Name: Básico Caenorhabditis elegans Métodos: Sincronização e observação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Aprenda a sincronizar C. elegans no estágio larval L1 usando hipoclorito alcalino para obter populações uniformes. Este protocolo auxilia pesquisadores em biologia do desenvolvimento e neurociência a realizar experimentos controlados com este organismo modelo.

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Os autores gostariam de agradecer MICINN (PTA programa de apoio Montserrat Porta de la Riva), AGAUR (Phd Fellowship para Laura Fontrodona), Instituto de Salud Carlos III (Miguel Servet programa de apoio Julián Cerón), e Marie Curie IRG, ISCIII e IDIBELL para financiamento o laboratório.

1. Protocolo A: Worms cultivo de Branqueamento 11 Grandes populações de C. elegans pode ser obtido através da cultura de los quer em meios líquidos ou em suportes sólidos em placas. Eles são geralmente cultivadas em NGM sólido (meios de crescimento dos nemátodos) e alimentados com E. bactérias coli, que é adicionado para as placas, ou vivos ou mortos (morto por UV 12, pelo calor 13 ou pelo frio 14). O procedimento mais comum usa ao vivo OP50 E. coli, que é defeituoso na síntese de uracilo e não pode overgrow em uma camada de espessura que obscurecer os vermes. <ol><li> Misturar 3 g de NaCl, 17 g de agar e 2,5 g de peptona e adicionar 975 ml de H2O Autoclavar para 50 min. </li><li> Arrefecer a 55 ° C. </li><li> Adicionar 1 ml de 1 M de CaCl2, 1 ml de 5 mg / ml de colesterol em etanol, 1 ml de 1 M MgSO4 e 25 ml de 1 M KPO 4 tampão (todos eles, mas colesterol anteriormente autoclaved). </li><li> Usando procedimentos estéreis dispensar a solução NGM em placas de Petri; encher placas até 2/3 do seu volume. </li><li> Depois de seco, é aconselhável para deixar placas à temperatura ambiente durante 2-3 dias antes da utilização para a detecção de contaminantes. Prepare uma seqüência de OP50 E. coli a partir de um stock de glicerol (OP50 pode ser obtido a partir do Genetics Caenorhabditis Center). </li><li> Escolher uma única colónia e crescer em LB durante a noite a 37 ° C com agitação. </li><li> Permitir que o excesso de humidade para evaporar a partir das placas, removendo a tampa no fluxo laminar e adicionar OP50 para o centro das placas com uma pipeta de Pasteur estéril. </li><li> Permitir que o E. OP50 relvado coli a crescer durante a noite à temperatura ambiente ou a 37 ° C durante 8 horas. </li><li> Adicionar a quantidade desejada de vermes para as placas (se as placas incubadas a 37 ° C deve ser arrefecida à temperatura ambiente antes da utilização). </li></ol> DICAS: <ul><li> O derrame de a mesma quantidade de meios de comunicaçãoNas placas com uma pipeta ou um dispensador de bomba assegura o mesmo volume de agar para as placas e facilita o deslocamento da placa, sem necessidade de reorientar o estereomicroscópio. </li><li> Placas (ambos semeado e unseeded com bactérias) pode ser usado de várias semanas após preparado quando armazenado num recipiente à temperatura ambiente ou a 4 ° C. </li><li> Evitar plaqueamento das bactérias para a borda da placa. Se o relvado estende-se às bordas da placa de os vermes podem rastrear os lados, secar e morrem. </li><li> Worms viver mais tempo se as bactérias inoculadas sobre as placas já estão mortos 15. </li></ul> 2. Protocolo B: O tratamento com solução de hipoclorito Alcalina (&quot;branqueamento&quot;) 11 A técnica de branqueamento é utilizado para sincronizar C. culturas elegans, na primeira etapa larval (L1). O princípio do método reside no facto de que os vermes são sensíveis a lixívia enquanto a casca do ovo protege embryos a partir dele. Após o tratamento com solução de hipoclorito alcalino, os embriões são incubadas em meio líquido sem alimento, o que permite a eclosão, mas impede o desenvolvimento adicional. <ol><li> Permitir vermes a crescer até o estágio adulto. </li><li> Recuperar os adultos fêmeas grávidas em 15 tubos de ml por lavagem as placas com tampão M9. </li><li> Vermes pelotas por centrifugação durante 2 minutos a 400xg (~ 1500 rpm numa centrífuga de mesa padrão) à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante. </li><li> Realizar lavagens 1-3 até que o buffer parece claro de bactérias. </li><li> Adicionar a solução desejada de branqueamento (Tabela I) e agitar durante alguns minutos (a destruição do tecido adulto deve ser monitorizada sob o microscópio de dissecação ea reacção parou quando vestígios de adultos ainda são visíveis, o que leva normalmente entre 3 e 9 minutos, dependendo vários questões, tais como o volume de sedimento verme, mencionado na discussão) (Fig. 3). </li><li> Pare de reacção adicionando M9 Buffer para encher o tubo. </li><li> Rapidamente centrifugar (uma vez que o tratamento pode ainda ser activa) durante 1 minuto a 400 xg e descartar o sobrenadante. </li><li> Lavar pelota mais três vezes, enchendo o tubo com tampão M9. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão M9 ao sedimento, ou colocar os ovos para placas NGM unseeded, e incubar à temperatura desejada com agitação suave. Arejamento adequado deve ser fornecido (Fig. 4). </li></ol> DICAS: <ul><li> Existem diferentes soluções de branqueamento, escolher o que funciona melhor em suas mãos (Tabela 1, fig. 1). </li><li> Ovos já estabelecidas sobre as placas podem ser recuperados por escarificação da superfície do agar com um material macio tal como um pedaço de uma película de raios-X. </li><li> Restos demais de animais adultos podem prejudicar a sincronização, já que constituem uma fonte de alimento para as larvas recém-eclodida. </li><li> As temperaturas mais elevadas acelerar um pouco o desenvolvimento que é inconveniente if qualquer verme sincronização salta porque a diferença de desenvolvimento entre vermes sincronizadas e não sincronizadas será maior a temperaturas mais elevadas. </li><li> Solução de branqueamento deve ser realizada imediatamente antes da sua utilização. Além disso, lixívia perde potência depois de ter sido aberta por um tempo, em parte devido à sua fotossensibilidade. Sugerimos a alíquota de cada frasco novo em odres âmbar pequenas quantidades para evitar tais perdas e minimizar a exposição à luz. </li></ul> 3. Protocolo C: Chapeamento Worm <ol><li> Esperar entre 12 e 24 horas (o tempo para completar o desenvolvimento embrionário depende da temperatura) depois do branqueamento foi realizado e recuperar vermes por centrifugação (2 minutos a 400 xg). </li><li> Elimine o sobrenadante vermes, sementes sobre as placas necessárias e deixe o líquido restante seca. </li><li> Colocar as placas à temperatura requerida. </li></ol> DICAS: <ul><li> Larvas L1 em ​​tampão M9 pode ser mantido a 15 ° C agitando pelo menos durante uma semana wiThout alterações óbvias. </li><li> ter cuidado ao calcular os Worms vai semente porque muitos podem esgotar a comida mais rápido do que o esperado e arruinar a sua experiência. Cerca de 500 L1 pode atingir a idade adulta em uma placa de 55 milímetros, sem ficar sem comida. </li></ul> 4. Protocolo D: C. elegans observação D.1 Nomarski observação Microscopia de contraste de interferência diferencial é uma técnica de microscopia óptica de iluminação utilizada para melhorar o contraste em amostras não coradas transparentes. O Nomarski palavra refere-se ao prisma usado, o nome de seu inventor. Através da observação dos animais vivos, somos capazes de analisar a fisiologia do animal com as alterações apenas derivados de imobilização. Além disso, como não fixador é adicionado, marcadores fluorescentes podem ser observados in vivo. Este facto e à possibilidade de marcadores fluorescentes de fusão para um gene de interesse tornar possível a seguir os processos em which a proteína de estudo podem estar envolvidos. Ao utilizar a técnica descrita no este protocolo, não só vermes vivos pode ser observado, mas também podem ser recuperados e plaqueadas de novo. Preparação Agar pad (imediatamente antes da utilização): <ol><li> Preparar agarose 2% em água e derreter. Manter fundidos a 65 ° C. </li><li> Coloque duas lâminas com um pedaço de fita adesiva sobre eles em ambos os lados de uma corrediça, terceiro limpo. </li><li> Usando uma pipeta de Pasteur lugar uma gota de ágar sobre a superfície limpa. </li><li> Cobrir o agar com outra lâmina limpa colocada no topo das três lâminas perpendicularmente. </li><li> Pressione cuidadosamente para que o gota agar é achatado com a espessura dos espaçadores de fita. </li><li> Uma vez que o agar solidifica, puxe as lâminas gravadas e separar as duas lâminas restantes deslizando um em relação ao outro. </li></ol> Montagem de animais vivos <ol start="7"><li> Coloque uma gota (10 ul) de levamisole 1 mM ou azida de sódio 10-30 mM para tele centro do painel. </li><li> Transferência dos animais para a queda usando uma picareta worm. </li><li> Delicadamente, coloque uma lamela sobre os animais e corrigi-lo em ambos os lados com um pouco de unha polonês ou silicone. </li></ol> DICAS: <ul><li> Manter alíquotas de agarose a 2% a 4 ° C. </li><li> De agarose fundida pode ser mantido a 65 ° C durante pelo menos um dia. </li><li> Nota: Levamisole é um agonista do receptor nicotínico que provoca paralisia muscular espástica 16. </li><li> Seja cauteloso, Azida de sódio é extremamente tóxico! </li></ul> D.2 fixação e coloração Etanol DAPI O protocolo descrito aqui representa uma maneira rápida de tingimento vermes com DAPI, no entanto, devido à dissecação do worm algumas estruturas podem apresentar alguma alteração. Existem vários outros métodos para corrigir vermes anteriores para a coloração DAPI, tais como fixação com solução de Carnoy ou formaldeído que preservam a integridade melhor do verme 17. Fixação etanol (modificado a partir do 18) <ol><li> O local de ~ 10 ul de tampão M9 (ou água) numa lâmina de microscópio. </li><li> Usando um verme Escolha com cuidado transferir 10-25 vermes para a queda. </li><li> Utilizando papel de filtro ou um micro-pipeta remover tanto quanto tampão M9 quanto possível sem a remoção dos vermes ou deixá-los seco. </li><li> Adicionar ~ ul 10 de etanol 90% e deixe secar. </li><li> Repita o passo 4, uma ou duas vezes. </li></ol> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol coloração (DAPI) <ol start="6"><li> Misturar DAPI com os meios de montagem desejada para uma concentração final de 2 ng / uL. </li><li> Uma vez que o etanol se ter evaporado completamente, adicionar 7 uL da DAPI: mistura meios de montagem. </li><li> Coloque uma lamela e corrigi-lo em ambos os lados com um pouco de unha polonês ou silicone. As lâminas estará pronto para ser min observação aproximadamente 5 após a adição de DAPI. </li></ol> DICAS: <ul><li> A montagem media contém glicerol, portanto, uma pequena quantidade é suficiente para cobrir toda a preparação. </li><li> Existe uma grande variedade de comerciais meios de montagem (Fluoromount ou prolongar, por exemplo), a sua qualidade e preço dependem de quanto tempo você deseja armazenar sua amostra. </li><li> Tenha cuidado, DAPI é um mutagênico conhecido que liga fortemente a AT regiões ricas em DNA. </li></ul> Receitas Médio nematóide do Crescimento (NGM) 1,7% (w / v) Agar 50 mM de NaCl 0,25% (w / v) de peptona 1 mM de CaCl2 5 ug / ml Colesterol 25 mM KPO 4 1 mM de MgSO4 Tampão M9 KH 2 PO 4 22mm 42 mM de Na 2 HPO 4 86 mM de NaCl 1 mM de MgSO4 Soluções de branqueamento testado <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td> receita # 1 </td><td> receita # 2 </td><td> receita # 3 </td><td> receita # 4 </td><td> receita # 5 </td></tr><tr><td> água (ml) </td><td> 2,75 </td><td> 3,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> de hidróxido de sódio (ml) </td><td> 1,25 (1M) </td><td> 0,5 (5M) </td><td> 2,5 (1M) </td><td> 2,5 (2M) </td><td> 2,5 (1M) </td></tr><tr><td> hipoclorito de sódio ~~~V 4% (ml) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> total (ml) </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> Tabela I. Diferentes receitas de soluções de branqueamento testado para este artigo. Receitas # 3 e # 4 são 2x, e deve ser adicionado ao mesmo volume de M9. Receitas para # 1, # 2 e # 5 tenham sido previamente relatado 2, 11, 19. As concentrações finais: # 1 de NaOH 0,25 M, NaOCl ~~~V 0,8%<html> , # 2 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%, # 3 NaOH 0.625M, NaOCl ~ 1%, # 4 NaOH 1 M, NaOCl ~ 1,6%, # 5 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%. 5. Os resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. Comparação de cinco diferentes soluções de branqueamento em duas diferentes tempos de incubação. Vermes N2 lavada duas vezes com M9 foram divididos em cinco 15 ml tubos cónicos contendo cada solução de branqueamento. Os tubos foram agitados vigorosamente e 1 ml transferida para um tubo novo com M9 para parar a reacção após o tempo especificado. Após o branqueamento vermes procedimento foram incubadas com 1 ml de M9 a 20 ° C durante 24 horas. Em cada caso, inferior fotografia foi tirada apenas depois do branqueamento, quadro superior 24 horas mais tarde. _upload/4019/4019fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 2 &quot;/&gt; Figura 2. Temperatura da solução de branqueamento afecta a eficácia do tratamento. Volumes iguais de vermes N2 foram branqueadas com a mesma solução de branqueamento quer previamente arrefecida em gelo durante 20 minutos ou mantidas a 25 ° C durante o mesmo tempo. As duas colunas sobre as imagens da apresentação de esquerda apenas após o clareamento. Depois de vermes de tratamento foram incubadas em 15 ml tubos cónicos com 1 ml de M9 a 20 ° C durante 24 horas. Colunas sobre as imagens de exibição direito 24 horas depois. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. A razão de verme pelete: tempo de incubação de hipoclorito alcalino afecta a eficácia do tratamento 50, 100, 250 e 500 uL de verme pelete foram incubadas com 2 ml de solução de branqueamento # 3 para 3 minutos, 6 e 9.. Eclodidos L1, embriões mortos e restos de fragmentos adultos foram quantificados após incubação a 20 ° C durante 2<html> 4 horas em 15 ml tubos cónicos com 1 ml de tampão M9. Cerca de três placas confluentes 55 mm com vermes adultos são necessários para obter uma 100 l verme pelota. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig4.jpg" alt="A Figura 4" /> Figura 4. Arejamento adequado é necessária para a incubação e sobrevivência de C. elegans embriões. Uma pelota 100 uL de vermes N2 foram branqueadas durante 6 minutos e incubou-se em 15 ml tubos cónicos com 1 ml, 5 ou 10, conforme especificado, de M9 a 20 ° C durante 24 horas. A parte superior da figura mostra imagens das culturas após 24 horas, onde as setas indicam os ovos que não chocam. Na parte inferior, existe um gráfico que descreve a quantidade de larvas (cinzento claro) e embriões mortos (cinzento escuro) 48 horas depois do branqueamento com as condições indicadas. tp_upload/4019/4019fig5.jpg &quot;alt =&quot; Figura 5 &quot;/&gt; Figura 5. Ciclo de vida de C. elegans. uma. Comprimento aproximado dos vermes em diferentes fases. Horas necessário para atingir cada fase, dependendo da temperatura (modificado a partir de 20). B. Nomarski (para cima) e DAPI (para baixo) imagens de vermes diferentes nas fases de desenvolvimento indicados. Características mais significativas em cada fase são ampliados L1: seta indica os precursores do desenvolvimento das gónadas somática e da linha germinal precoce L4: seta preta (Nomarski) indica a vulva desenvolvimento; setas brancas (DAPI) indicam os dois braços gonadais Mid-... tarde L4: seta indica a vulva desenvolvimento na fase árvore chamada Natal jovens adultos:. seta preta indica um embrião dentro do útero, seta aponta para a espermateca, seta branca indica um oócito Gravid adulto:. Arrowhead (DAPI) aponta embriões fertilizados. Seta em DAPI imagem indica espermateca. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig6.jpg" alt="A Figura 6" /> Figura 6. Morfologia vulva em L3, L4 e estádios adultos. Na fase L3 apenas lúmen uma pequena onde a vulva é formada pode ser observado. Na L4, essa luz se expande formando o chamado &quot;árvore de Natal&quot;. No adulto a vulva já está fechado. As linhas amarelas indicar a localização da vulva a estes três fases. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig7.jpg" alt="A Figura 7" /> Figura 7. Coloração DAPI em L3, L4 cedo, estágios L4 e Adultos. Na L3, germinal é alongado. Em L4, gônadas braços morfologia U-presente. Na tarde-L4 esperma estágio pode ser observado na parte distal das gônadas. Adultos jovens apresentam oócitos. A linha germinal adulta apresenta oócitos e embriões. As linhas amarelas delimitam linhas germinativas em theletrônicos diferentes estágios definidos. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig8.jpg" alt="A Figura 8" /> Figura 8. C. elegans desenvolvimento aos 15 e 25 ° C. vermes N2 foram branqueadas, incubadas durante a noite em M9 e agitação a 15 ° C, transferidos para placas e cultivadas nos tempos indicados nas temperaturas indicadas.

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Não temos nada a divulgar.

Sincronização de nematóide Várias soluções de branqueamento têm sido descritos. Tentámos cinco receitas diferentes (Tabela I) e, nas nossas mãos, eles não mostraram diferenças significativas na sincronização de populações de vermes (Fig. 1). No entanto, as nossas experiências fez mostram que os parâmetros como a temperatura (Fig. 2), a solução rácio de branqueamento: volume de vermes (Fig. 3) e do volume de M9 com que os embriõ...

básico<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; métodos: sincronização e observação

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

A investigação sobre a biologia molecular e do desenvolvimento de Caenorhabditis elegans nematóides foi iniciada na década de setenta por Sydney Brenner e desde então tem sido amplamente utilizado como um organismo modelo 1. C. elegans possui atributos-chave, tais como a transparência, simplicidade e ciclo de vida curto que o tornaram um sistema experimental para estudos biológicos fundamentais para vários anos 2. Descobertas neste nematóide tem amplas implicações, pois muitos processos celulares e moleculares que o desenvolvimento animal controle evolutivo são 3 conservada. C. elegans ciclo de vida passa por uma fase embrionária e quatro estágios larvais antes de os animais atingirem a idade adulta. Desenvolvimento pode levar de 2 a 4 dias, dependendo da temperatura. Em cada uma das várias fases traços característicos podem ser observadas. O conhecimento da sua linhagem celular completa 4,5, juntamente com o annotat profundaíon de seu genoma transformar este nematóide em um grande modelo em domínios tão diversos como a neurobiologia, 6 de envelhecimento 7,8, biologia das células estaminais 9 e biologia germinal 10. Uma característica adicional que faz com que C. elegans um modelo atraente para trabalhar com a possibilidade de obtenção de populações de vermes sincronizados a uma fase específica através de um protocolo relativamente fácil. A facilidade de manutenção e propagação deste nemátodo adicionado à possibilidade de sincronização proporcionar uma ferramenta poderosa para obter grandes quantidades de vermes, que podem ser utilizados para uma grande variedade de pequenas experiências ou de alto rendimento como telas de RNAi, microarrays, sequenciação maciço, immunoblot ou hibridação in situ, entre outros. Devido à sua transparência, C. elegans estruturas podem ser distinguidos sob o microscópio usando microscopia de contraste de interferência diferencial, também conhecido como Nomarski microscopiar. A utilização de um ligante de ADN fluorescente, DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol), por exemplo, pode levar à identificação e localização específica de células individuais, bem como as estruturas subcelulares / defeitos associados aos mesmos.

A facilidade de manutenção e propagação do nemátodo<em&gt; C. elegans</em&gt; Torná-lo um organismo modelo agradável para trabalhar. A possibilidade de vermes sincronização permite que o trabalho com uma quantidade significativa de sujeitos na mesma fase de desenvolvimento, o que facilita o estudo de um processo particular em muitos animais.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

A pesquisa sobre a biologia molecular e do desenvolvimento do nematódeo Caenorhabditis elegans foi iniciada no início dos anos setenta por Sydney Brenner e tem...

Neste vídeo, vamos mostrar como sincronizar C. elegans no estágio de primeira instar. Este é um método simples, mas muito comum, sendo bastante útil, especialmente se você ainda é iniciante.Se você é um especialista em C, pode encontrar aqui algumas dicas para otimizar este protocolo. A base da sincronização de vermes reside na resistência relativa de larvas e embriões à solução alcalina de hipoclorito em comparação com adultos. Esses vermes adultos, contendo muitos embriões em seu interior, são incubados com uma solução de hipoclorito, de modo que são mortos e apenas os embriões permanecem.A segunda parte da sincronização é alcançada pela ausência de alimento, de modo que, embora os embriões eclodam em momentos diferentes, eles não desenvolvem além do estágio L um. O primeiro passo para iniciar um protocolo de choque é ter vermes no estágio de postura de ovos, com vários ovos espalhados pela placa. Use M nove para recuperar os adultos com o objetivo de colheita.Além disso, os embriões que já migraram para a superfície da placa podem ser removidos com um material macio, como um pedaço de filme de raio X, lavando as bactérias com várias lavagens em M nove. Geralmente, algumas lavagens são suficientes. Após a lavagem dos vermes, é hora de adicionar a solução de branqueamento recém-preparada de acordo com nossas preferências.Controle o tempo de incubação enquanto agita o tubo. Você pode monitorar a emergência dos adultos sob o microscópio estereoscópico. Assim que quase não houver mais cadáveres, interrompa a reação adicionando M nove até que o tubo fique completamente cheio.Para finalizar o protocolo, realize pelo menos três lavagens. Com M nove, os ovos são incubados com agitação contínua durante a noite em tampão M nove, o que permite a eclosão, mas impede o desenvolvimento posterior dos vermes. Embora a sincronização possa ser realizada em qualquer temperatura entre 15 e 25 graus, recomenda-se 15.Como o desenvolvimento é mais lento, como mencionamos durante seu desenvolvimento, elegans passa por quatro estágios larvais antes da fase adulta, cujo tempo depende da temperatura na qual é criado. Embora o C. elegans tolere temperaturas de crescimento que variam de 15 a 25 graus, a taxa de crescimento é maior.A temperatura mais alta aqui, é possível observar como, após 24 horas, os estágios em que os vermes se encontram são diferentes. A 15 e 25 graus, após 48 horas a 25 graus, já observamos embriões. No entanto, precisamos esperar mais de 80 horas para ver embriões na superfície das placas.Com vermes cultivados a 15 graus para obter resultados ideais, diversos aspectos devem ser levados em consideração ao realizar um experimento de blitzing. Também é importante reconhecer os vermes que estão no estágio desejado para a realização do experimento. Assim, mostraremos como distinguir os estágios, seja por tamanho, microscopia de contraste de interferência diferencial ou coloração.Neste gráfico, é possível observar a taxa de crescimento dos vermes de GaN em função da temperatura, como mencionamos, sendo muito mais rápidos a 25 graus. Existe uma correlação entre o tamanho do animal e o desenvolvimento em elementos marinhos. Com o software apropriado, os animais podem ser medidos e posteriormente classificados no estágio de desenvolvimento adequado.De acordo com este gráfico, no entanto, o local é um marcador grosseiro das fases de desenvolvimento. Um estadiamento mais preciso pode ser alcançado pela observação de partes dos mares, anatomia que pode ser utilizada e reconhecida tanto por interferência diferencial, microscopia de contraste de fase, quanto pela coloração DPI. Em nosso laboratório, utilizamos este protocolo para sincronizar vermes para diferentes experimentos como micro ovos em coloração mono, visualização in situ e coloração up is.Além disso, este Protocolo também ajuda a eliminar contaminações. O contraste de interferência diferencial ou a microscopia nomar são utilizados para realçar o contraste. Em amostras transparentes não coradas, os animais são montados vivos sobre uma base de 2% Agros, que pode ser preparado previamente e armazenado a quatro graus quando necessário.Pode ser derretido e mantido a 65 graus. Uma vez que o agros esteja derretido, coloque uma fita adesiva em uma lâmina e posicione-as em ambos os lados de uma terceira lâmina. Cuidadosamente, pegue um pouco do agros e coloque uma gota na lâmina sem fita adesiva.Cubra os ágros com outra lâmina colocada transversalmente. Uma vez que o trajeto esteja sólido, separe as duas lâminas deslizando cuidadosamente uma sobre a outra. A almofada aderirá a uma delas.Adicione um pouco de Amazon na placa para manter os vermes imobilizados. Escolha alguns vermes sob o microscópio estereoscópico e transfira-os para a gota de lele. Evite danificar o trajeto.Retire um lamínula e adicione um pouco de esmalte nas bordas. Coloque cuidadosamente a lamínula sobre esta lâmina, evitando a formação de bolhas. O preparo pode ser observado imediatamente ao microscópio. Uma das características mais simples da anatomia de c Elgan é Alva.Por exemplo, um aava com formato de três de Natal é característico do estágio L quatro. Informações detalhadas sobre a anatomia de c elgan durante o desenvolvimento podem ser obtidas em www.orla.org. A coloração com tapis é um procedimento comum para identificar células individuais.A fixação com o túnel é um método rápido para fixar vermes. Para coloração dappy, adicione primeiro uma gota de tampão M nove à superfície de uma lâmina de microscópio. Colete alguns vermes diretamente da placa e transfira-os para a gota de M nove.Elimine o excesso de meio M9 com uma pipeta ou com um tecido macio. Adicione um túnel aos vermes. Repita o procedimento.Uma vez que a primeira gota esteja seca, adicione um pouco de meio de montagem com API e o excesso antes de levar o preparo ao microscópio. O desenvolvimento do go pode ser facilmente observado em stent quente com api.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, mostramos um método de produção de uma população sincronizada com o desenvolvimento de C. elegans adultos estéreis. O protocolo de exemplo sincroniza vermes para estudar as taxas de consumo de oxigênio em animais vivos.

Sincronização de nematóides: um método para obter populações de vermes em estágios idênticos de desenvolvimento

Para estudar a relação entre homeostase proteica, estresse e envelhecimento, monitoramos as mudanças no dobramento proteico acompanhando a disfunção proteica, a localização da proteína na célula e a estabilidade proteica nos níveis organismo, celular e proteico, usando o metazoário geneticamente tratável Caenorhabditis elegans como sistema modelo.

Usando Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para estudar a homeostase de proteínas em um organismo multicelular

Aqui, caracterizamos as respostas de estresse proteotóxico celular no nematoide C. elegans medindo a ativação de repórteres transcritores fluorescentes e atribuindo sensibilidade ao estresse fisiológico.

Medições de Respostas de Estresse Fisiológico em C. Elegans

Aqui, protocolos padronizados são apresentados para avaliar a indução da resposta ao choque térmico (HSR) em elegans de Caenorhabditis usando RT-qPCR no nível molecular, repórteres fluorescentes no nível celular e a maioridade no nível do organismo.

Métodos padronizados para medir a indução da resposta de choque térmico em elegans caenorhabditis

Para estudar as interações acompanhante-acompanhante e acompanhante-substrato, realizamos telas de interação sintética em elegans caenorhabditis usando interferência de RNA em combinação com mutações leves ou sobre-expressão de acompanhantes e monitorar disfunção proteica específica do tecido no nível do organismo.

Usando elegans caenorhabditis para tela para interações de acompanhantes específicas de tecido

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar e montar embriões de Caenorhabditis elegans , registrando o desenvolvimento sob um microscópio 4D e traçando a linhagem celular.

Microscopia 4D: Desvendando caenorhabditis elegans Desenvolvimento Embrionário usando Microscopia Nomarski

Este estudo apresenta protocolos para duas abordagens semi-automatizadas de análise de atividade locomotor em C. elegans complexo I disease gas-1(fc21) worms, ou seja, ZebraLab (um ensaio de rendimento médio) e WormScan (um ensaio de alto rendimento) e fornecem análise comparativa entre uma ampla gama de métodos de pesquisa para quantificar o comportamento nematoides e função neuromuscular integrada.

Análise comparativa de métodos experimentais para quantificar a atividade animal em Caenorhabditis elegans Modelos de Doença Mitocondrial

Este protocolo descreve uma interrupção de 96 poços de caenorhabditis colonizada individualmente elegans após paralisia fria e branqueamento superficial para remover bactérias externas. A suspensão resultante é emplacada em placas de ágar para permitir quantificação precisa e média de carga bacteriana em um grande número de vermes individuais.

Usando dados de verme único para quantificar a heterogeneidade em Interações elegans-bacterianas de Caenorhabditis

Caenorhabditis elegans servem como um excelente sistema de modelos com métodos robustos e de baixo custo para levantamento da vida saudável, vida útil e resiliência ao estresse.

Pesquisando métodos de baixo custo para medir a expectativa de vida e a saúde em Caenorhabditis elegans

Este é um método comumente usado para a dissecção de gônadas de C. elegans seguida de quebra por congelamento, que produz amostras da linha germinativa para imunofluorescência via coloração de anticorpos ou para coloração DAPI simples para visualizar o DNA. Este protocolo tem sido bem sucedido para estudantes de graduação em um laboratório de pesquisa e em uma experiência de pesquisa de graduação baseada em curso.

C. elegans Dissecção de Gônadas e Congelamento de Fissuras para Imunofluorescência e Coloração DAPI

Este estudo examina o efeito da idade na locomoção em C. elegans medindo o maior expoente de Lyapunov (LLE). À medida que envelhecem, C. elegans mostram um aumento e subsequente declínio no controle motor. Os resultados mostram um pico de LLE em cinco dias, seguido por um declínio à medida que os vermes envelhecem.

Dinâmica de locomoção dependente da idade em Caenorhabditis elegans: uma análise do expoente de Lyapunov

Aprenda a sincronizar C. elegans no estágio larval L1 usando hipoclorito alcalino para obter populações uniformes. Este protocolo auxilia pesquisadores em biologia do desenvolvimento e neurociência a realizar experimentos controlados com este organismo modelo.

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