariotas, pela primeira vez. O desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma dessas inovações que mudaram o curso da ciência molecular com o seu impacto abrangendo subdisciplinas incontáveis ​​na biologia. O processo teórico foi descrito por Keppe e colaboradores em 1971, no entanto, era mais de 14 anos até que o procedimento de PCR completa foi descrito e aplicado experimentalmente por Kary Mullis, enquanto ao Cetus Corporation, em 1985. Automatização e refinamento desta técnica progrediu com a introdução de uma polimerase de ADN termicamente estável a partir do Thermus aquaticus bactéria, consequentemente, o nome da polimerase de DNA Taq. A PCR é um powetécnica de amplificação rful que pode gerar um grande suprimento de um segmento específico de ADN (ie, um fragmento amplificado) a partir de apenas uma pequena quantidade de material de partida (isto é, o modelo de DNA ou sequência alvo). Embora simples e geralmente sem problemas, existem armadilhas que dificultam a reação produzindo resultados falsos. Quando PCR falhar pode levar a muitos produtos não específicos de ADN de tamanhos variados que aparecem como uma escada ou mancha de bandas no gel de agarose. Às vezes produtos não formam em tudo. Outro problema potencial ocorre quando as mutações são intencionalmente introduzido nos amplicons, resultando em uma população heterogénea de produtos de PCR. Falhas de PCR pode se tornar frustrante a menos paciência e resolução de problemas cuidado são utilizados para classificar e resolver o problema (s). Este protocolo descreve os princípios básicos de PCR, fornece uma metodologia que irá resultar em amplificação de sequências de a maioria dos alvos, e apresenta estratégias para optimizar uma reacção. Ao seguir este guia de PCR, students deve ser capaz de: <ul><li> Configure reações e condições ciclos térmicos para um experimento de PCR convencional </li><li> Compreender a função dos componentes de reação diversas e seu efeito global sobre um experimento de PCR </li><li> Projetar e otimizar um experimento de PCR para qualquer modelo de DNA </li><li> Solucionar problemas de experiências fracassadas de PCR </li></ul>

PCR emergiu como uma técnica comum em muitos laboratórios de biologia molecular. Desde aqui está um guia rápido para vários protocolos convencionais de PCR. Porque cada reacção é uma experiência única, as condições óptimas necessárias para gerar um produto variar. Compreender as variáveis ​​em uma reação vai aumentar muito a eficiência de resolução de problemas, aumentando assim a chance de obter o resultado desejado.

Reação em Cadeia da Polimerase: Protocolo Basic Plus Estratégias de solução de problemas e otimização

Nas ciências biológicas, houve avanços tecnológicos que catapultaram a disciplina para eras douradas de descoberta. Por exemplo, o campo de...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar as etapas envolvidas na reação em cadeia da polimerase, ou PCR, que é utilizada para produzir uma quantidade abundante de um segmento específico de DNA a partir de uma pequena quantidade de material inicial. Primeiro, reúna os reagentes e materiais a serem utilizados na reação de PCR, em seguida prepare a mistura de reação, incluindo os quatro desoxirribonucleotídeos, o molde de DNA, os iniciadores e a DNA polimerase. Depois, programe as condições de ciclagem térmica e execute a reação de PCR.Após isso, verifique os resultados para determinar se a reação foi bem-sucedida. Em última análise, uma reação em cadeia da polimerase deve gerar um amplicon específico com o tamanho desejado do produto.Em geral, indivíduos novos neste protocolo terão alguma dificuldade ao configurar os cálculos de cada um dos reagentes variáveis e, às vezes, terão problemas com a pipetagem e os volumes corretos, especialmente com a polimerase, que contém glicerol. Inicie o experimento com um balde de gelo recém-abastecido. Use luvas para evitar contaminar a reação.Mistura e reagentes. Organize os componentes da PCR no gelo para descongelar completamente. Estes incluem o molde de DNA, os iniciadores, a polimerase do DNA, tampão de reação 10 x com ou sem cloreto de magnésio, desoxinucleotídeos, água estéril e cloreto de magnésio.O cloreto de magnésio é necessário se utilizar o tampão sem cloreto de magnésio. Coloque uma placa de 96 poços em um recipiente com gelo como suporte para os tubos PCR de parede fina de 0,2 mililitro. Agora, organize a bancada com tubos PCR e tampas.Um suporte para tubos de PCR, uma caneta resistente ao etanol e um conjunto de micropipetas. Sempre crie uma tabela de reagentes detalhando a mistura da reação com água destilada estéril em quantidade suficiente para obter um volume final de 50 microlitros. Por exemplo, utilizando cinco microlitros de um tampão sem magnésio, um microlitro de NTPs de DNA a 10 milimolares e magnésio otimizado a 4,0 milimolar.Um microlitro de cada iniciador a vinte micromolar, 0,5 microlitros de um molde a dois nanogramas por microlitro e 0,5 microlitros de polimerase exigiriam apenas 33 microlitros de água estéril. Adicione cloreto de magnésio se ele não estiver presente no tampão 10 x ou se necessário para a otimização da PCR.Prossiga para rotular os tubos de PCR com uma caneta resistente ao etanol, colocando um rótulo em cada tubo de reação. Primeiro, adicione as quantidades calculadas de água estéril, em seguida adicione o tampão 10 x e os dNTPs a 10 milimolares. Para esta reação, estamos realizando uma titulação com cloreto de magnésio.Como a concentração de magnésio não será constante, o cloreto de magnésio é adicionado individualmente aos tubos de PCR, e o volume é normalizado para 10 microlitros com água estéril, de modo que 40 microlitros da mistura mestra final sejam adicionados a cada tubo de PCR. Para completar a reação de 50 microlitros com o cloreto de magnésio, continue adicionando o molde de DNA e os iniciadores. Por fim, adicione 0,5 a 2,5 unidades de DNA polimerase por reação de 50 microlitros em um tubo microfuga de 1,8 mililitro.Prepare uma solução de mistura mestra suficiente para acomodar os controles, bem como perdas por transferência com a pipeta. Ajuste uma micropipeta para cerca de metade do volume total da solução e misture suavemente por pipetagem. Para cada amostra de teste, adicione a mistura mestra ao tubo de PCR.Agora, para o controle negativo sem DNA molde, adicione todos os reagentes e use água estéril para compensar o volume de DNA ausente. Em seguida, para o controle positivo, utilize um conjunto de DNA molde e iniciadores que amplifiquem um fragmento conhecido nas mesmas condições dos exemplos experimentais de PCR. Os termocicladores de PCR aquecem e resfriam rapidamente a mistura de reação, permitindo a desnaturação induzida pelo calor de duplex, o emparelhamento dos iniciadores às fitas positiva e negativa do molde de DNA e a alongamento do produto de PCR.Os tempos de ciclagem baseiam-se no tamanho do molde e no teor de GC do DNA para a fórmula geral. Inicie com uma desnaturação inicial do molde, seguida pela realização de 25 a 35 ciclos de um programa de ciclo de temperatura em três etapas. A primeira etapa desses ciclos desnatura o molde de DNA.Em seguida, programe uma temperatura ideal de anelamento das sondas cerca de cinco graus Celsius abaixo da temperatura aparente de fusão das sondas, seguida pela etapa de alongamento para levar a polimerase ao molde de DNA e sintetizar o produto da PCR. Agora, insira o número de ciclos. Próximo programa.Uma etapa prolongada de alongamento para conclusão da síntese dos amplicons. Por fim, inclua uma etapa de terminação, resfriando a mistura até quatro graus Celsius. Se as condições-padrão de PCR não produzirem o amplicon desejado, é necessário otimizar a PCR para obter melhores resultados.Portanto, se as reações não funcionaram da primeira vez, você deve tentar identificar o problema na reação. Primeiramente, é importante garantir que o problema não tenha sido um erro humano. Isso pode ocorrer se houver um erro de pipetagem ou se você se esquecer de adicionar um reagente ao teste, a um dos tubos de ensaio.Em seguida, você pode tentar alterar algumas das stringências da condição, ajustando a configuração do termociclador, ou pode modificar a concentração de magnésio, que é outro método alternativo. Também é possível tentar adicionar alguns aditivos ao reagente para solucionar os problemas. Alternativamente, considere a PCR com início quente como uma modificação versátil, na qual o tempo de desnaturação inicial é aumentado significativamente.A eletroforese em gel AROS é então utilizada para separar o PCR do gene GAL três a partir do DNA genômico de S. seia, a fim de determinar a concentração ótima de íons magnésio para este conjunto de reagentes. Observe que um produto de PCR do tamanho esperado — 2098 pares de bases — aparece a partir de uma concentração de magnésio de 2,5 milimolar, com concentração ótima em 4 milimolar. Em diferentes modelos de DNA, a amplificação do produto de PCR desejado como uma banda distinta requer 2 milimolar de magnésio. A redução da especificidade da reação, levando a condições de amplificação efetivamente subótimas, produz um borramento de produtos inespecíficos.Além disso, com o aumento geral da rigidez da reação, é necessário uma quantidade menor de íon magnésio para formar um ícone de amplicon. Assim, a otimização da PCR, atentando-se às variáveis, pode produzir o produto desejado de forma específica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar e preparar uma reação em cadeia da polimerase.O objetivo é compreender as variáveis de cada PCR e como elas podem ser manipuladas para gerar o amplicon desejado.

polymerase-chain-reaction-basic-protocol-plus-troubleshooting

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós apresentamos um método de recuperação de seqüência de DNA alvo antigo, que usamos para reconstruir o genoma mitocondrial completo de cinco indivíduos Neandertal. Comparação dessas seqüências com os seres humanos hoje sugere que os neandertais tinham um longo prazo o tamanho da população de baixa eficácia.

Captura Primer Extensão: Recuperação Sequence alvejado a partir de Fontes de DNA altamente degradadas

Este vídeo demonstra a reação em cadeia da polimerase gradiente para otimização da temperatura de recozimento dos primers, que define a temperatura de recozimento gradiente ao longo dos poços. O efeito de diferentes temperaturas de recozimento é determinado pelo rendimento de produtos amplificados que ajudam a otimizar a condição de reação.

Reação em cadeia da polimerase gradiente para determinar a temperatura ideal de recozimento

Testes de resistência aos medicamentos para o HIV-1 indivíduos infectados não responderam à terapia anti-retroviral (ART) pode orientar futuras terapias e melhorar os resultados do tratamento. Otimizando individual e populacional resultados de saúde em alta prevalência de HIV, mas contextos de recursos limitados, em última análise exigem genotipagem resistência aos medicamentos disponíveis e acessíveis e métodos de interpretação.

Um método de monitoramento acessível HIV-1 Resistência às Drogas para recursos configurações limitadas

A amplificação rápida dois diferentes 3' extremidades do cDNA (3' corrida) protocolos descrito aqui fazem uso de dois diferentes polimerases de DNA para mapear sequências que incluem um segmento de quadro de leitura aberta (ORF), o códon de parada e o inteiro 3' UTR de uma transcrição de usando o RNA obtidos de linhagens celulares de cancro diferentes.

Adaptação 3' rápida amplificação do CDNA termina para mapear transcritos em câncer

Digital cadeia da polimerase (PCR) é uma ferramenta útil para a detecção de alta sensibilidade de variantes de nucleotídeo único e as variantes números de cópia do DNA. Aqui, demonstramos considerações-chave para variantes raras no genoma humano usando PCR digital com o formato de microplaqueta-em-um-tubo de medição.

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

Clonamos e analisamos genes de repórteres gerando RNAs circulares. Esses genes de repórter são maiores do que construções para analisar emendas lineares e conter elementos Alu. Para investigar os RNAs circulares, os construtos são transfeccionados em células e o RNA resultante é analisado usando RT-PCR após a remoção do RNA linear.

Uso do elemento Alu contendo Minigenes para analisar RNAs circulares

Aqui, apresentamos um protocolo para efetivamente e especificamente esgotar uma proteína de interesse na levedura Saccharomyces cerevisiae usando o sistema β-est Aid.

Ajustando a degradação para conseguir a depleção de proteína específica e eficiente

O estudo descreve um protocolo para a criação de grandes (μg-mg) quantidades de DNA para campanhas de triagem de proteínas a partir de fragmentos de genes sintéticos sem clonagem ou uso de células vivas. O modelo mínimo é digerido e circularizado e, em seguida, amplificado usando amplificação do círculo de rolamento isotérmico. Reações de expressão livre de células poderiam ser realizadas com o produto não purificado.

Métodos rápidos e enzimáticos para amplificação de modelos mínimos e lineares para prototipagem de proteínas usando sistemas livres de células

Partes genéticas bem caracterizadas são necessárias para o projeto de novos circuitos genéticos. Aqui descrevemos um método econômico e de alto rendimento para caracterizar rapidamente as partes genéticas. Nosso método reduz o custo e o tempo combinando lisatos livres de células, DNA linear para evitar a clonagem e manuseio de líquidos acústicos para aumentar o rendimento e reduzir os volumes de reação.

Caracterização Rápida de Partes Genéticas com Sistemas Livres de Células

A reação UGI provou ser uma maneira conveniente de criar rapidamente diversas bibliotecas de compostos. Ela envolve a reação de uma amina, um aldeído, um ácido carboxílico e um isonitrila normalmente em metanol à temperatura ambiente. Neste vídeo, nós utilizamos um slot de 48 MiniBlock Mettler-Toledo equipado com tubos de filtração e um Mettler-Toledo MiniMapper manipulador líquido automatizado foi usada para fornecer os reagentes e solventes. Os parâmetros de interesse foram a concentração, a...

Otimização da Reação UGI Usando Síntese Paralela e manipulação de líquidos Automated

Aprenda a configurar e otimizar reações de PCR para amplificação de DNA específico. Este protocolo demonstra estratégias de solução de problemas e ajuste de variáveis para obter amplicons desejados com sucesso.

Reação em Cadeia da Polimerase: Protocolo Basic Plus Estratégias de solução de problemas e otimização

Explorar mais vídeos